一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法。首先称取保存的琼脂糖凝胶进行洗涤处理，然后采用环氧氯丙烷活化法进行活化凝胶，得到活化凝胶；将得到的活化凝胶与间隔臂分子N?羟基琥珀酰亚胺进行手臂连接反应，得到手臂连接的凝胶；将得到手臂连接的凝胶与肽配基进行配基偶联反应；偶联反应所得产物进行处理反应得到凝血因子Ⅷ亲和层析树脂；所得树脂进行洗涤处理，最后于凝胶体积3倍的20％乙醇溶液中在4℃条件下存放。将本发明产品层析树脂用于从血浆中提取凝血因子Ⅷ，能够快速、特异、高效的纯化凝血因子Ⅷ。
【专利说明】
一种凝血因子Vl亲和层析树脂的制备方法 一、
技术领域：
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种凝血因子珊亲和层析树脂的制备方 法。 二、
【背景技术】：
[0002] 凝血因子VI能够十分有效地对甲型血友病患者进行替代治疗。随着各种层析工艺 的开发与应用，比活性可以达到lOIU/mg蛋白的中纯凝血因子VI产品开始用于临床治疗。 1992年Baxter公司成功推出第一个基因重组的凝血因子VI产品。
[0003] 尽管基因重组类的凝血因子VI产品己经有了较好的临床应用效果，但并不意味着 我们就要放弃血浆来源的凝血因子珊。一方面血浆来源的凝血因子Vi成本要低于重组类的 凝血因子珊，而且因为是从人血浆中提取的天然蛋白质，基本没有临床副反应的发生；另一 方面，血浆是一种宝贵的资源，除提取凝血因子VI外，还可以提取人免疫球蛋白、人血白蛋 白、人凝血酶原复合物、纤维蛋白原等产品。而且如果以低温离心冷沉淀为起始原料提取凝 血因子Vi的话，基本对上述产品的提取没有影响，既提高了血浆的综合利用效率和使用价 值，又分摊了单个血液产品的成本。但是，目前从血浆中提取凝血因子Vi过程中，分离技术 不甚理想。1959年，美国医生Pool首先观察到在血浆冷沉淀中含有大部分FVIII促凝血活 性，并于1965年与Shannon等开发了从密闭无菌系统中自单份血楽;分离制备冷沉淀制剂的 方法。但是冷沉淀制剂比活不确定、纯度较低、含有颗粒物和血型抗体、可导致过敏反应等。 20世纪70年代后开发了以冷沉淀为原料分离纯化的制备方法，生产比活为0.2~lOIU/mg蛋 白的各种冻干FVIII制剂。到90年代，有两种采用单克隆抗体亲和层析制备的高纯度FVIII 制剂面世，产品比活达700~3500IU/mg，几乎不含其他杂蛋白，但容易造成单抗亲和层析中 鼠类蛋白的污染。因此，本发明利用肽配基和靶蛋白之间类似抗原抗体结合反应的原理及 肽配基分子量小，即使脱落也容易在后续的纯化中分离而不对产品造成污染的优势，制备 琼脂糖凝胶肽配基亲和层析柱纯化FVIII。
[0004] 琼脂糖是琼脂中不带电荷的中性成分，琼脂糖为白色或微黄色粉末，高亲水性，含 有大量羟基，有特殊的胶凝性质，可制成多孔性凝胶，进而用于分离大分子物质，己广泛应 用于医药食品、纺织化工等行业，由于其具有很好的生物相容性，又是优良的生物分离介 质。
[0005] 间隔臂又称"手臂"，生物分子间的亲和作用有立体特异性，配基结合位点通常位 于大分子内部或表面的裂隙深处，若配基直接固定于载体表面则会由于空间位阻导致结合 常数下降。不溶性载体亲和纯化的空间位阻大，通常需要引入一定长度的"手臂"分子，以保 证亲和配基有合适的空间取向和伸展灵活性，常用的间隔臂分子一般为小于十个碳原子且 分子两端具有活性基团的小分子有机物，如二氨基亚胺、氨基己酸、二氨基己烷、琥珀酸、乙 二胺等。
[0006] 载体偶联配基后剩余的活性基团仍可通过基团共价结合或电荷离子交换引起不 可逆性吸附。因此，应对其进行掩蔽以降低载体的不可逆吸附，良好的封闭剂不仅能封闭载 体剩余活性基团和电荷，又不应产生新的活性基团、电荷，如巯基乙醇、氨基乙酸、乙醇胺、 巯基乙胺、半胱氨酸、醋酸酐等。为防止不可逆性吸附，应除去凝胶上的氨基及羧基基团，对 于氨基采用羧酸酐进行封闭；羧基掩蔽可采用乙醇胺进行封闭。 三、
【发明内容】
：
[0007] 本发明要解决的技术问题是:为了克服现有从血浆中提取凝血因子VI产品分离技 术中存在的缺陷，本发明提供一种凝血因子珊亲和层析树脂的制备方法。将本发明产品层 析树脂用于从血浆中提取凝血因子珊，能够快速、特异、高效的纯化凝血因子珊。
[0008] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
[0009] 本发明提供一种凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，所述制备方法包括以下步 骤：
[0010] a、首先称取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0011] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0012] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1~0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入 的体积量是湿琼脂糖凝胶重量的3~5倍;然后在25~35°C(优选为30°C)条件下恒温震荡 0.5~2h，恒温震荡时振动速度为100~200转/min(优选为150转/min);
[0013]震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3~5倍;然后在20 ~30°C(优选为25°C)、180~220转/分(优选为190转/分钟)条件下恒温振荡30~40分钟(优 选为35分钟）；震荡后静置30~40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0014] 得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50 %的二甲基亚矾或占沉淀凝胶体积 百分比50%的1，4_二氧六环为活化溶剂，并加入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙 烷，在25~35°C(优选为30°C)、180~220转/分(优选为190转/分钟）条件下恒温振荡反应9 ~12h(优选为IOh);反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗 涤至滤液为中性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0015] c、手臂连接：
[0016]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5~8(优 选为摩尔比1:6)，所述碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在55~65°C (优选为60°C )、180~220转/分(优选为190转/分钟）条件下恒温振荡1~1.5h(优选为1小 时），进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0017] d、配基偶联反应：
[0018] 称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基及碳化二亚胺EDC，在25~35°C (优选为30°C)、180~220转/分(优选为190转/分 钟)条件下恒温振荡进行配基偶联反应1.5~2.5h(优选为2小时）；
[0019] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在25~35°C (优选为30°C )、100~200转/min条件下恒温振荡2~2.5h;震荡后所得产 物装入层析柱中将液体抽滤后，采用去离子水洗涤3~4次;每次加入去离子水的体积为湿 凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在25~35°C(优选为30 °C )、100~200转/min条件下恒温振荡反应2~2.5h;所得产物即为凝血因子VI亲和层析树 脂；
[0020] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20%乙醇溶液冲洗3~4次，每次 加入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20 %乙醇 溶液中在4°C条件下存放。
[0021] 根据上述的凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，步骤a中所述琼脂糖凝胶 Sepharose CL-6B即琼脂糖凝胶CL-6B由琼脂糖凝胶微球或葡聚糖凝胶微球替代。
[0022] 根据上述的凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，步骤d中所述肽配基为肽配基 EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一种。
[0023]根据上述的凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，所述肽配基EYCPC、肽配基 GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常规多肽合成方法制备而成。
[0024]根据上述的凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，所述肽配基EYCPC、肽配基 GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的纯度均彡95 %。
[0025] 本发明的积极有益效果：
[0026] UFVIII是甲型血友病患者需要终身反复使用的一类药品。随着技术的革新，各种 层析技术、层析载体和方法的应用，制备高纯度和高回收率的FVIII制品已成为可能，但是 国内生产血液制品的企业仅有上海莱士、华兰生物等少数几家回收FVIII，造成了原料血浆 大量浪费。本发明有效避免了冷沉淀制剂回收FVIII比活不确定、纯度较低、含有颗粒物和 血型抗体、可导致过敏反应等问题、离子层析法对工艺条件要求较高及单克隆抗体亲和层 析制备容易造成单抗亲和层析中鼠类蛋白的污染问题，可丰富FVIII纯化方法、有效提高原 料血浆的利用率。
[0027] 2、本发明技术方案选用了针对人凝血因子VI的特异、通用的肽配基，并通过试验 证实所采用的肽配基偶联物能快速、特异、高效的纯化凝血因子珊。将本发明产品层析树脂 用于从血浆中提取凝血因子珊，能够快速、特异、高效的纯化凝血因子珊。
[0028] 3、本发明采用肽配基理性设计筛选凝血因子VI特异性肽，开发了高效、廉价和易 制备的特异性亲和配基。将该特异性亲和配基偶联在琼脂糖微球载体上，可用于纯化凝血 因子珊。偶联方法采用环氧氯丙烷活化法活化凝胶并键和间隔臂，用碳二亚胺盐酸盐偶联 肽配基后采用化学试剂掩蔽残余基团电荷。对于氨基采用羧酸酐进行封闭；羧基掩蔽可采 用乙醇胺进行封闭。 四、【具体实施方式】：
[0029] 以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
[0030] 以下实施例中采用的肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC均 按照常规多肽合成方法制备而成。制备而成的肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基 RKWNCTDHEYC的纯度均彡95 %。
[0031] 实施例1:
[0032]本发明凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
[0033] a、首先称取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0034] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0035] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.3M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积 量是湿琼脂糖凝胶重量的4倍;然后在30°C条件下恒温震荡1.5h，恒温震荡时振动速度为 150车专/min;
[0036]震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的4倍;然后在25 °C、 190转/分条件下恒温振荡30分钟;震荡后静置30min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0037]得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50%的二甲基亚矾为活化溶剂，并加 入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在30°C、190转/分的条件下恒温振荡反应 IOh;反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中 性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0038] c、手臂连接：
[0039]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:6,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在60°C、190转/分的条件下恒温振荡 1小时，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0040] d、配基偶联反应：
[0041]称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基EYCPC及碳化二亚胺EDC，在30°C、190转/分的条件下恒温振荡进行配基偶联反 应2.Oh;
[0042] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30 °C、150转/min条件下恒温振荡2.2h;震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤 后，采用去离子水洗涤3次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶 体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在30°C、150转/min条件下恒温振荡反应2.2h;所得产物即 为凝血因子VI亲和层析树脂；
[0043] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20 %乙醇溶液冲洗3次，每次加 入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶 液中在4°C条件下存放。
[0044] 实施例2:
[0045] 本发明凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
[0046] a、首先称取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0047] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0048] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.4M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积 量是湿琼脂糖凝胶重量的5倍;然后在28°C条件下恒温震荡1.8h，恒温震荡时振动速度为 120转/min;
[0049] 震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的5倍;然后在30 °C、 180转/分条件下恒温振荡40分钟;震荡后静置35min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0050] 得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50%的1，4_二氧六环为活化溶剂，并 加入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在25°C、180转/分的条件下恒温振荡反应 12h;反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中 性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0051 ] c、手臂连接：
[0052]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在55°C、180转/分的条件下恒温振荡 1.5小时，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0053] d、配基偶联反应：
[0054]称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基GCVSGCLCWEYC及碳化二亚胺EDC，在25°C、180转/分的条件下恒温振荡进行配基 偶联反应2.5h;
[0055] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在25°C、120转/min条件下恒温振荡2.5h;震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤 后，采用去离子水洗涤4次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶 体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在25°C、120转/min条件下恒温振荡反应2.5h;所得产物即 为凝血因子VI亲和层析树脂；
[0056] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20 %乙醇溶液冲洗4次，每次加 入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶 液中在4°C条件下存放。
[0057] 实施例3:
[0058]本发明凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
[0059] a、首先称取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0060] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0061 ] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.2M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积 量是湿琼脂糖凝胶重量的3倍;然后在35°C条件下恒温震荡0.8h，恒温震荡时振动速度为 100转/min;
[0062]震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3倍;然后在20 °C、 220转/分条件下恒温振荡35分钟;震荡后静置40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0063]得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50%的1，4_二氧六环为活化溶剂，并 加入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在35°C、200转/分的条件下恒温振荡反应 9h;反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中性， 洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0064] c、手臂连接：
[0065]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:7,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在65°C、200转/分的条件下恒温振荡 1.2小时，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0066] d、配基偶联反应：
[0067]称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基RKWNCTDHEYC及碳化二亚胺EDC，在35 °C、200转/分的条件下恒温振荡进行配基 偶联反应1.5h;
[0068] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在35°C、100转/min条件下恒温振荡2. Oh;震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤 后，采用去离子水洗涤4次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶 体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在35°C、100转/min条件下恒温振荡反应2.Oh;所得产物即 为凝血因子VI亲和层析树脂；
[0069] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20 %乙醇溶液冲洗4次，每次加 入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶 液中在4°C条件下存放。
[0070] 实施例4:
[0071] 本发明凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
[0072] a、首先称取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0073] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0074] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积 量是湿琼脂糖凝胶重量的3倍;然后在25°C条件下恒温震荡2.0h，恒温震荡时振动速度为 180转/min;
[0075]震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的4倍;然后在22 °C、 220转/分条件下恒温振荡35分钟;震荡后静置38min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0076]得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50%的二甲基亚矾为活化溶剂，并加 入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在28°C、220转/分的条件下恒温振荡反应 I Ih;反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中 性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0077] c、手臂连接：
[0078]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:8,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在58°C、220转/分的条件下恒温振荡 1小时，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0079] d、配基偶联反应：
[0080] 称取步骤C所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基EYCPC及碳化二亚胺EDC，在28°C、220转/分的条件下恒温振荡进行配基偶联反 应2.2h;
[0081] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在28°C、180转/min条件下恒温振荡2.2h;震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤 后，采用去离子水洗涤3次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶 体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在28 °C、180转/min条件下恒温振荡反应2.Oh;所得产物即 为凝血因子VI亲和层析树脂；
[0082] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20 %乙醇溶液冲洗3次，每次加 入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶 液中在4°C条件下存放。
[0083] 实施例5:
[0084]本发明凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
[0085] a、首先称取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0086] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0087] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1 M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积 量是湿琼脂糖凝胶重量的5倍;然后在32°C条件下恒温震荡0.5h，恒温震荡时振动速度为 200转/min;
[0088]震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的4倍;然后在25 °C、 190转/分条件下恒温振荡30分钟;震荡后静置30min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0089]得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50%的二甲基亚矾为活化溶剂，并加 入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在30°C、190转/分的条件下恒温振荡反应 IOh;反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中 性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0090] c、手臂连接：
[0091]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:6,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在60°C、190转/分的条件下恒温振荡 1小时，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0092] d、配基偶联反应：
[0093]称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基(肽配基采用肽配基EYCPC和肽配基GCVSGCLCWEYC二者的混合物，混合时二者摩 尔比为1:1)及碳化二亚胺EDC，在30°C、190转/分的条件下恒温振荡进行配基偶联反应 2.Oh；
[0094] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30 °C、150转/min条件下恒温振荡2.2h;震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤 后，采用去离子水洗涤3次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶 体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在30°C、150转/min条件下恒温振荡反应2.2h;所得产物即 为凝血因子VI亲和层析树脂；
[0095] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20 %乙醇溶液冲洗3次，每次加 入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶 液中在4°C条件下存放。
[0096] 实施例6:
[0097]本发明凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
[0098] a、首先称取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼 脂糖凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂 糖凝胶；
[0099] b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：
[0100] 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.3M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积 量是湿琼脂糖凝胶重量的4倍;然后在30°C条件下恒温震荡1.2h，恒温震荡时振动速度为 120转/min;
[0101]震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤(抽滤至无液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3倍;然后在20 °C、 200转/分条件下恒温振荡35分钟;震荡后静置40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；
[0102] 得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50%的1，4_二氧六环为活化溶剂，并 加入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在30°C、200转/分的条件下恒温振荡反应 IOh;反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中 性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；
[0103] c、手臂连接：
[0104]将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度 为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:6,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在60°C、200转/分的条件下恒温振荡 1.0小时，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶；
[0105] d、配基偶联反应：
[0106] 称取步骤C所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔 数的肽配基(肽配基采用肽配基RKWNCTDHEYC和肽配基GCVSGCLCWEYC二者的混合物，混合时 二者摩尔比为1:1)及碳化二亚胺H)C，在30°C、200转/分的条件下恒温振荡进行配基偶联反 应1.5h;
[0107] e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30°C、120转/min条件下恒温振荡2. Oh;震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤 后，采用去离子水洗涤4次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后加入湿凝胶 体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在30°C、150转/min条件下恒温振荡反应2.Oh;所得产物即 为凝血因子VI亲和层析树脂；
[0108] f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20 %乙醇溶液冲洗4次，每次加 入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶 液中在4°C条件下存放。
【主权项】
1. 一种凝血因子VI亲和层析树脂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步 骤： a、 首先称取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼脂糖 凝胶CL-6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝 胶； b、 环氧氯丙烷活化法活化凝胶： 称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1~0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体 积量是湿琼脂糖凝胶重量的3~5倍;然后在25~35°C条件下恒温震荡0.5~2h，恒温震荡时 振动速度为100~200转/min; 震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤，然后加入到lmol/L的NaOH溶液 中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3~5倍;然后在20~30°C、180~220转/分条 件下恒温振荡30~40分钟;震荡后静置30~40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶； 得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50 %的二甲基亚矾或占沉淀凝胶体积百分 比50%的1，4_二氧六环为活化溶剂，并加入占沉淀凝胶体积百分比20%的环氧氯丙烷，在 25~35°C、180~220转/分条件下恒温振荡反应9~12h;反应结束后对所得产物进行抽滤， 抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶； c、 手臂连接： 将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度为 9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5~8,所述 碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍;然后在55~65°C、180~220转/分条件下 恒温振荡1~1.5h，进行"手臂"分子键合反应;反应后得到手臂连接的凝胶； d、 配基偶联反应： 称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N-羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔数的 肽配基及碳化二亚胺EDC，在25~35°C、180~220转/分条件下恒温振荡进行配基偶联反应 1.5~2.5h; e、 称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的lmol/L的醋酸水溶液， 在25~35°C、100~200转/min条件下恒温振荡2~2.5h;震荡后所得产物装入层析柱中将液 体抽滤后，采用去离子水洗涤3~4次;每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积;洗涤后 加入湿凝胶体积1/2的lmol/L的乙醇胺，接着在25~35°C、100~200转/min条件下恒温振荡 反应2~2.5h;所得产物即为凝血因子珊亲和层析树脂； f、 将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20%乙醇溶液冲洗3~4次，每次加入 的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积;冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20%乙醇溶液 中在4°C条件下存放。2. 根据权利要求1所述的凝血因子珊亲和层析树脂的制备方法，其特征在于：步骤a中 所述琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B即琼脂糖凝胶CL-6B由琼脂糖凝胶微球或葡聚糖凝胶微 球替代。3. 根据权利要求1所述的凝血因子珊亲和层析树脂的制备方法，其特征在于：步骤d中 所述肽配基为肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一种。4. 根据权利要求3所述的凝血因子珊亲和层析树脂的制备方法，其特征在于:所述肽配 基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常规多肽合成方法制备而成。5.根据权利要求3所述的凝血因子珊亲和层析树脂的制备方法，其特征在于:所述肽配 基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的纯度均彡95 %。
【文档编号】B01J20/30GK106040196SQ201610493721
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】陈正跃, 詹合琴, 陈美光, 王璐, 靳玫, 高夏欢
【申请人】新乡医学院