一种柔性筛板固相萃取柱及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型固相萃取柱，包括固相萃取柱的填料和制备方法，以及使用 该固相萃取柱进行血液中样品萃取和检测的方法，特别适应于易分解及易解离型药物制剂 的分离与提取，属于生物化学和药物代谢技术领域。
【背景技术】
[0002] 血液中样品的提取与分析是药物代谢动力学和代谢组学等中必要的分析处理方 法。由于血液样品基质复杂，选择合适的预处理方法十分重要。固相萃取方法是常用的一 种前处理方法，但目前的商品化固相萃取柱填料致密，难以对大尺寸的物质（如脂质体）进 行有效的萃取分离。而易分解的药物制剂也会产生不同程度的解离，导致对于代谢过程中 的检测产生偏差。
[0003] 针对上述问题，在血液样品处理这一领域，提供一种能有效分离大尺寸、易解离物 质的固相萃取方法，对于一些药物代谢动力学的研宄有很大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种固相萃取柱及其制备方法和应用，利用该固相萃取柱可 以对血液中复合制剂型药物，如脂质体包裹小分子药物等，进行很好地分离，以满足临床药 物代谢的实验。
[0005] 本发明提供的固相萃取柱包括：位于萃取柱底部的疏水性高穿透性柔性筛板，及 萃取柱内的非极性硅基填料，其中非极性硅基填料干粉的粒径为10-100 μπι。
[0006] 上述疏水性高穿透性柔性筛板例如硅烷化的脱脂棉、高分子丝状非纺织材料、聚 乙烯纤维丝棉或聚丙烯纤维丝棉等材料制备成的柔性筛板。
[0007] 所述高穿透性，是指微米级别的物质不会受到阻碍，能够穿透。
[0008] 上述非极性娃基填料干粉的粒径优选为40-60 μ m。
[0009] 本发明的固相萃取柱通过下述方法制备得到：
[0010] 在空的固相萃取柱底部放入疏水性的高穿透性柔性筛板（如硅烷化的脱脂棉、高 分子丝状非纺织材料、聚乙烯或聚丙烯纤维丝棉等制备成的柔性筛板），填入一定质量的非 极性硅基填料干粉（粒径10-100 μm)，制成固相萃取柱。
[0011] 上述高穿透性柔性筛板的材料中所述的硅烷化的脱脂棉，是通过如下方法制备 的：将脱脂棉用第一有机溶剂（例如丙酮或甲醇）清洗并晾干，在硅烷化试剂溶液（如将二 甲基二氯硅烷溶于正己烷得到的溶液）中浸泡一定时间，使得硅烷化完全，将脱脂棉取出 后用第二有机溶剂冲洗干净，稍晾干后，在甲醇中浸泡若干小时，晾干后，用第三有机溶剂 (例如正己烷等）浸泡洗净，最后晾干得到高穿透性柔性筛板。而高分子丝状非纺织材料、 聚乙烯或聚丙烯纤维丝棉等材料可直接用于本发明中。
[0012] 上述第一有机溶剂优选易挥发的有机溶剂，例如丙酮、甲醇、氯仿等；上述第二有 机溶剂是不含水的非极性有机溶剂，不含有活泼氢，易挥发，例如烷烃，其中正己烷是比较 好的选择；上述第三有机溶剂是非极性有机溶剂，不含水，不含有活泼氢，例如正己烷等烷 烃类有机溶剂。
[0013] 本发明的固相萃取柱主要应用于分离提取易分解及易解离型大尺寸物质（100纳 米-100微米），例如脂质体包裹小分子药物等药物制剂。
[0014] 本发明还提供了利用上述固相萃取柱进行固相萃取的方法，具体是：将上述固相 萃取柱洗涤并活化后上样，用洗涤液在重力条件下洗涤，最后用洗脱液洗脱，实现样品的富 集和分离净化。
[0015] 优选的，采用有机溶剂对所述固相萃取柱进行洗涤，再用水溶液活化。通常，上样 前，洗涤固相萃取柱用的有机溶剂与洗脱液是一致的，根据样品的性质进行选择，常用的如 甲醇、二氯甲烷、氯仿、甲苯等；活化固相萃取柱的水溶液与上样后的洗涤液保持一致。
[0016] 进一步的，洗脱得到的溶液用氮气吹干仪吹干，再加入复溶液（如高效液相色谱 流动相）溶解，定容，进行相关检测。
[0017] 本发明提供的新型固相萃取柱以柔性非极性材料为筛板，加入非极性硅基填料制 备而成，填料疏松，便于大分子的通过；非极性柔性筛板使得极性分子极易洗涤。该萃取柱 可用于复杂样品基质中大尺寸、易解离样品的提取分离。本发明涉及该固相萃取柱的制备 方法，包括柔性非极性筛板的制备以及填料方法，以及使用该固相萃取柱进行萃取的流程 及检测方法。本发明应用于血浆中紫杉醇和紫杉醇脂质体的分离，达到很好的分离效果。本 发明的固相萃取柱制备容易、操作简单、成本较低、稳定性好，在临床实验大规模应用中具 有很好的前景。
【附图说明】
[0018] 图1是实施例3采用本发明固相萃取柱及流程分析血浆中游离紫杉醇的工作曲 线。
【具体实施方式】
[0019] 下列实施例所使用的试剂及原料：
[0020] 力朴素-注射用紫杉醇脂质体（南京绿叶思科药业有限公司）。Flash-ClS填料 40-60 μ m，20-45 μ m (博纳艾杰尔科技有限公司）。
[0021] 乙腈，甲醇（色谱纯，迪马科技有限公司）；甲酸，甲酸铵；正己烷，二甲基二氯硅 烷，丙酮（分析纯）；5%葡萄糖注射液（北京双鹤药业股份有限公司）。
[0022] 若无特别说明，在实验过程中使用的纯净水均由Milli-Q水纯化系统（Millipore 公司，Molsheim市，法国）制备而成。其余未提到的试剂均为分析纯，并且使用前无需进一 步的纯化。
[0023] 下列实施例采用的仪器为：
[0024] 超高效液相色谱仪 ACQUITY UPLC (Waters)，质谱仪为 API-5500 (AB SCIEX)，氮气 吹干仪BF-2000 (北京八方世纪科技有限公司）。
[0025] 液相色谱条件：
[0026] 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18,1. 7 μπι，2· l*50mm
[0027] 柱温：45°C
[0028] 流动相A : 2mM甲酸铵，0· I % (V/V)甲酸水溶液；B :甲醇
[0029] 流速：0· 4mL/min
[0030] 梯度：0-0· 5min 50% Α，0· 5-2. 5min 5% Α，2· 5-3. Omin 50% A
[0031] 质谱条件：
[0032] 雾化温度：500 °C
[0033] 紫杉醇 MS/MS :m/z 854. 2- 286. 2
[0034] 内标 MS/MS :m/z 808. 2- 226. 2
[0035] 实施例1固相萃取柱的制备
[0036] 将脱脂棉用丙酮清洗并晾干，在5% (V/V)二甲基二氯硅烷的正己烷溶液中浸泡 14小时，取出后用正己烷冲洗干净，稍晾干后，在甲醇中浸泡1小时，晾干后，用正己烷浸 泡，最后晾干得到硅烷化的脱脂棉。
[0037] 在ImL注射器（内径4. 7mm)底部塞入适量硅烷化脱脂棉，填入0· 12g Flash-C18 填料（40-60 μm)干粉，制成固相萃取柱。固相萃取柱先用ImL甲醇洗绦，再用ImL 5% (g/ mL)葡萄糖注射液活化。
[0038] 实施例2血液中紫杉醇和紫杉醇脂质体的固相萃取流程
[0039] 1、向已活化好的的固相萃取柱滴加50 μ L内标工作液（多烯紫杉醇，500ng/mL，甲 醇：水=1:1 (体积比）溶解），自然滴干；
[0040] 2、加入2mL 5%葡萄糖溶液，自然滴干；
[0041] 3、加入200 μ L血浆样品，自然滴干；
[0042] 4、加入5mL 5%葡萄糖溶液，自然滴干；
[0043] 5、加入I. 2mL 20% (V/V)甲醇-水溶液，自然滴干后，缓慢将其吹干；
[0044] 6、加入ImL甲醇洗脱，自然滴干后再缓慢吹干，收集洗脱液；
[0045] 7、将洗脱液在40°C用氮气吹干，加100 μ L复溶液（0. 1 %甲酸-甲酸按水溶液： 甲醇=I : 1，体积比），HPLC/MS进样检测。
[0046] 实施例3血液中紫杉醇与紫杉醇脂质体定量检测方法学考核
[0047] 采用内标法进行定量，固相萃取流程同实施例2,利用二级质谱进行定量检测。对 方法的特异性、标准曲线、定量下限、精密度和准确度、基质效应、回收率进行考核。
[0048] A特异性：采用6个不同健康人的空白血浆样品，使用本发明的固相萃取和检测方 法处理和测定，在得到的色谱图中根据保留时间可以判断血浆中没有内源性物质的干扰。
[0049] B标准曲线：配置紫杉醇浓度为0. Ι-lOOng/mL的血浆工作液，采用本发明的固相 萃取和检测方法处理并测定。以浓度为横坐标，紫杉醇与内标峰面积比为纵坐标，进行直线 拟合，得到标准曲线见图1。标准曲线相关系数r>0. 99,线性良好。
[0050] C精密度和准确度：配置3个不同浓度的质控样品（低浓度质控、中浓度质控、高 浓度质控），采用本发明的固相萃取和检测方法处理并测定重复5个样品，连续测定3批，计 算日间和日内精密度和准确度。结果如表1所示，精密度结果RSD〈 15%，3个质控样品的准 确度均维持在± 15%以内，说明本方法的准确性高，重现性好，是一个稳定的方法。
[0051] 表1.紫杉醇检测精密度和准确度
[0052]
【主权项】
1. 一种固相萃取柱，包括位于萃取柱底部的疏水性高穿透性柔性筛板，及萃取柱内的 非极性硅基填料，其中非极性硅基填料干粉的粒径为10-100 μm。
2. 如权利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于，所述疏水性高穿透性柔性筛板是硅 烷化的脱脂棉、高分子丝状非纺织材料、聚乙烯纤维丝棉或聚丙烯纤维丝棉材料制备成的 柔性筛板。
3. 如权利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于，所述非极性硅基填料干粉的粒径为 40-60 μ m〇
4. 权利要求1?3任一所述的固相萃取柱的制备方法，在空的固相萃取柱底部放入疏 水性的高穿透性柔性筛板，填入一定质量的非极性硅基填料干粉，制成固相萃取柱。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性高穿透性柔性筛板的材料 为硅烷化的脱脂棉，通过如下方法制备：将脱脂棉用第一有机溶剂清洗并晾干，在硅烷化试 剂溶液中浸泡一定时间，使得硅烷化完全；然后将脱脂棉取出，用第二有机溶剂冲洗干净； 稍晾干后，在甲醇中浸泡若干小时；晾干后，用第三有机溶剂浸泡洗净，晾干。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为易挥发的有机溶 剂；所述第二有机溶剂和第三有机溶剂是不含水、不含有活泼氢、易挥发的非极性有机溶 剂。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂选自丙酮、甲醇和氯 仿中的一种；所述第二有机溶剂和第三有机溶剂是烷烃类有机溶剂。
8. 权利要求1?3任一所述的固相萃取柱在分离提取100纳米-100微米的大尺寸物 质中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述大尺寸物质是药物制剂。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是脂质体包裹小分子药物。
【专利摘要】本发明公布了一种柔性筛板固相萃取柱及其制备方法和应用。该固相萃取柱以柔性非极性材料为筛板，加入非极性硅基填料制备而成，填料疏松，便于大分子的通过；非极性柔性筛板使得极性分子极易洗涤。该固相萃取柱可用于复杂样品基质中大尺寸、易解离样品的提取分离。
【IPC分类】G01N1-34, B01D15-22, B01J20-30, B01J20-281
【公开号】CN104606923
【申请号】CN201510021658
【发明人】张新祥, 周颖琳, 张一鸣, 郑昕
【申请人】北京大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月16日