一种多指标检测的微流控芯片的制作方法

一种多指标检测的微流控芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种多指标检测的微流控芯片。所述微流控芯片包括一底片和与所述底片密封配合的盖片；所述微流控芯片的中心设有一通孔；所述底片上设有一条或多条波浪形的主通道，每条所述主通道的一端均与设于所述底片上的进样孔相连通，另一端均与设于所述底片上的排气孔相连通；所述主通道的波谷远离所述通孔的方向设置，波峰靠近所述通孔的方向设置；所述主通道的任一波谷通过连接管道与一反应池相连通；所述连接管道上设有缓冲池。本发明的微流控芯片可以通过荧光、浊度、显色以仪器检测或肉眼直接观察，可以在反应过程中实时检测，也可以在反应结束后检测。
【专利说明】—种多指标检测的微流控芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多指标检测的微流控芯片，属于微流控芯片领域以及生物检测领域。
【背景技术】
[0002]微流控芯片是当前微全分析系统(Micro Total Analysis Systems, μ-TAS)发展的热点领域，它是以芯片为操作平台，并通过与生物、化学、药物筛选等技术的结合，完成包括试剂加载、分离、反应、检测等在内的整个过程。近年来，随着生物芯片技术的快速发展，微流控芯片在生命科学领域，分析化学和生物医学领域发挥着愈来愈重要的作用。
[0003]为了高效、快速、高通量的检测样品，要求芯片具有多组反应孔及向各反应孔输送样品的有效输送方式。一般微流控芯片会借助电磁场力、离心力等外力作用下将待测样品输送至芯片内部。
[0004]专利文献I (CN 101609088 A)公开了在外部电场的作用下，对带电液滴施加电场力，控制微粒子在微流体管道中向各个分支区域移动的送流装置。但是，在该方法中，需要向芯片引入生成电场的复杂机构和设备；又因为输送液体在电场区域需要先转换成液滴，并以液滴的方式向指定区域送流，大大降低了样品的处理速度。
[0005]专利文献2 (CN 103055973 A)公开了利用驱动样品的电渗泵，将带电不同的待测物质分离的装置。但该方法仅适用于必须带有电荷被测样品，对一般生物样品及不带电荷的样品不起作用。
[0006]专利文献3 (CN 102369443 A)披露了一种离心式输液芯片，即液体从芯片中央的存储部向周围的各个加样孔进行离心配送。该主流路的设计，即山部与谷部同宽的主流路的设计仍未能解决各加样孔配液均匀性的问题；另外谷部比山部过宽的设计，造成加样过程中主流路有气泡产生的问题。此外，通过添加废液室承载过量的溶液，虽在一定程度上实现了各加样孔分配液体体积的一致性，但并不能保证反应过程中液体始终充满加样孔，并且需要在微流体管道内部进行局部表面改性处理，即与加样孔连接的分支流路内表面的亲水处理，与收集剩余溶液的废液室相连的分支流路内表面的疏水处理，增加了芯片制造的复杂性，加工成本及加工难度。
[0007]因此，目前面临的技术性难点在于研发一款在结构与制造上简便的芯片，不仅实现向各加样孔精确配液，而且避免邻近反应池间的交叉污染的问题，从而达到高通量，高灵敏度和高精度的要求。

【发明内容】

[0008]本发明的目的是提供一种多指标检测的微流控芯片，本发明采用离心进样的方式均匀分配待检测样品。本发明可以通过限定主通道截面积的比例实现样品更加均匀的分配；本发明还可以通过缓冲池的设计保障离心分配后反应池内液体全满，同时还可以保障反应池内液体在整个反应期间保持充满，且阻止各反应池内的反应产物向主通道及相邻反应池内扩散。
[0009]本发明所提供的一种多指标检测的微流控芯片，包括一底片和与所述底片密封配合的盖片；所述微流控芯片的中心设有一通孔；
[0010]所述底片上设有一条或多条波浪形的主通道，每条所述主通道的一端均与设于所述底片上的进样孔相连通，另一端均与设于所述底片上的排气孔相连通；
[0011]所述主通道的波谷远离所述通孔的方向设置，波峰靠近所述通孔的方向设置；所述主通道的任一波谷通过连接管道与一反应池相连通；
[0012]所述连接管道上设有缓冲池。
[0013]上述的微流控芯片中，所述缓冲池的容积为所述反应池的容积的0.2?0.8倍，所述缓冲池设于所述连接管道上，位于所述反应池与所述主通道之间。
[0014]上述的微流控芯片中，所述连接管道与所述反应池的连接点位于所述微流控芯片的中心与所述反应池的中心的连线上。
[0015]上述的微流控芯片中，在所述底片上，所述主通道呈圆形分布。
[0016]上述的微流控芯片中，在所述底片上，所述一条或多条所述主通道可以形成一个或多个圆形。
[0017]上述的微流控芯片中，所述反应池的容积为0.1?5μ L ;且在特定所述反应池内预先装载有可与待测样品中某些成分发生特异性反应的物质或材料或是一段核酸序列；
[0018]所述主通道的任一 V形部分的容积为与其相连通的所述反应池的容积的1.2?
1.8 倍。
[0019]上述的微流控芯片中，所述主通道的最窄处的横截面积与最宽处的横截面积的比值为0.2?I ;
[0020]且当所述比值小于I时，所述主通道的波峰处的横截面积比波谷处的横截面积小。
[0021]上述的微流控芯片中，所述微流控芯片包括5?100个所述反应池，所述反应池可以分为一组(通过一条所述主通道相连通)或多组(包括多条所述主通道，且不同组的反应池之间不连通)。
[0022]上述的微流控芯片中，所述底片与所述盖片的厚度均优选为0.05?1mm，如果厚度太薄，则使其容易变形，而且管道深度将受到薄片厚度的影响，使得芯片加载试剂量小；如果薄片太厚，材料的导热效果将受到影响，使得芯片内部受热不够均匀，影响检测结果；
[0023]所述主通道、所述反应池、所述连接管道和所述缓冲池的深度优选为40μπι?800 μ m0
[0024]上述的微流控芯片中，所述底片上的进样孔为圆形，其尺寸恰好可与生物实验中常规使用的标准Tip头匹配，操作人员可以使用标准Tip头直接对准进样孔进样；这种进样孔的设计使得芯片的制造容易实现且方便操作人员使用。
[0025]上述的微流控芯片中，所述通孔的内缘处设有一定位缺口，所述定位缺口在离心进样时起到固定芯片的作用；芯片用仪器检测时，所述定位缺口起到待测反应池定位的作用。
[0026]本发明可采用具有所需粘合强度、能够耐受常规加热温度、对所进行的反应性没有显著不良影响的双面胶将所述底片和所述盖片牢固贴合。[0027]—般情况下，聚合物微流控芯片采用热压、激光焊接等方式将底片与盖片表面受热熔融而贴合。这两种加工方式所用的设备价格昂贵，并且对于本发明所述的需要在底片上预先装载样品的芯片，热压和激光焊接的加工过程会对预先装载样品的生物活性、化学特性等产生不良影响。另外，这两种加工方式可能对微流体管道的形状产生影响，严重时甚至造成管道堵塞或芯片漏液。
[0028]本发明的双面胶需要具有足够的粘合强度且耐受生物分析中各种常用加热条件，防止芯片在受热使用的情况下开胶漏液，造成测试失败或环境污染。
[0029]本发明的双面胶需具有适当的生物相容性，能够很好的保持待测样品和预埋样品的生物活性以及化学特性，对芯片上所进行的反应不会产生显著的不良影响。
[0030]本发明所用双面胶的光学性质需要与所采用的检测手段兼容，举例来说，当采用透过式荧光检测时，要求该双面胶对于反应池内所发荧光具有足够的光学透过性，当采用反射式荧光检测时，要求该双面胶在所检测光学波段的荧光背景要足够低。
[0031]本发明所述芯片采用有粘性的封口膜封口。一般产品通常会使用矿物油或硅油等材料通过二次加样，将初次加入的样品密封在芯片中。本发明采用具一定粘性的封口膜封口，避免了二次加样，减轻了操作人员的负担。
[0032]使用本发明提供的微流控芯片，只要在芯片生产时在不同反应池内预先装载不同的物质就可以在同一设计的芯片上进行核酸扩增反应、生化反应、免疫反应等多种形式的检测，或者利用同一种反应形式检测不同的物质，从而在一种芯片平台上实现多种应用。举例来说，若要在芯片上通过核酸扩增反应检测样品中的特定核酸片段(比如某个突变型基因或病原微生物的基因)，可以在不同反应池中预先装载可与待检样品中不同核酸片段发生特异性反应的引物及辅助成分；若要在芯片上通过生化反应检测样品中的特定物质或成分(比如血糖或甘油三酯)，可以在不同反应池中预先装载可与待检样品中不同物质或成分发生特异性生化反应的物质及辅助成分；若要在芯片上通过免疫反应检测样品中的特定成分(比如某种抗原或抗体)，可以在不同反应池中预先装载可与待检样品中不同物质或成分发生特异性免疫反应的物质及辅助成分。
[0033]本发明的微流控芯片可以通过荧光、浊度、显色以仪器检测或肉眼直接观察，可以在反应过程中实时检测，也可以在反应结束后检测。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为本发明微流控芯片的俯视图。
[0035]图2为本发明微流控芯片的剖面图。
[0036]图3为本发明微流控芯片中未设置缓冲池时的液体离心分配情况。
[0037]图4为本发明微流控芯片中设置缓冲池时的液体的分配情况。
[0038]图5为本发明提供的多份样品检测的微流控芯片的俯视图。
[0039]图6为本发明提供的另一种微流控芯片的俯视图。
[0040]图7为本发明微流控芯片染料进样后和离心后的芯片照片。
[0041]图8为本发明微流控芯片中主管道横截面最窄处与最宽处的比值小于本发明微流控芯片规定范围0.2:1时的进样离心实验照片。
[0042]图9为本发明微流控芯片中进样孔的示意图。[0043]图10为应用本发明微流控芯片测试得到的实时荧光曲线图。
[0044]图中各标记如下:
[0045]I底片、2盖片、3通孔、4主通道、5连接管道、6反应池、7缓冲池、8定位缺口、9进样孔、10排气孔。
【具体实施方式】
[0046]下面结合附图对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[0047]图1为本发明提供的多指标检测的微流控芯片(96孔)的俯视图，图2为本发明微流控芯片的剖面图。本发明微流控芯片一底片I和与该底片I密封配合的盖片2，均采用具有所需粘合强度、能够耐受常规加热温度、对所进行的反应性没有显著不良影响的双面胶牢固贴合。在该微流控芯片的中心设有一通孔3，通孔3的内缘处设有定位缺口 8，该通孔3和定位缺口 8共同起到定位的作用，进而在离心时起到固定和定位作用，仅需要一个离心机即可完成样品离心分配。在底片I上设有一条波浪形的主通道4，该波浪形的主通道4的一端与设于底片I上的进样孔9相连通，另一端与设于所述底片I上的排气孔10相连通，其中进样孔设计成可与生物实验中常规使用的标准规格的塑料Tip头严密匹配的圆形，例如当需要的加样体积在20?200微升之间时，进样孔9的直径可在0.75mm?0.9mm之间。
[0048]如图1所示，该波浪形的主通道4的波谷通过连接管道5与反应池6相连通，且反应池6沿远离通孔3的方向设置，且连接管道5与反应池6的连接中心点位于微流控芯片的中心与反应池6的中心的连线上，以便于旋转该芯片时主通道4内的液体可以在离心力的作用下通过连接管道5进入反应池6中。
[0049]如图1所示，在底片I上，波浪形的主通道4形成2个圆形。
[0050]如图1所示，在连接管道5上设有缓冲池7，本发明对在连接管道5上是否设置缓冲池7的使用效果进行了对比，本发明设置的缓冲池7主要有3个作用:
[0051]一、保证微流控芯片在离心进样时，液体充满反应池。
[0052]当没有设置缓冲池7且每个反应池6的容积与主通道4的V形部分的容积相同时，在离心分配样品时由于V形部分液体分配不能达到绝对平均，造成部分反应池进样不满，如图3 (a)所示,或者部分反应池分配量过多,在主通道4产生液体残留，如图3 (C)所示。由此每个反应池内分配的液体量不一致会造成各反应池内的反应结果不一致，直接影响反应结果的准确性。主通道4残余的液体导致反应池内的反应产物更加容易向相邻反应池内扩散，造成交叉污染。图3 (b)为理想情况下，离心后样品均匀分配示意图。
[0053]当设置有缓冲池7时，使存储在每个反应池对应V形部分的液体离心后填满至缓冲池容积的三分之二，这样可以使离心分配造成的不均匀分配仅体现在缓冲池上，而确保反应池是全满的，如图4所示。
[0054]二、保证反应池在加热过程中也能够保证液体充满反应池。
[0055]如果没有设置缓冲池，假设即使在离心分配时液体均匀分配到每个反应池内，但是如果反应池内发生的反应需要在一定温度下进行时，反应池内的液体受热气化，造成反应池内液体量减少。液体量的减少使反应池内液体浓度发生变化,而且每个反应池内液体减少量也并不一致。反应液浓度的变化以及反应池液体量的减少都会影响反应结果的准确性。[0056]在连接管道上直接设置缓冲池7后，即使有液体量的损耗，缓冲池内的液体也会向反应池补充，使反应池内液体持续保持全满状态。
[0057]三、阻止各反应池产物向相邻反应池扩散而产生交叉污染。
[0058]通过实验观察，当进样液体离心分配到反应池以后，在连接管道会有液膜存在，如果相邻反应池仅通过连接管道相连，那么反应池内的反应物很容易通过液膜扩散至相邻反应池，导致交叉污染。本发明通过在连接管道上直接设置缓冲池成功避免了交叉污染这一问题。根据物质的扩散运动我们知道，物质一般都是从高浓度到低浓度扩散。
[0059]当反应池内扩增产物向外扩散时，先进入到缓冲池内，扩散产物浓度在缓冲池中被大大降低，因此减少了扩散产物再向连接管道扩散的几率，提高了检测结果的准确性。
[0060]如图5所示，为本发明提供的多份样品检测的微流控芯片的俯视图，底片上设有4条波浪形的主通道4，且这4条波浪形的主通道4形成一个圆形，且每条主通道4的一端与进样孔9相连通，另一端与排气孔10相连通。在本发明中，与每条主通道4相连的反应池6内分别预先装载利用同一种反应形式检测的不同物质，例如可以在不同反应池6中预先装载可与待测样品中不同核酸片段发生特异性反应的引物及辅助成分，通过多组样品的进样离心且核酸扩增反应，便可在一张芯片上对多组待测样品中的特定核酸片段进行检测。
[0061]如图6所示，为本发明提供的多指标检测的微流控芯片的另一种实施方式的俯视图，波浪形的主通道4形成一个圆形，且该主通道4的波峰处的横截面积比波谷处的横截面积小。在本发明中，优选主通道4的V形部分的最窄处的横截面积与最宽处的横截面积的比值为0.2?1，经实验验证，若该比值小于0.2，则串联贯通形成的V形主通道内阻力大、发生进样困难的问题，同时由于波谷区域的面积相对波峰面积过宽，进样时容易产生气泡且分配液体不均匀；另外，若该比值大于1，则易导致离心分配时各反应池有配液不均匀的问题。实验验证结果如下:
[0062]如图7所示，为实验组(比值为0.3:1)芯片染料进样后和离心后的芯片照片；图8为对照组(主通道最窄处的横截面积与最宽处的横截面积的比值小于0.2)芯片染料进样后和离心后的芯片照片。
[0063]可以观察到，图7中，在进样过程中无气泡产生且离心后各反应池配液均匀；图8中，对照组进样时、与个别反应池对应的V形主通道内观察到有气泡产生，离心分配时、可以明显观察到液体向各个反应池分配不均匀。
[0064]在本发明的微流控芯片中，加样孔设置在0.05?Imm厚度范围内的底片I上，当加样孔的直径设置在0.75?0.9mm范围时，可以用生物实验中常规使用的标准的200微升Tip头实现直接严密加样，不会造成加样过程中的漏液。如图9所示，枪头尖端的直径尺寸0.75mm,距离尖端Imm处其直径为0.9mm。所以当加样孔直径小于0.75mm时将无法将枪头插入，当直径大于0.9mm时，枪头与加样孔侧壁存在间隙，加样时会有漏液。所以加样孔最优设计尺寸应在0.75-0.9mm之间，若设计尺寸0.75mm, Tip头无法插入至加样孔,加样时易漏液，如图9 (a);若设计尺寸0.9mm时，Tip头需要完全插入进样孔，加样时Tip头端口与芯片低端贴合，易堵塞管道造成进样困难，如图9 (b)。本发明芯片的加样孔设计为直径
0.8mm, Tip头插入后其尖端与芯片低端有一定间隙,如图9 (c),通过大量实验验证,能够方便、无漏液的将移液器内样品准确加入到芯片的主通道4内。
[0065]本发明提供的微流控芯片，可以开发多种应用，进行多种反应，例如:核酸扩增反应、生化反应、免疫反应等。下面以恒温扩增反应为例，说明其使用过程。
[0066]在本发明的芯片平台上，结合公司开发恒温扩增试剂盒以及RTiS0ChipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，可以实现病菌基因的恒温扩增反应，以及病菌检测。其检测原理是采用恒温扩增技术，利用具有链置换功能的聚合酶在恒温(比如65°C)条件下进行反应，利用荧光染料掺入法进行实时荧光检测，扩增阳性的样品会产生类似实时荧光恒温的“S”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测。本发明的特点是将上述恒温扩增方法与微流体芯片技术相结合,可同时对多种核酸靶序列进行高通量并行检测。
[0067]具体流程如下:
[0068]每张芯片上设有24个反应池，并在特定反应池包埋固定一套引物用于一种核酸靶序列的扩增与检测。本芯片24个反应池，设置两个反应池分别包埋阴、阳对照品，其余22个反应池可以包埋22种不同的核酸靶序列，即在该版芯片上可以同时检测22种病菌。
[0069]将待测样品DNA与扩增试剂混合后注入芯片。待检测样品可以是病人的痰液、口腔试子、血液等，使用博奥生物集团有限公司的晶芯旬通用型细菌DNA快速提取试剂盒进行DNA提取。
[0070]加样后进出样口周围若有溶液残留，用吸水纸轻轻擦去，然后取I张封口膜，覆盖于进出样口上。
[0071]加样后的芯片放入RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪内，完成扩增反应。芯片上的各个反应池内同时进行独立的恒温扩增反应，并通过恒温扩增仪器完成实时荧光检测，若检测到某反应池出现“S”形扩增曲线，则该反应池对应的检测指标为阳性，图10为芯片实时荧光检测结果。
【权利要求】
1.一种多指标检测的微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片包括一底片和与所述底片密封配合的盖片；所述微流控芯片的中心设有一通孔； 所述底片上设有一条或多条波浪形的主通道，每条所述主通道的一端均与设于所述底片上的进样孔相连通，另一端均与设于所述底片上的排气孔相连通； 所述主通道的波谷远离所述通孔的方向设置，波峰靠近所述通孔的方向设置；所述主通道的任一波谷通过连接管道与一反应池相连通； 所述连接管道上设有缓冲池。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述缓冲池的容积为所述反应池的容积的0.2?0.8倍。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于:所述连接管道与所述反应池的连接点位于所述微流控芯片的中心与所述反应池的中心的连线上。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的微流控芯片，其特征在于:在所述底片上，所述主通道呈圆形分布。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于:在所述底片上，一条或多条所述主通道形成一个或多个圆形。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片，其特征在于:所述反应池的容积为0.1 ?5 μ L ; 所述主通道的任一 V形部分的容积为与其相连通的所述反应池的容积的1.2?1.8倍。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的微流控芯片，其特征在于:所述主通道的最窄处的横截面积与最宽处的横截面积的比值为0.2?I ; 且当所述比值小于I时，所述主通道的波峰处的横截面积比波谷处的横截面积小。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片包括5?100个所述反应池。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的微流控芯片，其特征在于:所述底片与所述盖片的厚度均为0.05?Imm ； 所述主通道、所述反应池、所述连接管道和所述缓冲池的深度为40 μ m?800 μ m。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的微流控芯片，其特征在于:所述底片上的进样孔为圆形；且所述进样孔的尺寸与Tip头匹配； 所述通孔的内缘处设有一定位缺口。
【文档编号】B01L3/00GK103831140SQ201410082166
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】王磊, 张国豪, 周鑫颖, 辛娟, 张瑶, 林明仙, 黄国亮, 王璨, 邢婉丽, 程京 申请人:博奥生物集团有限公司, 清华大学