一种稀有细胞多级分选微流控器件的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供的一种稀有细胞多级分选微流控器件，包括键合封装的流道结构和电极基底；所述流道结构包括螺旋流道、二级流道、下分支流道、上分岔流道、下分岔流道，所述螺旋流道一端为样品入口、另一端通过缩扩结构分别与二级流道、下分支流道连接，所述二级流道分别与上分岔流道和下分岔流道连接，所述上分岔流道和下分支流道与血细胞出口连接，所述下分岔流道与稀有细胞出口连接；所述电极基底包括基底本体和两组电极组；所述电极组位于二级流道底部。该器件成本低、操作简单、易集成微型化，能够实现对稀有癌细胞的高通量、高纯度分选。
【专利说明】一种稀有细胞多级分选微流控器件
【技术领域】
[0001]本实用新型属于分析检测设备领域，涉及一种稀有细胞粒子多级分选微流控器件，特别涉及一种整合微流体惯性效应及介电泳技术的高通量、高纯度稀有细胞粒子多级分选微流控器件。
【背景技术】
[0002]细胞的精确检测在疾病的预防、诊断、治疗及细胞生物学研究等生物医学应用方面具有十分重要的意义。但通常在临床上，研究的对象是一个非齐性总体，其中包含了大量的细胞信息，使得检测其中的稀有细胞将变得十分困难；例如，检测进入循环血液中的稀有癌细胞，其对人体正常血细胞的个数比例约为1:1O9,即在ImL血液中仅有数个稀有癌细胞，因此检测非常困难。
[0003]微流控技术作为一种高效流体或粒子操控的新方法，可实现样品制备、反应、聚焦、分选及检测等功能，是生物医学、分析化学等多学科领域的重要研究内容。目前，采用微流控的细胞分选一般基于单一技术，按其机理可简要概括为以下几类:第一类是基于复杂微结构的操控技术；第二类是基于流体的被动方法，如采用惯性流、挤压流、水力分选、场流分离等操控技术；第三类是采用重力及沉降方法进行分选的操控技术；第四类是采用仿生物学方法的操控技术；第五类是依据水液两相性的分选技术；第六类是借助磁、声、光、电等外场的分选技术。上述各方法虽均已取得了一定的研究成效，但应用于稀有细胞分选仍存在各自的不足:如薄膜分选、挤压流分选、水力分选、场流分选、重力及沉降分选、水液两相性分选、磁分选、光电分选都存在操作通量过低的问题，从而限制其进一步商业应用；而柱状阵列分选、惯性流分选、水力分选、水液两相性分选等方法存在分选纯度不高的问题。此外，上述分选方法还存在一些其他的缺陷，如薄膜分选、声分选易对细胞活性造成损伤；挤压流分选只在两种粒子尺寸相差较大的时候才能取得较好的分选效果；磁、声、光、电分选由于引入了耗能外场而致使设备昂贵、操作复杂。
[0004]为克服单级分选的不足，近年来出现了一些多级分选的研究，这些研究的思路是将一级操作作为二级分选的预处理，以优化二级分选的效果；或是采用二级精分选，对一级粗分选的结果进行进一步提纯。然而，现有多级分选研究仍是基于单一的技术，仅仅是将单一分选技术的简单组合，增加了操作工序及成本，很难同时满足对稀有细胞分选的高通量、高纯度的要求。
实用新型内容
[0005]实用新型目的:为了克服上述缺陷，本实用新型的目的是提供一种整合微流体惯性效应及介电泳技术的高通量、高纯度稀有细胞粒子多级分选微流控器件，实现稀有细胞/粒子的高通量、高纯度分选。
[0006]技术方案:本实用新型提供的一种稀有细胞多级分选微流控器件，包括键合封装的流道结构和电极基底；所述流道结构包括螺旋流道、二级流道、下分支流道、上分岔流道、下分岔流道，所述螺旋流道一端为样品入口、另一端通过缩扩结构分别与二级流道、下分支流道连接，所述二级流道分别与上分岔流道和下分岔流道连接，所述上分岔流道和下分支流道与血细胞出口连接，所述下分岔流道与稀有细胞出口连接；所述电极基底包括基底本体和两组电极组；所述电极组位于二级流道底部。
[0007]作为改进，所述电极组为斜插齿形，呈镜像布置；通过设置两组镜像布置的斜插齿形电极组，前一电极组施加低频负介电泳信号，将所有细胞偏转至靠近流道壁的一侧；后一组施加高频负介电泳信号，将稀有细胞粒子沿着电极方向偏转，而血细胞仍沿着主流动方向移动，从而使稀有细胞粒子和血细胞有效分离。
[0008]作为另一种改进，所述螺旋流道的垂直截面为矩形或外侧高、内侧低的梯形；当螺旋流道的垂直截面为矩形时，其深宽比在I以下，优选0.1-1 ;螺旋流道截面为低深宽比矩形，可以使较大的稀有细胞粒子与较小的血细胞粒子平衡位置相距更远，以利于分离。
[0009]作为另一种改进，所述缩扩结构与螺旋流道连接端垂直截面尺寸比与二级流道、下分支流道连接端垂直截面尺寸小。所述缩扩结构上游缩聚处与螺旋流道联通，下游突扩处形成一较短的直流道，并分成两支，分别将稀有细胞粒子流导入上分支流道即介电泳流道，将血细胞粒子流导入至下分支流道。
[0010]作为另一种改进，所述二级流道通过上分支流道与缩扩结构连接，上分支流道的垂直截面尺寸比下分支流道垂直截面尺寸小；下分支流道即血细胞粒子流分支宽度大于上分支流道即稀有细胞粒子流分支宽度，从而减小上分支流道分选所需处理的流体体积，进而达到降低流速的目的。
[0011]作为另一种改进，所述二级流道的垂直截面为矩形，其深宽比为0.05-0.01 ;上分支流道即介电泳流道截面为超低深宽比矩形，以进一步降低流道中的流速，保证介电泳力在粒子上具有足够的响应时间。
[0012]作为另一种改进，所述流道结构的材质选自聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一种。
[0013]作为另一种改进，所述电极基底由ITO玻璃刻蚀而成，或通过在玻璃或硅材料上溅射并图形化出金属电极的方法制成。
[0014]有益效果:本实用新型提供的稀有细胞多级分选微流控器件成本低、操作简单、易集成微型化，通过集成惯性分选及介电泳分选两级流道，充分利用惯性分选的高通量优势及介电泳分选的高精度优势，克服了现有分选芯片只基于某种单一技术，难以同时实现高通量与高纯度分选的不足，两种方式组合互相配合协同，实现对稀有癌细胞的高通量、高纯度分选。
[0015]具体而言，该器件的一级流道即螺旋流道充分利用惯性技术的高通量优势，通过弯流道中的Dean流和惯性迁移，将稀有癌细胞粒子和血细胞粒子聚焦至不同的平衡位置，并通过缩扩结构分别导入二级流道和血细胞出口，且分选后稀有癌细胞粒子流的样品体积远小于血细胞粒子流的样品体积。通过一级流道的粗分选，可以在高通量的条件下排除大部分血细胞，只使小部分含有稀有癌细胞及残余血细胞的样品进入二级流道，从而减轻介电泳分选的通量压力。二级流道通过铺设在流道底部的两组斜插齿电极，对进入其中的稀有癌细胞及残余血细胞施加负介电泳力，其中前一组电极施加低频信号，使稀有癌细胞及残余血细胞均沿电极方向偏转，在流道壁一侧处排成一条线，以优化分选效果；后一组电极施加高频信号，只使稀有癌细胞沿电极方向偏转而残余血细胞仍沿原方向流动，从而实现两者的精确分离。介电泳分选作为一种主动分选技术，具有精度高的优势。
[0016]该稀有细胞多级分选微流控器件可广泛用于临床诊断、生物学研究、生化分析等领域，尤其适用于体液中稀有细胞的早期检测、细胞学水平上的化疗药物敏感性测试等方面。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本实用新型稀有细胞多级分选微流控器件的结构示意图。
[0018]图2是本实用新型稀有细胞多级分选微流控器件的爆炸图。
[0019]图3是流道结构的结构示意图。
[0020]图4是电极基底的结构示意图。
[0021]图5是螺旋流道惯性分选的原理图。
[0022]图6是突扩结构处细胞粒子分选的原理图。
[0023]图7是二级流道中电极组介电泳分选的原理图。
【具体实施方式】
[0024]下面对本实用新型专利的实施例作详细说明，本实施例在以本实用新型专利技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实用新型专利的保护范围不限于下述的实施例。
[0025]本实施例中流道结构I的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可选用玻璃、环氧树月旨、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、硅和石英等光学性能良好的材料制作。不同材料对应的芯片加工工艺、键合技术可能存在差异，可根据加工条件及应用需求来选择相应材料。本实施例中的流道结构I借助软光刻技术制作，浇铸所用阳模采用SU-8无掩模光刻加工，该技术具有柔性高、制作成本低及加工周期短等优点。也可借助基于铬掩模/打印胶片掩模的光刻技术、硅的湿法/深反应离子刻蚀、超精密机加工、金属电镀及感光电路板的刻蚀加工等技术来制作阳模。
[0026]本实施例中的电极基底2采用无掩膜光刻加工技术，对ITO玻璃进行图形化并化学刻蚀而成，也可通过在玻璃或硅材料基底上沉积金属电极并光刻图形化来制作。上述各种加工方法中，不同技术所能达到的加工精度和横截面形状等特性也不相同，应根据分选对象及实际设备条件进行选择。
[0027]本实施例所述的器件用于血液中稀有癌细胞的高通量、高纯度分选，也可用于其它体液(如尿液、唾液、胸水、腹水、痰等)中稀有细胞的分选或提纯，亦可拓展应用于两种大小不同、导电性不同或介电属性不同的其他粒子分选。
[0028]稀有细胞多级分选微流控器件，见图1和2，包括流道结构I和电极基底2，通过将流道结构I与电极基底2键合封装而成。
[0029]流道结构1，见图2，包括螺旋流道11、二级流道12、下分支流道13、上分岔流道14、下分岔流道15 ;螺旋流道11近端与样品入口 16相连，螺旋流道11远端延伸成平直流道与缩扩结构17近端相连，缩扩结构17远端分成两支，分为二级流道12和下分支流道13，下分支流道13直接与血细胞出口 18相连；二级流道12远端同样分为上分岔流道14及下分岔流道15两支，其中上分岔流道14与血细胞出口 18相连，下分岔流道15与稀有细胞出口 19相连。
[0030]为使细胞粒子能够在螺旋流道11内实现聚焦，螺旋流道11的高度h应满足
0.07〈ap/h〈0.3，其中ap为粒子直径；同时，螺旋流道11的垂直截面形状应设计成低深宽比矩形(深宽比AR=h/w〈l)，以便对经过螺旋流道11的粒子沿流道宽度方向进行分选，尽量减少粒子间相互作用的影响；在其它实施例中，流道截面也可以设计成外侧高、内侧低的梯形。此外，螺旋流道11的流道间间距应大于流道宽度，以避免流道壁过薄而产生变形。缩扩结构17近端两侧流道壁互成120°的角度，而后形成一较宽的平直流道，也就是说，缩扩结构17与螺旋流道11连接端垂直截面尺寸比与二级流道12、下分支流道13连接端垂直截面尺寸小。二级流道12通过上分支流道10与缩扩结构17连接，上分支流道10的垂直截面尺寸比下分支流道13垂直截面尺寸小，以使只有少量的稀有细胞样品流进入二级流道12。二级流道12的的垂直截面为超低深宽比矩形(深宽比AR=h/w为0.01-0.05)，在保证PDMS微结构不坍塌的条件下应使流道尽量宽，以充分降低二级流道12中的样品流速，满足介电泳分选的要求，优化二级分选效果；二级流道12近端与上分支流道10相连处两侧流道壁亦呈对称的120°角，以逐渐放宽流道至所需的宽度。
[0031]电极基底2，见图4，包括基底本体21和刻蚀形成的两组电极组22 ;两组电极组22均位于二级流道12底部。其中，第一电极组23和第二电极组24呈镜像关系，其中第一电极组23包含第一电极25和第二电极26,第二电极组24包含第三电极27和第四电极28。第一电极25由三条上端相连的等宽平行电极构成，第二电极26由三条下端相连的等宽平行电极构成，且第一电极25和第二电极26呈斜插齿状交叉排列，排列后构成第一电极25和第二电极26的六条平行电极等宽、等间隙的均匀排列，电极方向与二级流道12中的样品主流动方向呈15°角。同样，第三电极27由三条上端相连的等宽平行电极构成，第四电极28由三条下端相连的等宽平行电极构成，第三电极27和第四电极28呈斜插齿状交叉排列，排列后构成第三电极27和第四电极28的六条平行电极等宽、等间隙的均匀排列，电极方向与二级流道12中的样品主流动方向呈165°角。在其它实施例中，第一电极25、第二电极26、第三电极27和第四电极28包含的平行电极条数以及平行电极与主流动方向的角度均可按需求重新设计。电极组22的整体高度大于二级流道12的宽度、整体宽度小于二级流道12的长度。此外，第一电极25、第二电极26、第三电极27和第四电极28分别与不同的引出电极相连，采用信号发生器，可通过引出电极对第一电极组23施加较低频负介电泳信号、对第二电极组24施加较高频负介电泳信号。
[0032]该器件的封装过程如下:将流道结构I及电极基底2微结构表面清洗干净后，本实施例利用紫外/臭氧对流道结构I及电极基底2表面进行表面改性处理，实现流道结构I及电极基底2的不可逆键合。其它实施例中也可以用氧等离子体处理等手段进行表面改性来实现流道结构I和电极基底2的不可逆键合。键合后，第一电极组23和第二电极组24将铺设在二级流道12的底端，构成二级介电泳分选芯片。此外，在其他实施例中，亦可在流道结构I和电极基底2的边缘对称分布一些对准标记，对准标记可通过软光刻技术/金属薄膜图形化工艺与流道结构I和电极基底2的微结构一起加工，借助体视显微镜及的对准标记，实现流道结构I与电极基底2在位置上的精确键合。
[0033]待整体器件封装完毕后，在样品入口 16中插入微管连接注射泵等外部流体驱动设备，用于特定流速样品的引入，在血细胞出口 18及稀有细胞出口 19处插入微管用于分选后样品液的收集和导出。
[0034]下面以血液中稀有癌细胞的分选为例阐述该多级分选器件的工作步骤和原理。
[0035]螺旋流道11即一级惯性流道的分选原理，见图5，以特定流速从样品入口 16往流道内注入粒子悬浮液后，螺旋流道11入口部分随机分布有红细胞，白细胞及稀有癌细胞，其中红细胞直径约6-9 μ m,白细胞直径约6-15 μ m,而稀有癌细胞种类不同，大小不同，但一般都比血细胞尺寸大很多，本实施例中以人体乳腺癌细胞MCF-7为例，取其直径为16-24 μ mo在直流道的情况下，由于泊肃叶流(Poiseuille flow)的抛物线形速度剖面,其中的粒子将受到指向壁面的剪切诱导惯性升力Fu的作用朝壁面运动，而当粒子靠近壁面时，因粒子自转而旋转产生的对称尾迹被壁面影响而产生一个指向流道中心线的壁面诱导惯性升力F?，Fls与Fm共同构成了惯性升力Fy致使粒子发生特定惯性迁移。而在弯流道中除了惯性迁移，由于流道中心线附近流体较壁面附近流体具有更高的流速，导致流经流道的流体离心力和径向压力梯度的不平衡，致使流道中心线处的流体向外流动。封闭流道为满足质量守恒，靠近外壁面112处的流体将沿着流道上下底面回流，于是在垂直主流动方向上产生两个旋转方向相反的润，称为Dean流或二次流，由于粒子受到Dean拽力Fdd的作用，Dean流大小与粒子的直径呈正比。粒子在惯性升力F1及Dean拽力Fdd的共同作用下迁移至靠近流道内壁面111的平衡位置，图5中，粒子a所在处即为稳定的平衡位置；粒子d虽也受力平衡，但不稳定，很小的扰动就会使其离开该位置；其余各位置b、C、e、f、g处粒子受力均不平衡。
[0036]突扩结构7处细胞粒子分选的原理，见图6，在螺旋流道11的出口处，稀有癌细胞5因较红细胞3、白细胞4尺寸更大，受到更大的Dean拽力Fdd作用，因而其平衡位置更靠近内壁面111，但由于细胞粒子的柔性及 尺寸的分散性，仍有少量参与血细胞分散在稀有癌细胞5粒子流中。当细胞粒子运动至突扩结构17中时，因壁面诱导惯性升力Fm的变化，所有细胞将向靠近壁面的方向移动至新的平衡位置，且此时稀有癌细胞5的平衡位置与血细胞平衡位置间间距变大，利于分选。在突扩结构17远端，稀有癌细胞5及少量的残余红细胞
3、白细胞4进入上分岔流道，导入至二级流道12中；而绝大部分的红细胞3、白细胞4进入下分支流道13，被直接导入至血细胞出口 18。另外，上分支流道10的宽度远小于下分支流道13宽度的设计，使只有小部分样品进入二级流道12中，从而减小二级流道12的通量压力。
[0037]二级流道12中电极组介电泳分选的原理，见图7，二级流道12与铺设在其底部的第一电极组23和第二电极组24共同构成了二级介电泳分选芯片。通过对第一电极组23和第二电极组24施加特定频率的交流电信号，将在二级流道12中形成非均匀电场，而流经二级流道12的细胞将在非均匀电场作用下诱导产生非对称偶极矩，从而产生介电泳力Fdep。介电泳力Fdep的指向及大小与电场强度、电场频率、电场梯度、粒子及周围介质的介电常数和导电性、粒子的大小等有关，本实施例中，对通过二级流道12的细胞粒子施加负介电泳作用，使其向电场强度弱，即远离电极的方向运动。本实施例中由于二级流道12截面为超低深宽比矩形，有较大的横截面积，且进入二级流道12中的样品体积较小，致使样品在二级流道12中流速极缓，从而细胞粒子有足够的时间响应非均匀电场的驱动。对第一电极组23和第二电极组24施加不同频率的交流电信号，二级流道12中的细胞受到流体拖拽力(Fd)和负向介电泳力(nFDEP)的共同作用，且血细胞和稀有癌细胞5因介电属性及大小不同而受到不同的介电泳作用力，表现出不同的运动特性。在第一电极组23处施加较低频交流电信号，红细胞3、白细胞4、稀有癌细胞5将均受到负介电泳力nFDEP1和流体拖拽力Fdi的作用，并在两者的合力F1的作用下沿着电极的方向移动，并最终迁移至二级流道12的上侧壁面处，近似地排成一条线，以增加第二电极组24的分选精度。在第二电极组24处施加较高频交流电信号，只有稀有癌细胞5受到负介电泳力nFDEP2的作用，并在nFDEP2与流体拖拽力Fd2的合力F2作用下沿电极方向移动，最终迁移至二级流道12的下壁面处，并流入下分岔流道15，最终从稀有细胞出口 19导出；而红细胞3、白细胞4将只在流体拖拽力Fd2的作用下仍沿主流动方向移动，并流入上分岔流道14，最终从血细胞出口 18导出，实现红细胞3、白细胞4与稀有癌细胞5的精确分选。
[0038]本实施例中提出的稀有细胞多级分选器件，集成惯性技术与介电泳技术，可同时满足稀有细胞分选高通量、高精度的分选要求，同时具有成本低、操作简单等优点，可广泛用于临床诊断、生物学研究、生化分析等领域，尤其适用于体液中稀有细胞的早期检测、细胞学水平的化疗药物敏感性测试等方面。
【权利要求】
1.一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:包括键合封装的流道结构(I)和电极基底(2);所述流道结构(I)包括螺旋流道(11)、二级流道(12)、下分支流道(13)、上分岔流道(14)、下分岔流道(15)，所述螺旋流道(11) 一端为样品入口(16)、另一端通过缩扩结构(17)分别与二级流道(12)、下分支流道(13)连接，所述二级流道(12)分别与上分岔流道(14)和下分岔流道(15)连接，所述上分岔流道(14)和下分支流道(15)与血细胞出口(18 )连接，所述下分岔流道(15 )与稀有细胞出口( 19 )连接；所述电极基底(2 )包括基底本体(21)和两组电极组(22);所述电极组(22)位于二级流道(12)底部。
2.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述电极组(22)为斜插齿形,呈镜像布置。
3.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述螺旋流道(11)的垂直截面为矩形或外侧高、内侧低的梯形；当螺旋流道(11)的垂直截面为矩形时，其深宽比在I以下。
4.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述缩扩结构(17)与螺旋流道(11)连接端垂直截面尺寸比与二级流道(12)、下分支流道(13)连接端垂直截面尺寸小。
5.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述二级流道(12)通过上分支流道(10)与缩扩结构(17)连接，上分支流道(10)的垂直截面尺寸比下分支流道(13)垂直截面尺寸小。
6.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述二级流道(12)的垂直截面为矩形，其深宽比为0.05-0.01。
7.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述流道结构(I)的材质选自聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于:所述电极基底(2)由ITO玻璃刻蚀而成，或通过在玻璃或硅材料上溅射并图形化出金属电极的方法制成。
【文档编号】B01L3/00GK203525731SQ201320561583
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】易红, 倪中华, 黄笛, 项楠, 陈科, 唐文来 申请人:东南大学