用于固相肽合成的反应器和方法

专利名称：用于固相肽合成的反应器和方法
技术领域：
本发明涉及固相肽合成，更具体而言是涉及使用新型固相反应器系统的反应器系统和方法，在所述反应器系统中可进行大规模的固相肽合成，而且产量和产率都比现有的要高。
背景技术：
对本领域技术人员来说，我公司的系统和方法在其他液-固反应方面有非常广泛的应用是显而易见的，该液-固反应涉及在固体底物上的分步合成，例如制备寡核苷酸、寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸、寡糖、蛋白质等。
固相肽合成(SPPS)是Merrifield于1963年研制出来的。其基本步骤已广为人知。SPPS法通常以聚合物凝胶开始，例如与二乙烯苯交联的部分氯化的聚苯乙烯。已被保护的氨基酸的C末端首先例如通过氨基酸的苄酯结合在树脂上。当然也可使用其他结合剂。用经保护的氨基酸从C末端按顺序合成肽。氨基酸上的氨基和所有反应性侧链官能基团都必须用稳定的保护基进行保护，以防止非所希望的副反应发生。保护基团的选择应使氨基的脱保护不干扰侧链的保护基或者C末端和树脂之间的键连。氨基例如可用boc(特丁氧基羰基)或者fmoc(9-氟芴基甲氧基羰基)基团来保护。
肽合成通常通过以下步骤来进行树脂结合肽(用boc保护)的N末端在例如三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液中脱去保护基团。用偶联剂将序列中的下一个氨基酸偶联至树脂结合肽上，所述偶联剂例如是在DCM和二甲基甲酰胺(DMF)溶液中的二环己基碳化二亚胺(DCC)。可使用活化剂例如1-羟基苯并三唑(HOBt)，以提高偶联反应的速率和选择性，并降低外消旋作用。未反应的氨基酸、试剂、和副产物通过洗涤和过滤而从树脂中除去。然后重复洗涤和过滤步骤。接着脱去肽的N末端保护基团，在该链上递加其他的肽，并洗涤和过滤该反应系统。重复上述步骤，直至所有希望的氨基酸都被按所希望的顺序递加至肽链上。然后从肽上除去残留的保护基团，从树脂上解离下肽，并收集肽。
SPPS以前是、现在仍经常是在经摇晃或搅拌的、且其中分散有树脂的烧瓶中进行。为在流体相中悬浮和混合树脂，该系统所需要的液体是几倍于树脂吸收或保持的液体的量。因此，如果树脂保持10ml液体，则将需要50-100ml的液体来分散和悬浮树脂。液体量的增加导致稀释溶液的使用(通常为150mmol氨基酸/每升溶液)以使费用降至最低，这是因为氨基酸是比较贵的。如果使用稀释溶液，则很难得到高浓度的氨基酸，并因而也使氨基酸和生长链之间的化学反应不能快速进行。而且，在经分批稀释来洗涤和过滤(在烧瓶中)树脂时，在有限的分次洗涤中实际上不可能从树脂中除去所有的DCM和TFA。其结果是，肽链与DCM和TFA的接触时间不能精确地控制。
反应器研制中的许多设计问题对肽合成是独特的。在固相肽合成中所用的树脂通常是低交联度的凝胶树脂。这些树脂在某些溶剂中(如DCM)会溶涨，而在另外的溶剂(如甲醇)中却收缩。树脂的体积也会随着肽链长度的增加而增加。另外，这些树脂是非常柔软的，并因而对物理摩擦很敏感。人们期望有适应这些特性的反应器。肽-树脂和合成中所用的溶剂以及反应剂之间的接触时间的长短也是非常重要的。为得到最高的产率，必须是树脂结合的肽完全脱保护，但是所产生的碳阳离子因为可能发生的非所希望的副反应而不一定与肽接触。令人遗憾的是，从树脂浆液悬浮体系中排干溶液所需要的时间随着过滤时所形成的树脂床的深度而增加。因此，树脂结合的肽与碳阳离子的接触时间随着床深度的增加而增加。其结果是，千克规模的反应所需要的过滤时间要比实验室规模的反应所需要的过滤时间长得多，因而随着投料量也增加了由于与碳阳离子的反应所造成的肽被破坏的危险。因此，越大规模的反应器就越需要使过滤时间最短。此问题的几种解决方法可根据反应器设计方式和反应器设计所允许的树脂颗粒的性质来选择。
为进行化学反应，在树脂颗粒内的反应位置处必须有反应剂存在。涉及偶联步骤的反应可通过反应剂(DCC和偶联反应器的原料液相中的中间产物)渗透进树脂的表面和孔至内部反应位置的速率来限制。众所周知，树脂，通常为聚苯乙烯树脂，可有效地成形为多孔球。待形成之肽链中的起始氨基酸结合在树脂基体中的内部位置。随着反应剂到达该反应位置，肽链即开始在这些位置处生长。
反应剂从原料液至树脂内部的反应位置的质量传递速率是与浓度梯度乘以溶质在溶剂中的扩散系数的积成比例的(Fick定律)，但是习惯于根据阻力来考虑质量传递。在非均匀的固-液法中，质量传递的阻力明显存在于两处(1)跨过树脂颗粒表面处的液体滞膜；和(2)树脂颗粒的孔中。增加流体相对于树脂的速度可降低膜阻力。为降低树脂内对质量传递的阻力，树脂颗粒优选较小并为凝胶态(如5-100μ)。使用更凝胶状的树脂可使负载量超过1mmol活性位置(或肽链)/gm树脂，而且在高产率和转化时可接近2-4mmol/gm。使用小的树脂颗粒也有利于更好、更快和更完全地洗涤树脂，这是因为可更容易地使有效基体与洗涤溶剂进行交换。而且，树脂颗粒优选具有小的交联量，以打开其孔。但是，树脂中仍需要一些交联，以使其成形，并给树脂颗粒增加强度。0.2-1.0％之间的交联度的树脂颗粒应是足够的。
在氨基酸是通过二环己基碳化二亚胺(DCC)来活化的合成法中，对扩散至树脂芯的阻力由于形成了二环己基脲(DCU)而被大大地增加，在偶联反应中，DCU基本上不溶于50％DMF之DCM溶液中。在树脂上形成不溶性的DCU壳。DCU的沉积阻碍了反应剂和洗涤液在树脂颗粒表面和芯之间的传递。在非常特别的情况下，人们可能会发现原料液至游离胺的扩散是不可能的，而且在添加DCC之前初始存在于树脂内的物质只有偶联时用的boc-氨基酸。
反应剂向树脂中的扩散还可被肽链本身的形成所阻碍。众所周知，在多孔颗粒中的非均相反应通常相对于颗粒的外表面径向向内增加。可将此合理地应用于固相合成中。颗粒因此有可能包括已反应的肽的生长壳和缩小的未反应芯。如果游离胺和经活化的中间产物之间的反应速率比向树脂孔中的扩散速率高，已反应的肽的壳和可能存在的DCU将从颗粒表面径向向内生长。在树脂颗粒内，该反应发生在缩小的芯的表面上。因此，反应剂为到达树脂颗粒的未反应的芯，必须透过越来越厚的肽和DCU层。
DCU沉淀的一种解决方法是改变反应系统的化学性质。对透过DCU阻碍孔的阻力可通过以下方法来降低或消除在单独的反应器中形成对称的酸酐、o-酰基异脲和HOBt活性酯(即预先活化氨基酸)，然后在引入至进行合成的主反应器前从溶液中过滤DCU。如果使用不同的偶联剂(如DIC)，其在偶联反应中不形成不溶性的产物，也可达到类似的益处。
除降低由不溶性化合物如DCU产生的阻碍作用外，孔扩散限制还可通过使用更小的颗粒来降低。降低质量传递阻力的结果是，较低浓度的反应剂即可达到相同的反应速率。这可明显地减少每摩尔产物所需要的氨基酸、HOBt和DCC的使用量。
扩散并透过颗粒的数字分析见图3和4。反应剂的浓度在颗粒的表面处最高，而颗粒内的反应剂浓度随着时间而增加，这是因为反应剂扩散或透进树脂颗粒。图3和4表明，浓度随时间(τ)的增加速率取决于跨过树脂颗粒表面处的膜的质量传递系数(H)和穿过测量浓度处的颗粒的相对距离Z=(r/R)，其中R是颗粒的总半径(粒径)，而r是从颗粒中心计算的点。因此，r/R=1为在颗粒的表面处，r/R=0则为在颗粒的中心处。图3中的4条曲线分别代表在颗粒表面处没有膜阻力(H=∞)时的特定时间τ时的浓度曲线。
图4有两个与图3类似的曲线图，但是其中对透过颗粒表面处的膜的质量传递阻力增加(即H降低)。比较图4中的两个曲线图(H=1和H=3)，可发现颗粒内的浓度随着颗粒表面处的膜阻力降低(即更高的H)而增加得越快。
图3和4表明，在阻力明显时(在颗粒的表面处和孔中)，颗粒内部的浓度增加缓慢。这指出需要降低内孔阻力和外表面膜阻力，以增加反应剂透入颗粒的质量传递。通过增加液相中反应剂的浓度和降低孔长度(使用较小直径的树脂颗粒)，可增强反应剂至树脂结合的游离胺的质量传递。另外，通过增加原料液相对于树脂颗粒的速度，可降低对透过膜的质量传递的阻力，这是因为球形体的膜系数是流体速度的函数。可同时解决这些扩散问题的反应器设计目前尚未出现。
自从1963年Merrifield开始研究固相肽合成(SPPS)以来，在用于肽合成方面的反应器设计上已进行了许多的革新。最早的反应器是基于摇晃的烧瓶，而以后的反应器设计包括搅拌釜反应器、离心反应器和管状反应器。所有这些反应器都用悬浮或流动于液相中的树脂颗粒来运行。在肽合成中通常使用搅拌釜反应器(STR)，但此等反应器也有某些限制。因为树脂颗粒处于悬浮液中，增加搅拌釜反应器中液体相对于颗粒的速度的机会就非常地受限制。这是因为移动的液体施加在悬浮颗粒上的惯性或粘着力会拖住液体中的颗粒。然而，在树脂颗粒保持固定的填充床反应器中，可非常容易地增加相对于颗粒的流体速度场，但必须迫使液体从树脂床中流过。当然，搅拌釜和填充床反应器中用于从树脂过滤液体的底部玻璃料必须能够耐受过滤所需要的压力差。在加大反应器尺寸时，该玻璃料必须由增强材料制成，以避免机械损坏。另一方面，如果反应器的直径保持不变，由于批料增加，过滤器玻璃料上的树脂深度将增加。树脂深度的增加导致更长的排干和过滤时间、以及树脂结合的肽与反应剂、反应性中间产物及溶剂之间的接触时间。为此，带有增强过滤器的搅拌釜反应器和填充床反应器都不代表大规模(几千克)SPPS法之反应器的最有效类型。
虽然在反应过程中改变粒径已产生一些设计困难，但管状反应器如填充床反应器仍比其他反应器具有某些优点。假设反应器入口与树脂颗粒之间的“死体积”的量最小，填充床反应器可使洗涤操作如同置换操作那样进行，而不是象在STR中的稀释操作。如果液体相对于树脂颗粒的速度较高，管状反应器中的Reynolds数(Re)则非常高。但是，高流速在反应器内产生高压力，而高压力对树脂可能会有损坏作用。当然，因为质量传递系数随着Reynolds数增加而增加，所以管状反应器比搅拌釜、悬浮反应器具有更低的液体膜对质量传递的阻力。
但是使用填充床也有其一系列难题。当用DCM洗涤时，树脂可膨胀至其原始体积的3倍，而当用甲醇洗涤时则缩小至其原始体积的三分之一。这在树脂床的总体积上产生9倍的变化。非常难以实现死体积的消除或最小化。填充床的高度远远大于其直径，其明显的壁表面积将阻碍树脂床的膨胀和收缩。在树脂床膨胀时，其紧包在容器壁上，并降低树脂颗粒之间的空体积。因此在所需要的时间内需要高压来将洗涤液从树脂床中冲下。此高压可损坏树脂颗粒并产生细小的颗粒，堵塞过滤器，以及有可能损坏或弄裂过滤器玻璃料。如果不使用高压，从树脂床中通过的流速则会太慢，使肽的反应时间过长，并发生副反应。一些氨基酸或肽偶联步骤对反应时间非常敏感。例如精氨酸可与其自身反应形成环状结构，而不是偶联至肽链上。因此接触时间是一个非常重要的因素。
已进行了许多努力来设计出可克服树脂所产生之限制的管状反应器。这些现有技术包括(1)忽略树脂溶涨问题。Verlunder等人的第4,192,798号美国专利公开了一些方法，其中反应器压降至少为200psi，并最高至10000psi或更高。他们声称达到了定量产率，而且在其他反应器中需进行几小时的反应在其反应器中仅需几分钟即可完成。该类型反应器的问题包括树脂的降解，出口玻璃料的阻塞，在大规模时保持整个柱的均匀轴向流量，由于死体积造成的洗涤无效，以及柱和高压泵的成本。该类型的反应器基本上是工业规模的HPLC。
(2)允许柱的轴膨胀。Bam等人，WO88/909010.6、SU4117080研制出一种死体积为零的反应器，其中，反应器的一端允许树脂漂浮。在反应器的顶部活塞上加一个小的砝码，以在反应器的浮头上施加一个恒定的力。其结果是，柱在低压降下运行，以避免沸腾的溶剂溢出顶部，使其对出口玻璃料的阻塞非常敏感。床中或玻璃料内的DCU累积可增加压降，并产生安全和环境后果。另外，低的压降限制需要低的液体速度，这导致低的Reynolds数和可能的不好的液体流量分布。低流速还导致反应剂和洗涤液的接触时间延长。
(3)使用刚性聚合物承载的凝胶。Atherton等人，JCS ChemicalCommunications，第1151页(1981)，研制出一种刚性聚合物，其中有可包含凝胶的大孔。该凝胶可溶涨和收缩，但是刚性聚合物颗粒的体积保持恒定。其结果是可得到高液体流速、低压降、和恒定的树脂体积。但是，用此等类型的树脂非常有可能发生质量传递的下降，这是因为反应剂的扩散通路在添加膜和孔扩散过载体后会增加。另外，这些类型的树脂很贵。
(4)允许死体积。Lapluye和Poisson的PCT公开WO92/115867研制出一种带有玻璃料末端的活塞型反应器。在该类型的反应器中，树脂放置在一个中空活塞中，该活塞在充满溶剂和反应剂的较大圆筒中上下循环。该类型的反应器基本上与摇动器和流化床反应器类似，而且活塞反应器的混合移动可补偿树脂和溶剂的密度差。看起来其洗涤效率应与STR相同或略高一些，而且流体相体积也更小。但是，相对于树脂的质量，所用溶剂的体积可能要比典型的管状反应器大得多。Reynolds数可能相当低，而且机械尺寸上很难增大。另外，活塞在液体中移动可产生“粘性消耗”作用，该作用则可产生热，因此需要一些额外的冷却装置。
从这点来看，尚未设计出没有成本、安全或效率方面限制的管状反应器。
还研制出基于转筒设计的反应器。转筒或离心反应器可增加相对于树脂颗粒的液体速度。Birr的第2,017,351号德国专利公开了“洗衣机”式反应器，其中在多孔筒中首先装入树脂，然后在中等速度下旋转，并同时浸没在液体中。离心力使树脂颗粒在筒壁内侧上形成一个床，并在该树脂床中使流体以中等速度循环流动。该筒如树脂床一样发生溢流(即充满液体)。液体浴施加在筒上的阻力在驱动马达上形成高扭矩，并导致热的产生。为此原因，Birr反应器的转速相对较低，而且流体相对固体的速度也受到限制。转速上的限制几乎肯定产生不均匀的树脂床，即顶部浅，而底部深。循环的液体会沿着最小阻力的路径流动，而这将在树脂床较浅的部分中“短路”通过。其结果是，富反应剂的液体和树脂的接触在整个反应器中不一致。另外，液体相对树脂的低速度将导致较低的透过颗粒周围表膜的质量传递。最后，浸没转筒所需的溶剂体积与浸泡树脂所需的体积相比要大得多。这相对于树脂加料还需要大量的反应剂。该大的体积导致低浓度溶液的使用，其后果是反应速率下降，而反应时间延长。因此，需要更大量的氨基酸来保持氨基酸的浓度，以使反应速率能够被人们所接受。
另一种基于溢流“中空转子”的离心反应器是由Anderson和Anderson研制的，见第5,186,824号美国专利。在Anderson等人的反应器中的液体流动途径是轴向的，而不是径向的，而且液体流动场在几何形状上是不规则的。引入液体的点取决于与最近新加入的液体的密度有关的液体的密度。而且几乎没有任何空间让树脂膨胀。膨胀和收缩的结果是，树脂与液体的接触时间不均匀。从转子中完全且均匀地除去液体是非常难以实现的。
发明公开本发明的目的是提供一种进行SPPS的方法，该方法与目前现有的方法相比具有更高的产量和更高的产率。
本发明的再一个目的是提供一种此类方法，其中肽链与各种试剂的接触时间可被更精确地控制。
本发明的再一个目的是提供一种此类方法，其中可增加反应速率。
本发明的再一个目的是提供一种此类方法，其中可使用比现有方法更高浓度的氨基酸，但不增加氨基酸的使用量(和使用更高浓度但少量的氨基酸)。
本发明的另一个目的是提供一种用于上述方法的反应器。
本发明的再一个目的是提供一种此类反应器，其中增加了液体通过固相的质量传递。
本发明的再一个目的是提供一种此类反应器，其不阻碍树脂的溶涨或收缩，而且不导致树脂摩擦。
本发明的再一个目的是提供一种此类反应器，其中树脂床的厚度基本上是均匀的，使得流体在树脂床中的流动是均匀的。
本发明的再一个目的是提供一种此类反应器，其可降低溶剂废料。
本发明的再一个目的是提供一种此类反应器，其可通过离心力从树脂中“挤出”溶剂，由此取消用醇来化学收缩树脂颗粒的步骤，因为化学收缩树脂可导致增长肽的聚集，并损坏树脂。
本发明的又一个目的是可更广泛地选择具有不同粒径和交联性质的树脂，使它们更有利于肽的合成。
根据以下附图和详细描述，以上目的和其他目的对于本领域普通技术人员将变得更为明显。
广而言之，本发明提供一种可实现上述目的的反应器系统和运行该系统的方法。所述反应器系统包括一个反应器，该反应器具有一个外壳和一个安装在该外壳内的转筒。该转筒具有多孔的侧壁，在合成过程中树脂块形成在该侧壁上。在筒壁的内表面上装有过滤布或筛网，而树脂块形成在该过滤布上。该系统还包括溶液供料罐或容器/贮液罐，该容器/贮液罐接收待引入之反应器中的溶液。溶液供料罐包括一个入口和出口。该溶液供料罐和反应器相互连接，以限定溶液在其中循环的回路或环路。该反应器系统运行时反应器转筒并不浸没在溶液中。因此，该反应器从不会溢流溶液，而且所有的溶液都从树脂块中通过。
该系统包括清除系统，所述清除系统具有废物收集器和在相互连接反应器和供料罐的管线中的阀门。开启阀门可从系统中清除第一溶液，并在引入第二溶液前将其导向废物收集器。该清除系统包括第一阀门和第二阀门，第所述一阀门在相互连接供料罐出口和反应器入口的管线中，而所述第二阀门在相互连接反应器出口和供料罐入口的管线中。在第一溶液的循环时间完成后和第二溶液引入至供料罐之前，第一阀门开启，将第一溶液导向废物收集器。在第二溶液循环开始时开启第二阀门，在较短的时间内将循环溶液导向废物收集器，以防止任何可能残留在树脂床中的第一溶液进入此时包含第二溶液的供料罐中。
优选的是，该反应器系统还包括配料罐，在该罐中制备溶液(即预先活化氨基酸溶液，制备树脂浆液等)。配料罐与反应器和溶液供料罐流体相通。阀门是可操作的，以选择性地将配料罐中的物料导向溶液供料罐和反应器中。开启配料罐的阀门，将树脂浆液直接导向反应器，并将氨基酸溶液、洗涤液等导向供料罐。过滤器位于配料罐和供料罐之间，预先活化的氨基酸溶液从其中通过。提供过滤器是为了过滤出活化反应中产生的不溶性副产物(如DCU)。设置过滤器旁路，使得洗涤液、脱保护剂等不必由过滤器中通过。
运行该系统的方法包括(a)以所希望的转速旋转转筒，并将经活化的树脂的浆液供入反应器转筒中，以在转筒的多孔壁上形成厚度基本上均匀的块(例如约2cm-5cm厚)。树脂优选包含结合在树脂上的第一氨基酸溶液或其衍生物。如果第一氨基酸没有结合在树脂上，则现在结合于树脂上。(b)在旋转的转筒中供入脱保护溶液，以使树脂结合的氨基酸的N末端脱保护。(c)在旋转的转筒中供入洗涤溶液，以从树脂块上洗涤脱保护溶液。以及(d)在旋转的转筒中供入待递加至肽链上的下一个氨基酸的氨基酸溶液和偶联溶液，以在肽链上递加下一个氨基酸。重复步骤(b)-(d)，直至完成肽链。
将溶液(即脱保护溶液、洗涤溶液、氨基酸溶液和偶联剂溶液)加入至旋转的转筒中的速度应使供入的溶液不在外壳中累积至超过转筒底部，这样所有的溶液都不在围绕转筒的外壳中累积。因此，在肽合成的每个阶段中转筒都不处在溢流状态中。所用的树脂优选是直径小于100μ、交联度为0.2-1.5％的聚苯乙烯颗粒。颗粒中小的粒径和低的交联度有利于从颗粒中通过的质量传递，并因而使反应速率尽可能地高。较大的树脂颗粒也可用于本发明系统中，但将产生更的大的质量传递阻力。
为使转筒在非溢流状态中运转，大多数的溶液都保存在外贮液罐中，然后将溶液泵入反应器中，并从树脂块中通过，最后再返回至贮液罐中。从反应器树脂床中循环溶液至预定长的时间。这可使物质接触至所需要的时间。
每步之间(如在引入下一个或第二溶液前)，排出先前或第一溶液，并从系统中清除，以防止第一溶液与肽的接触时间超过所希望的值。排液步骤包括在溶液循环停止后，继续旋转转筒以确保几乎所有的自由排出的第一溶液都被离心力从树脂块中挤出，并返回至供料罐中。清除步骤涉及开启第一阀门，以将贮液罐中的溶液导向废物收集器或回收器中。
在第二循环开始时仍有少量的第一溶液可能残留在树脂中。在将第二溶液引入至系统中时，在第二溶液的循环开始时将第二阀门开向废物收集器较短的时间。任何残留在树脂块中的第一溶液都用第二溶液从树脂块中冲出或洗掉。在进行清除以从系统中除去残留的第一溶液时，将第二阀门开向废物收集器。
优选的是，在将氨基酸溶液引入至系统中前，预先活化氨基酸，并从氨基酸溶液中过滤除去不溶性的由活化步骤产生的副产物。
附图简述

图1是用于本发明中的设备的示意图。
图2是本发明所用反应器的放大示意图。
图3是说明液膜中没有质量传递阻力时在4个时间点上boc-氨基酸的浓度与从颗粒中心的距离之间的函数关系的图。
图4包括两个图，这两个图说明对质量传递的高液膜阻力和低液膜阻力时在4个时间点上boc-氨基酸的浓度与从树脂颗粒中心的距离(以Z表示)之间的函数关系图5是说明由树脂中通过的计算流量与穿过树脂床后的压降的关系的图。
实施本发明的最佳方式图1示意性地表明了本发明的设备。系统1包括配料罐3，该配料罐装有搅拌器用以溶解氨基酸。优选使用机械搅拌器，但也可使用其他类型的搅拌器。在合成中所用的溶剂和试剂顺序加入至该罐中，然后混合，并任选地用内置线圈(示出)或用于加热或冷却的外部夹套调节至所需要的操作温度。配料罐3优选地还可用于预先活化氨基酸。管线4中的泵P1将反应剂从配料罐3输送至三向阀V1，以通过管线6将树脂浆液、氨基酸溶液或溶剂输送至容器/贮液罐5，或者通过管线8输送至反应器7。如果预先活化的氨基酸被输送至容器/贮液罐5中，氨基酸则由过滤器F1中通过，该过滤器可有效地从预先活化的氨基酸溶液中除去不溶性的副产物如DCU。经过滤的预先活化的氨基酸然后经过管线9被输送至容器/贮液罐5。如上所述，DCU是活化将递加至肽链上的下一个氨基酸时产生的副产物，它可堵塞树脂颗粒以及系统中的设备如喷雾器喷嘴和泵。使预先活化的氨基酸溶液由过滤器F中通过可在将氨基酸溶液引入反应器7之前除去DCU，因此这是优选的。
管线11连接容器/贮液罐5的出口和反应器7的入口。优选地，管线11中装设过滤器F2、计量泵P2和热交换器H1。在泵P2的相对两侧装设两个阀门V2和V3，以使试剂被导向“废物收集器”或“回收器”。优选地，阀V2放置在过滤器F2的上游。
最后，反应器7的出口通过管线13与容器/贮液罐的入口相连。在管线13上装设第四阀门V4，以将试剂从反应器7导向“废物收集器”或“回收器”。
可以看出，容器/贮液罐5和反应器7是由管线11和13限定或完成的回路的一部分。容器/贮液罐5因此可用于容纳从反应器出来的排料，并可保存从反应器中循环回来的洗涤溶剂或氨基酸溶液。如以下所述，这可使反应器基本上不储集液体。
图2详细显示了反应器7。该反应器包括外壳15，该外壳中装有用于旋转的转筒17。外壳15优选将外界隔开，以防止反应剂和洗涤液的蒸发。转筒17和外壳15之间有一空间18。转筒17安装在转轴19上。转轴19可运转地连接在一个合适尺寸的马达M上，以旋转转筒17，并在转筒的表面处产生至少10个g的加速度。优选加速度大于15g，更优选的是转筒表面处的加速度为50g或更大。为在转筒的周边达到50g的加速度，半径为15cm的转筒必须以546rpm的速率旋转。可实现的加速度受反应器的机械强度和树脂压缩性限制。
转筒17有一个坚固的底部21、多孔圆筒壁23、以及从壁23的顶部向内延伸的唇边22。侧壁23中的开孔优选为2-5mm。在转筒壁23的内表面上装设过滤布或筛网衬里25，用以防止树脂R从壁23中通过。筛网衬里25的网孔大小优选为约树脂颗粒的十分之一(0.10)至三分之一(0.33)，以便将树脂颗粒保持在转筒中，而只是让液体通过。浆液输入管24通过管线8连接在三向阀V1上，用以引入固相物质的浆液。管24优选在其端部具有一个弯曲部分26，以将浆液导向转筒17的壁23。旋转转筒产生的离心力通常足以在转筒壁上形成平滑的树脂块。但是，管24可包括用于刮平浆液的机械装置，以在壁23上获得均匀厚度的树脂块。所述机械刮平装置可包括例如轴向或垂直延伸的叶片，该叶片可在转筒中径向移动，以设定在距转筒壁23所希望的距离处。反应剂输入管27与管线11相连，并延伸进入转筒17内，其包括多个喷嘴29，所述喷嘴可在旋转着的固体物床上喷洒氨基酸溶液、或洗涤溶剂。回管13使从转筒17中通过的反应剂或洗涤液快速地从反应器7中出去，并回到容器/贮液罐5中。以此方式，反应器7就不包括与转筒接触或浸没转筒的液体池。也就是说，反应器中的流体高度在外壳15中不会升至转筒17的底部21。因为反应器壳没有发生溢流，也就没有液体可产生使马达M更加努力工作的阻力。
还可装设其他设备，例如向配料罐3中自动化地添加所需要量的液体，监测容器/贮液罐5中的液体种类，以及监测进入反应器7中的液体流速。另外，还可装设任选的进料定序器S，以便整个操作更加自动化。也可装设跟踪脱保护和洗涤进程的设备(如IR检测器)，这样可真时地监测合成。此外，IR检测器可用作自动化过程的一个组成部分，而且在IR检测器指示反应已经停止后，对未反应的游离胺的测试可立即进行。
使用非金属或高度耐腐蚀的湿润表面的设计对于一些产品是必须的。在此情况下，反应器系统1的组件可用非反应性材料制成或用该材料作衬里。此等材料包括例如高镍合金，如可从Haynes InternationalInc.(Kokomo,Ind.)得到的Hasteloy,Teflon，可从E.I.du PontdeNemours得到的聚四氟乙烯涂层，或者316不锈钢。
合成可如下进行。将树脂和浆液溶剂送入至配料罐3中，然后启动搅拌器。用于树脂浆液的树脂颗粒是小的颗粒，优选其粒径小于100μ，其交联度为0.2-1.5％。例如，树脂可由boc-Pro-RCM(boc-脯氨酸结合于其上的Merrifield树脂，可从Sigma Chemical得到)组成，溶剂可为二氯甲烷(DCM)。温度可通过罐3上的温度控制器TIC调节至预定温度(如30℃)。在搅拌浆液的同时，开始旋转转筒17，并调节至所希望的转速(如1000rpm)，以产生至少10g、优选大于15g、更优选50g或更大的加速度。树脂浆液直接通过管线8和管24送入反应器中。转筒17在浆液引入时没有液体。作用在树脂上的离心力使树脂在转筒的内壁上形成相对均匀的块R(图2)。块R优选聚集成2-6cm的初始厚度。当然也可使用其他厚度。在配料罐3中引入另外的浆液溶剂或回收的滤液，以将残留的树脂冲刷进反应器7中。计量泵P2启动以回收从反应器中通过的浆液溶剂，确保在反应器中形成均匀的块。一旦块R达到所希望的厚度，即通过将三向阀V3转向废物收集器并且启动泵P2直至容器/贮液罐5排空，从而将剩余的浆液溶剂输送至废物收集器中。
上述叶片或刀片可方便浆液在侧壁上的刮平，以确保产生均匀厚度的床。在将浆液被涂敷在转筒壁23上时，如果浆液聚集的厚度超过了所希望的厚度，叶片可刮去多余的浆液。但是要注意的是，通常不需要此类机械刮平装置来形成平滑的树脂床。
使树脂结合的肽的N末端脱保护的溶液在配料罐3中进行混合。脱保护溶液的例子包括纯的三氟乙酸(TFA)、或TFA和DCM(二氯甲烷)的溶液。通过管线6将脱保护溶液输送至容器/贮液罐5中。开启泵P2，并使脱保护溶液在反应器/贮液罐回路中循环。通过管线11和管27将该溶液从容器/贮液罐5中泵送至反应器中。通过喷嘴29将脱保护溶液喷向浆液床，并从浆液床中通过进入转筒17和外壳15之间的空间18。溶液从反应器7中出来，并通过管线13返回至容器/贮液罐5。通过管线13中的阀V4将从反应器7中出来的第一部分离心液导向废物收集器或回收器，由此可清除管线和树脂床中残留的浆液溶剂。这可防止浆液溶剂与容器/贮液罐5中的脱保护溶液混合。在清除浆液溶剂后，从反应器7中出来的残留离心液被导向容器/贮液罐5，用于再循环至反应器7。回收持续一定的时间(优选约3分钟)。在脱保护后，如浆液溶剂一样，通过阀V3将该溶液导向废物收集器或回收器中。
如果必要的话，可加入第二脱保护溶液，以确保完成树脂结合的肽的N末端的脱保护。
洗涤树脂(例如用DCM)，以除去脱保护溶液。如下进行洗涤将需要量的溶剂送入配料罐3中，用泵P1将该溶剂输送至容器/贮液罐5，然后启动泵P2。洗涤溶液经过反应器7和容器/贮液罐5循环一定的时间，例如3分钟。如以上所述，阀V4首先开向废物收集器，以从系统中除去任何残留的脱保护溶液。然后将阀V4转向循环，洗涤液在系统中循环。在洗涤完成后，通过阀V3在系统中清除洗涤液。
还可进行其他的洗涤(例如用异丙醇)，以使树脂缩小。
用碱如二异丙基乙胺(DIEA)溶液洗涤树脂约20分钟，使肽脱保护。
用另外的DCM洗涤，以除去DIEA碱。
用甲醇(MeOH)或二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，使其缩小。
用DCM洗涤树脂，使其溶涨。
将递加至肽链上的下一个氨基酸(例如boc-精氨酸)加至配料罐3中。其优选是经过预先活化的，而且在配料罐3中添加氨基酸的同时，罐3还添加有合适的溶剂如DCM和DMF。偶联剂如DCC或DIC添加至配料罐3的氨基酸溶液中。在预先活化后，形成大多数的不溶性副产物，开启阀V1，将经活化的氨基酸通过过滤器F1导向容器/贮液罐5，以除去活化过程中产生的不溶性副产物。过滤器F1的尺寸应可以除去基本上所有的在活化过程中产生的不溶性副产物。经过滤的氨基酸溶液然后如上所述在反应器中循环，直至偶联完成。
因为外壳和转筒在反应期间都没有溢流产生，因此需要的液体量要比搅拌釜反应器、摇瓶反应器、或者甚至溢流式转筒反应器的都少。其使用较少液体的能力使得能够使用较高浓度的氨基酸，而不必使用更多量的氨基酸，因此没有增加运行费用。所以可增加氨基酸溶液的浓度，例如至300mmol/升溶液，而不必增加粗氨基酸的使用量。众所周知，反应速率是反应剂浓度的函数。因此，能够使用较少的液体可增加偶联步骤的反应速率。经活化之氨基酸的温度可在配料罐3中控制和调节，以及在热交换器H1中重新循环时来控制和调节。偶联反应的终点可通过检测从反应器中取出的树脂样品来证实。
可用如DMF的溶剂洗涤树脂。
通过用甲醇洗涤树脂，可将其中的不溶性副产物除去。
用如DCM的溶剂洗涤树脂，可除去甲醇。
下一个氨基酸时，按顺序重复上述步骤。优选的是，用过滤布和转筒的多孔侧壁替换在搅拌釜或管状SPPS反应器系统中使用的过滤玻璃料。消除排料通路中小且单独的过滤玻璃料的几何限制，可使反应器系统不受玻璃料施加在系统上的压力限制(即设计者不必担心损坏玻璃料)。系统可承受的最大压力是由树脂颗粒的强度和树脂床的深度(压力不能大至损坏或大大地压缩树脂颗粒)以及转筒17的强度来控制的。
在每个步骤之间(即容器/贮液罐5中添加下一个溶液)，转筒17继续旋转。这确保在下一个溶液被引入至反应器7之前，用离心力将前一个溶液快速地从块R中除去。而且，如上所述，阀V4在各循环开始时开向“废物收集器”一段时间。这可进一步清除系统中的任何没有被转筒的连续旋转而从块R中除去的以前溶液，但该溶液可被目前的溶液冲出。这可确保尽可能地使仅为最小量的以前溶液残留在系统中，而且易于控制肽链和反应剂或洗涤液的接触时间。
应注意的是，转筒和树脂床没有溢流发生。因此，所有被引入转筒中的反应剂和液体都可以非常快的速度通过树脂块R。也就是说，溶液从块R中的通过没有被转筒和反应器外壳之间的空间18中的液体所阻碍。因此，肽和反应剂或洗涤液的接触时间可通过连续地旋转转筒和定时泵P2的运行时间来小心而精确地控制。
流体相对于颗粒的速度是一个可变的设计，它可影响系统的性能、产率和质量。在将反应剂或洗涤溶液引入转筒17时，液体如前所述从树脂和过滤布中通过，并进入外壳15，以再循环回至容器/贮液罐。只要液体从反应器中排出的速率基本上等于或超过液体被引入反应器的速率，反应器就不会溢流。取决于反应器转筒的底部和外壳底部之间的空间，液体供入速率可比液体流出速率慢，只要在液体达到转筒底部高度时循环完成即可。溶液从树脂和过滤布中通过的速度是树脂对液体由其中通过的阻力(Kp)的函数，也是过滤布对从其中通过的液体的阻力(B)的函数。Kp和B可根据以下等式计算Kp=-μαC3/A2ΔP和B=-μRm/AΔP(1)其中μ=液体的速度；C3=液体中固体的浓度；A=等于转筒中所用过滤布面积的过滤面积；
ΔP=通过树脂床的压降；α=块(树脂)对从其中通过的溶液的比阻力(m/kg)，其是孔隙率的函数；以及Rm=过滤布对从其中通过的液体的阻力。
作用在离心机中一个物体上的力可用以下等式描述。在以ωrad/sec转速旋转且半径为R的离心机中，物体的加速度α可通过以下等式得到α=Rω2(2)用重力加速度(980cm/sec2)除上述加速度，上述等式即可表示为重力加速度。
通过树脂床后的压降可按以下方式得到。施加在流体上的静压力表示为dP=ρgdz(3)其中P是压力，g是重力，而z是流体的高度。用等式2替换等式3中的重力加速度可得到dP=ρω2RdR(4)在床深度的内半径和外半径之间积分，得到以下等式Pi-Po=ρω2(Ri2-Ro2)/2(5)上述等式通过以下转化可用比半径每秒更方便的单位(每分钟转数)来表示ω[rad/sec]=2πN[rev/min]/60[sec/min](6)通过多孔介质后的压降可按以下等式表示Pi-Po=qμ(mcα/A2+Rm/A)(7)其中q是液体的体积流速，μ是液体粘度，mc是块的质量，α是块对流体的比阻力，Rm是过滤介质对流体的阻力，而A是过滤面积。如果块是压缩的，块阻力α是压力的函数。块和介质阻力的常数可通过进行恒定压力分批过滤实验，然后用收集的滤液的体积除以经过的时间对滤液的体积作图来得到。所得斜线的斜率与块阻力成比例，而截距与介质阻力成比例。
转筒17的内半径IR(图2)等于从转筒中心至唇边22之径向内端的距离，外半径OR等于从转筒的中心至转筒多孔壁23的距离。在所使用的转筒中，外半径(OR)为约15cm，唇边宽度为约7.5cm。所用转筒的内半径因此为约7.5cm。也可使用其他尺寸的转筒。在将反应剂和洗涤溶液引入转筒17时，溶液滴在树脂块的内表面上形成液壁，该液壁通过离心力被甩出树脂中。随着溶液至转筒中的流量增加，该液壁的深度也增加。当液壁的深度足以使该液壁内表面从转筒中心的距离(下表Ⅰ中R[内])小于转筒的内径(7.5cm)时，溶液将溢过转筒的唇边22。在这种情况下，转筒被有效地溢流。从下表Ⅰ中可以看出，在转速为500rpm时，转筒开始溢流，其入口流量在102.8ml/sec-115.7ml/sec之间，树脂床深度为5.5cm。树脂床深度为2.5cm时，当流量为217.8ml/sec-244.9ml/sec之间时，转筒开始溢流。转速为1000rpm时，直至流量非常高时转筒才发生溢流。树脂床深度为5.5cm时，流量达到449.8ml/sec-514.1ml/sec时，转筒才溢流；而树脂床深度为2.5cm时，流量为952.5ml/sec-1088.6ml/sec时，转筒才开始溢流。
下表Ⅰ中的数据可从一系列的过滤计算中得到，这些计算使用实验得到的Kp和B值，它们适用于壁面积为63.62cm2的离心机。Kp和B值是在转筒和外壳之间的空间18中的压力差P1为11(Hg)的恒定值时得到的。由此得到的过滤参数可适用于半径为15cm、转筒壁面积为1413cm2的离心机，以计算液体流量，得到各种转速时的压降(液体高度)。压力P1和过滤面积的变化将影响过滤系数Kp和B。
表Ⅰ经计算的流量对从树脂床中通过的压降

图5是经计算的流量对从转筒17中的树脂床中通过的压降的图。
优选的是，在溢流发生前的最大流量是床深度和转筒之唇边22的径向宽度的函数。因此，通过增加唇边22的宽度或者降低床深度，即可提高最大液体流量。反应器的运行不会被树脂床上的某些表面液体所阻碍(假设大量的液体不从唇边22上流出而绕过树脂床)。重要的是转筒不被浸没(即，在转筒壁和外壳之间的空间18中没有液体注入)。该表面液体的作用是在旋转的转筒内以增大液体体积为代价来增加从树脂床中通过的速度。能够随意以及没有任何限制地改变转速(因为转筒没有浸没在液体中)要比在溢流的槽或壳中旋转已浸没的圆筒时产生更大的流体速度。
液体和固体的均匀接触是反应器有效运行的基本条件。树脂和液体令人满意的接触可通过在树脂上均匀分散喷洒液体、均匀的树脂床深度、以及仔细地选择液体流量和转筒转速来达到。液体从固体床中通过的流量通常与从颗粒中通过后的压降成正比，而与树脂床的深度成反比。但是，树脂略为凝胶性的。高离心力使树脂床压缩，由此增加了从该树脂床中流过的阻力。如果树脂床在足够高压力下压缩，液体从床中流过的流量降低，但增加了压降。因此有最终的转速可使液体流速最大。
上表1表明半径为15cm的转筒中500和1000rpm的转速分别相当于(在转筒壁的内表面处)41123cm/sec2(41.9g)和164494cm/sec2(167.8g)的加速度。但是，在离心力压缩树脂颗粒阻碍流体从树脂床中流过之前，可以使树脂承受更高加速度的转速。颗粒压缩是颗粒刚性的函数，而颗粒刚性与树脂的交联度有关。
实施例装备有可变速度马达和不锈钢转筒以及7518-12型Cole-PalmerMasterflex蠕动泵的IEC离心机用作反应器。转筒内径为13cm、高度为5cm。通过6485-24型Masterflex Phar-Med软管将液体加至离心机中，该软管将液体导向转筒套的顶部，并使液流分成一系列粗的液滴。该设计不能用均匀的喷雾完全地覆盖树脂表面。液体流量约为200ml/min。氨基酸和HOBt预先用DCC活化。在添加至反应器前，用真空过滤从经活化的氨基酸溶液中除去不溶性的DCU。不需要醇(甲醇)洗涤，这是因为预先活化步骤已除去了大部分的DCU。该方法与下表Ⅱ相同。转筒转速约为500rpm，这相当于约18.2g的加速度。在上述条件下，跨过1cm比重为1.0的液体后的(溢流)压降是1645N/m2(0.24psi)。反应器的离心过滤面积是204cm2，空转筒的最小表面液体速度(流量为200ml/min)是0.98cm/min。跨过树脂颗粒的实际流速与块孔隙率成反比，而且应是该估计流量的10-100倍。
进行两组实验。第一组实验是用于评估树脂在没有化学反应时的性质。将树脂分散在DCM或DMF中，然后加至离心机中，该离心机衬有聚丙烯1-3微米过滤布。树脂在过滤布上形成均匀的床，在将其与DCM、DMF和甲醇接触时溶涨和收缩。在离心机停止后，该树脂块在短时间内不会掉下。但将树脂块过夜干燥时会落下。虽然树脂块在干燥时会裂开，但裂缝也是相当窄的。有时形成空隙，但在以后的溶剂洗涤过程中会很快消失。在树脂颗粒表面引入液体可以使该表面平滑。细小的裂缝和空隙的形成据信不会影响液体从树脂块中通过的流量，并认为从树脂块中通过的液体流量是均匀的。在开始洗涤时也可在废水中发现树脂，但在回收时该废水被快速清除。液体回收进行得非常顺利，这是因为在离心机中没有溶剂的净积累，并可实现快速的流体接触。在送料和洗涤步骤开始时离心机中一些固体的损失是正常的，而且在该实验中已被估计在内，因为没有使用保持环来将过滤布夹持在转筒壁上。第一实验的结果非常有利，而且证实反应器系统的机械可行性。
在第二实验中，在甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂上合成二肽boc-Arg-Gly，以证实反应装置对小肽合成的适用性。而且偶联Leuprolide的最后三个氨基酸(pGlu-His-Trp)，以形成Leeprolide，并证实反应装置对中等长度的肽的适用性。所采用的方法见下表Ⅱ。
表Ⅱ固相合成法

*对于Leuprolide洗涤时间增加至5分钟。
在第一合成(即boc-Arg-Gly)中，起始原料是按1meq蛋白质/g树脂比例的20g MBHA树脂。在第一偶联中使用60mmol(3eq)的boc-Gly、HOBt和DCC。氨基酸预先活化15分钟，然后过滤除去DCU。在1小时的反应时间后，停止离心，取样，然后用茚三酮试验测试游离胺。样品通过茚三酮试验。用DCM和TFA使原料脱保护，并静置过夜。
按照与上述boc-Gly相同的方法，用60mmol的boc-Arg(TOS)进行第二偶联。1小时和2小时时从偶联反应中取出的样品没有通过茚三酮试验。原料用1.5eq的boc-Arg(TOS)、HOBt和预先活化3分钟的DCC(使环化成Lactam最小)重新偶联。通过茚三酮试验。
实验的第二部分包括添加Leuprolide中的最后三个氨基酸(Glu-His-Trp)。得到Pre-Leuprolide(post-Ser)。此时树脂包含约0.5meq的肽/gm树脂。所用的方法与上述表Ⅱ的类似，不同之处在于加入溶剂重循环的容器，该容器由圆底烧瓶和带有滴管的经密封的圆玻璃头组成。离心机顶部的开孔用塑料烧杯盖住，该烧杯上有一狭缝，以便在其中夹住送料软管。做这些变化是为了减少由于蒸发造成的溶剂损失。
对boc-Trp用新的装置进行第一偶联。在第一个小时后样品通过茚三酮试验。用boc-His(BOM)进行第二偶联。增加泵速，原料再反应1小时。在增加的反应时间后，从树脂块的顶部、中部和底部取出树脂样品，并分别进行游离胺的试验。每个样品的茚三酮试验都是非常强的阳性。原料用1.5eq的boc-His(BOM)重新偶联，而且1小时后都通过茚三酮试验。用p-Glu进行最后的偶联。原料偶联1小时，而且样品通过茚三酮试验。干燥肽-树脂的最终重量是32g。用乙胺分解2.0g肽-树脂，得到802mg经保护的肽。粗肽用反相HPLC测试，并表现出典型的粗Leuprolide峰。
第一组实验的结果表明，树脂在离心机壁上形成均匀的树脂床，而且几乎不会破损或落下。另外，树脂床仅有最小的裂缝。在洗涤时空隙和裂缝都消失，而且树脂裂缝通常相当小。在偶联实验中除最后的偶联步骤外，滤液中细树脂颗粒的穿透几乎不存在。密封过滤介质的更好方法已可获得，并预期可解决该问题。
令人高兴的是，上述反应器系统和其运行的方法可避免溶剂和反应剂溢流反应器，并达到树脂中快速的流体速度。该系统的优点有许多，包括●在活化、偶联和脱保护期间更精确的温度控制。由于转筒没有被溢流的外壳所浸没，所以这是可能的。因此，所有需要控制的只是管线11和输入管26中的液体温度。●因为溶剂不象STR中那样充满外壳15，而且也不用分散树脂，所以溶剂的用量减少。●减少了氨基酸的用量或增加了反应速率。反应速率与反应剂的浓度成正比。因为溶剂体积减少，为得到相同的浓度，所需的氨基酸也减少。如果氨基酸的量不减少，则浓度就更高，反应速率也因此增加。●消除了高度易燃的溶剂。因为氨基酸被预先活化和过滤，所以树脂中DCU的浓度应非常小。其结果是，不需要甲醇和异丙醇。醇洗涤的消除即可消除“挤压”树脂，该过程可降解树脂颗粒。这当然也可减少将各氨基酸偶联至肽链上所需要的总时间。另外的好处是，可从该过程中消除亲核试剂，这也就消除了这些“反应性”物质所造成的交叉污染或消除不充分。●消除了由在搅拌容器中悬浮树脂颗粒所用的搅拌器的剪切力和摩擦力对树脂颗粒所造成的损坏。树脂不再象STR那样在搅拌时被挤压。因此减少了高速搅拌器叶片对树脂颗粒造成的剪切力损坏。●能够消除脱保护反应时产生的热量。经重新循环的液体被外部的热交换器冷却，因而树脂可连续地与冷却的DCM/TFA溶液相接触。●通过快速除去在脱保护反应期间由第一TFA加料产生的碳阳离子，能够提高肽的质量和产率。因为洗涤液被收集和回收，或者是在单个从反应器中通过后被弃掉，这是可以实现的。●能够在稳定的床中降低树脂粒径并仍保持流体相对于颗粒的高速度，而压降可通过自由旋转的未被浸没的转筒来调节。●提高原料液和树脂内活性位置之间的反应剂传递速率，这是因为树脂的预先活化包括通过过滤除去DCU。●在未被浸没的转筒中实现更短、更易控制的流体接触时间，而且过滤时间更快，这可使循环时间更短，而且TFA和肽-树脂的接触时间更易控制。●消除了可能碎裂或被树脂碎片或不溶性的副产物堵塞的玻璃料。如上所述，转筒17的多孔壁23代替了玻璃料。●更有效的洗涤，这是因为树脂在洗涤之间相对干燥地旋转，而且下一次的洗涤溶剂的第一部分被放弃而不是再循环。这有利于快速清洗以前溶剂的树脂。●树脂床的收缩和溶涨与均匀树脂块的适应。不象管状反应器，树脂床的体积与过滤面积(即转筒壁)的比例较低。
以上描述仅是说明性的，而不是用于限制。在所附权利要求书的范围内进行各种变化对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，DIC可用于替换DCC作为活化剂。使用DIC不产生不溶性的阻塞树脂的副产物(如DCU)。使用DIC作为活化剂因此消除了对甲醇洗涤和预先活化的需要，这可减少肽合成所需要的总时间。配料罐3可从系统中除去，而溶液可在容器/贮液罐5中混合。这需要将涉及配料罐的控制转向对容器/贮液罐的控制，而且过滤器F1放置在管线11中或者在管线11上的过滤器回路中。虽然转筒可围绕垂直轴进行水平旋转，但是转筒也可围绕水平轴旋转，使得转筒处于它的一侧，或者它甚至可围绕一个倾斜的轴旋转(即小于90度的角度)。这些例子也仅是说明性的。
权利要求
1.在反应器系统(1)中进行固相肽合成的方法，所述反应器系统(1)包括具有外壳(15)的合成反应器(7)，在外壳中的转筒(17)具有多孔壁(23)，该转筒可围绕轴旋转，而且其直径小于外壳的直径，转筒和外壳限定了一个在转筒外表面和外壳内表面之间的空间；所述方法包括以所希望的转速旋转转筒；在旋转的反应器转筒中供入树脂浆液，以在转筒的壁上形成基本上厚度均匀的块(R)；在旋转的转筒中供入脱保护溶液，以去除树脂结合的肽的N末端上的保护基；在旋转的转筒中供入一种或多种洗涤溶液，以从所述块中洗涤脱保护溶液；在旋转的转筒中供入待递加至肽链上的下一个氨基酸的氨基酸溶液和偶联溶液，以在肽链上递加下一个氨基酸；重复步骤(c)-(d)，直至肽链完成；其中，脱保护溶液、洗涤溶液、氨基酸溶液和偶联剂溶液引入至旋转着的转筒中的速率应使供入的溶液不聚集在反应器外壳中并浸没转筒，转筒在肽合成的各步骤期间处于非溢流状态。
2.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤将所希望的肽序列中的第一个氨基酸结合在树脂的活性位置上，以产生树脂结合肽。
3.如权利要求1所述的方法，其中，树脂是由苯乙烯颗粒制成的。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述颗粒的直径小于100μ，其交联度为0.2-1.5％。
5.如权利要求1所述的方法，其中，在所述旋转转筒的步骤中，应使转筒的旋转速率足以产生足够的离心力，使树脂块被挤靠在转筒壁上。
6.如权利要求5所述的方法，其中，转筒的转速应足以在转筒的内壁产生至少10g的离心力。
7.如权利要求1所述的方法，其中，上述反应器系统包括容器/贮液罐(5)；反应器(7)在外壳中有一出口，该出口通过第一管(13)与所述容器/贮液罐的入口流体相连，而且容器/贮液罐有一出口，该出口通过第二管(11)与反应器的入口(27)流体相连，所述容器/贮液罐、反应器、和第一和第二管状成一个循环回路；所述向反应器中供入所述溶液的步骤包括以下步骤向容器/贮液罐(5)中供入所述溶液，然后将所述溶液输送至所述反应器；所述溶液被迫使从上述块中通过并进入所述反应器空间(18)，所述溶液然后通过所述第一管(13)流回到所述容器/贮液罐(5)。
8.如权利要求7所述的方法，其中，向所述旋转的转筒中供入所述溶液的步骤包括通过所述循环回路循环所述溶液预定长的时间。
9.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤在第二溶液被引入至所述反应器前基本上清除所述反应器系统中的第一溶液。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述容器/贮液罐(5)可与收集器相连，所述清除步骤包括以下步骤将反应器(7)中的任何溶液输送至容器/贮液罐(5)中，使容器/贮液罐(5)与所述收集器相连，然后将容器/贮液罐(5)中的物质导向所述收集器；所述输送步骤包括在循环预定长的时间后且在引入第二溶液开始前，以所述预定速度旋转所述转筒。
11.如权利要求10所述的方法，其中，第一管(13)可与所述收集器流体相连，所述从反应器系统中清除第一溶液的步骤进一步包括以下步骤在向反应器中供入第二溶液期间使所述第一管与收集器相连至预定长的时间。
12.如权利要求1所述的方法，其包括控制所述溶液的温度的步骤。
13.如权利要求1所述的方法，其中，聚集所述块的步骤包括聚集所述块至2-6cm的厚度。
14.如权利要求1所述的方法，其包括在向反应器中供入氨基酸之前预先活化待递加之氨基酸的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其包括过滤预先活化之氨基酸溶液的步骤，以在向反应器中供入所述溶液之前从溶液中除去不溶性副产物。
16.如权利要求7所述的方法，其中，所述反应器系统包括设置在反应器(7)和容器/贮液罐(5)之间的过滤器，该方法包括在通过循环回路输送溶液时过滤该溶液的步骤。
17.如权利要求1所述的方法，其中，向反应器中供入溶液的步骤包括通过喷嘴(29)向树脂块喷洒溶液。
18.进行固相肽合成的反应器系统，该反应器系统包括一反应器(7)，该反应器具有一外壳(15)，所述外壳包括入口、出口和装设在所述外壳内的转筒(17)，该转筒具有多孔侧壁(23)，在该侧壁上形成树脂块；溶液供料罐(5)，在其中引入肽合成所需的溶液，该溶液供料罐具有入口和出口；所述反应器的出口通过第一管线(13)与供料罐的入口流体相连，而供料罐的出口通过第二管线(11)与反应器的入口流体相连；其中，反应器的运行可保持反应器转筒(17)处于未溢流状态，使所述溶液不浸没反应器转筒。
19.如权利要求18所述的反应器系统，其包括在向系统中添加第二溶液前基本上清除反应器系统中用于肽合成的第一溶液的装置。
20.如权利要求19所述的反应器系统，其包括收集器和在所述第二管线(11)中的第一阀(V2)，所述第一阀(V2)可在第一位置和第二位置之间选择性地开关，处于所述第一位置时从所述供料罐中出来的溶液进入所述反应器中，处于所述第二位置时从所述供料罐中出来的溶液则通入至所述收集器中，所述清除装置包括所述反应器、贮液罐和阀，而且所述反应器转筒在溶液的循环完成后旋转，使得所述转筒中的任何溶液都通向所述溶液供料罐，所述溶液供料罐中的物质然后通过所述第一阀被导向所述收集器。
21.如权利要求20所述的反应器系统，其中，所述清除装置进一步包括在所述第一管线(13)中的第二阀(V4)，所述第二阀门可在第一位置和第二位置之间选择性地开关，处于所述第一位置时所述反应器的出口与所述供料罐相连，处于所述第二位置时所述反应器的出口与所述收集器相连；而且所述系统运行时，在向所述反应器中供入所述第二溶液期间，使所述第二阀门开向第二位置至预定长的时间。
22.如权利要求18所述的反应器系统，其包括配料罐(3)，该配料罐与所述反应器和溶液供料罐流体相连，而且阀门(V1)可选择性地将所述配料罐中的物质导向所述溶液供料罐和反应器之一。
23.如权利要求22所述的反应器系统，其中，在所述配料罐中制备树脂浆液，开启所述阀门(V1)，将所述浆液导向所述反应器，所述反应器包括浆液导入管。
24.如权利要求23所述的反应器系统，其中，所述浆液导入管将所述浆液导向所述反应器转筒壁。
25.如权利要求24所述的反应器系统，其包括刮平装置，以方便在反应器壁上形成厚度均匀且基本上平滑的浆液床。
26.如权利要求22所述的反应器系统，其中，溶液中的氨基酸在所述配料罐中进行预先活化，然后通过所述阀门将所述氨基酸溶液导向所述溶液供料罐中。
27.如权利要求26所述的反应器系统，其包括设置在所述阀门(V1)和所述溶液供料罐之间的过滤器(F1)，所述氨基酸溶液由该过滤器中通过。
全文摘要
本发明涉及固相肽合成反应器系统(1)和运行该反应器的方法。反应器系统(1)包括在外壳(7)中可围绕着轴旋转的转筒(17)和容器/贮液罐(5),该容器/贮液罐可将流体输送至外壳(7)中,或者是从该外壳收集流体。转筒(17)有一个多孔侧壁(23),在该侧壁上形成用于肽合成的树脂块(R)。该反应器(7)和容器/贮液罐(5)形成一个溶液可在其中循环的回路或环路。溶液的循环防止反应器(7)溢流,使得转筒(17)不浸没在溶液中,并可以使用较少的液体。因此,可使用较大浓度的氨基酸溶液。所述方法包括在转筒(17)的壁(23)上形成均匀厚度的树脂块(R),然后在旋转转筒时将溶液喷洒在树脂块上。溶液将通过树脂块(R)并排干至贮液罐(5)中,以通过系统再循环或回收或者从系统中排出。在向反应器系统(1)中引入下一个溶液之前,需要从系统中清除以前的溶液,以便控制肽和溶液的接触时间。
文档编号B01J19/18GK1215995SQ98800126
公开日1999年5月5日 申请日期1998年2月10日 优先权日1997年2月11日
发明者尼古拉斯·斯泰帕纽克, 基思·托马济, 迈克尔·C·斯特普尔顿 申请人:马林克罗特化学公司