专利名称：颗粒分选的设备和方法
技术领域：
本发明涉及用于分选悬浮液中的颗粒的方法和设备，其中分选模块的流体进入通道被分成几个流出通道。本发明尤其涉及一种具有多个互连分选模块用以提高颗粒通过量的颗粒分选系统。
背景技术：
在生物技术领域，尤其是细胞学和药物筛选领域，需要以高通过量来分选颗粒。需要分选的颗粒是各种类型的细胞，如血小板、白细胞、肿瘤细胞、胚胎细胞等等。在细胞学领域这些颗粒是人们尤其感兴趣的。其它颗粒有(大)分子物质，例如蛋白质、酶和多聚核苷酸。在新药物的开发的药物筛选领域中，该颗粒家族是人们特别感兴趣的。
用于分选颗粒的方法和设备是已知的，并且现有技术中所描述的大部分是在如下情况下工作的，颗粒悬浮于流经具有至少一个下游分支点的通道网络的液体之中，并且依照检测-决定-导流的原理工作。首先要分析移动的颗粒的特定特性，诸如吸光度、荧光强度、尺寸大小等等。根据该检测阶段的结果，决定在下游阶段如何进一步处理该颗粒。再将所做决定的结果加以应用，使特定的颗粒朝着通道网络的预定分支方向偏转(deflect)。
分选设备的通过量，即单位时间内可分选颗粒的数量，是十分重要的因素。对于每单个分选单元，采用闭合通道中的颗粒悬浮液流的分选器的典型分选速率为几百颗粒每秒至几千颗粒每秒。
美国专利No.4175662中描述了分选装置的例子，在此引入其内容作为参考(下文中称为‘662专利)。在‘662专利中，颗粒流，此处为细胞，流经直型通道的中央，直型通道在下游分支点处岔分成两个垂直通道(T型分支)。流入颗粒被相容流体构成的外层所包围，使得该颗粒限制在通道的中央。在通常情况下，可调节通过两个分支的流量比，使颗粒自动地流过其中之一。在通道的一个区域内可用例如光学系统的检测器检测颗粒的特性(检测阶段)。在决定阶段，当检测器检测到具有预定特性的颗粒时，检测器就发出信号。在导流阶段，一旦检测到颗粒，导流器就被激活使该颗粒发生偏转。在此例中，导流器包括安装在通道分支处的电极对，在该分支处颗粒通常流经处于非激活状态的导流器。通过应用电流脉冲，水溶液被电解，在电极对之间释放出所产生的气泡。释放阶段中随着气泡尺寸的增大，通过该分支的流速降低。在施加了电流脉冲之后，气泡停止了增大，并且被流体携带着。结果，通过特定分支的流体暂时减少，而目标颗粒改变了流路流向另一分支的下游。
‘662专利中的装置对于分选颗粒是有效的。然而有一个严重的缺陷在于产生的气泡可能会在流控网络的某个点聚集。该气泡的产生可能会阻塞流动通道，造成错误分选。另一个缺点在于所产生的气体(主要是氧气和氢气)和离子物质(主要为OH-和H+)影响了颗粒流经具有电极对的分支。另外，细胞和易损伤的蛋白质如酶是非常脆弱的，会被与气泡共同产生的污染成分所破坏。另一个缺点在于整个分选装置很复杂。特别是在系统的小型通道中安装和组装微电极构造是十分复杂的。因此，分选单元的成本相对较高。
美国专利3984307中描述了现有技术的颗粒分选系统的另一个例子，在此引入其内容作为参考(下文中称为‘307专利)。在‘307专利中，被流动的外层液体限制的颗粒流经通道的中央。经过检测器区域之后，该通道岔分为之间成锐角的两个通道(例如，Y型分支)。在通道的分支点稍前处，安装了一个电激活的换能器，用于偏转具有适当预定特性的特定的颗粒。所述换能器为压电致动器或者超声换能器，电激活后在通道中产生压力波。所产生的压力波会暂时干扰一个分支中的流动，从而使目标颗粒偏转到另一个分支中。
在‘307专利的装置中，如同前面所讨论的装置一样，将导流器加到通道系统中会导致较高的造价。该装置的另一个缺点在于所使用的导流器原理。所产生的压力波并不局限在分支点，而是向上游区传播到检测器区域，以及向下传播到两个分支。这会影响到所有通过通道的流体。如果将此类型的分选器串联或并联，如构建高通过量分选系统时所做那样，此缺点就尤为突出。一个分选器中所产生的压力波可能接着影响邻近分选器单元中的颗粒的流动和导流。
美国专利No.4756427中描述了另一种分选器，在此引入其内容作为参考。该分选器类似于‘662专利中的分选器。但是，在此例中，通过暂时改变一个分支的阻力来干扰在该分支中的流动。阻力的改变是通过外部致动器来改变分支通道的高度。在优选实施方案中，该外部致动器为粘合在通道顶部的压电圆盘，使之在激活后向下移动。
尽管‘427专利中所述的分选器构造比先前描述的分选器结构简单一些，但是当所述类型的多个分选器模块连接到一起以提高分选速率时，它仍然存在问题。如同‘307专利中所述的分选器一样，这是因为其所产生的压力波会造成对其它分选器模块的干扰。
美国专利第5837200号中描述了另一种颗粒分选装置，在此引入其内容作为参考。‘200专利描述了一种利用磁导流模块，根据颗粒的磁性特征来分类或选择的分选装置。‘200专利还进一步描述了并联处理和分离单股颗粒流的过程。
发明简述本法明提供了用于分选流过毛细尺寸的封闭通道系统的颗粒的方法和设备。本发明的颗粒分选系统提供了一种分选模块，其可以低成本地组装并提供在每单位时间内准确分选大量颗粒的手段。该颗粒分选系统可包括多个紧密连接的分选模块，其结合起来以进一步提高了分选速率。为了降低错误率，该颗粒分选系统可包括多步分选装置用于连续地分选颗粒流。
根据本发明，颗粒分选系统实现了改进的流控颗粒转向的方法和转向的装置。该颗粒分选系统包括用于分选颗粒的毛细尺寸的封闭通道系统。该通道系统包括用于引入颗粒流的第一供管和用于提供载液的第二供管。第一供管形成的管口将颗粒流引入载液中。第一供管和第二供管与测量管流体连通，测量管在分支点处岔分成第一支路和第二支路。测量区域被限定在测量管中，并且与检测器联合以检测测量区域中的颗粒的预定特性。两个相对的气泡阀与测量管连通放置并彼此相对隔开。气泡阀通过一对相对的边路通道与测量管连通。液体可以部分填充这些边路通道从而在其中形成弯液面，作为载液与气泡阀储液池的分界面。还提供了一个外部致动器用于调节其中一个气泡阀。当外部致动器被激活后，受激活的气泡阀的储液池压力增加，使弯液面发生偏转并在测量管中造成流动干扰以使其中的流体发生偏转。
当位于测量区域的传感器检测到流经测量区域的颗粒的预定特性时，该传感器就发出信号以响应所检测到的特性。外部致动器对传感器发生响应，在第一气泡阀的加压腔室中产生压力脉冲，使具有预定特性的颗粒发生偏转，导致所选颗粒流到第二分支管下游。
一方面，本发明包括分选颗粒的方法，步骤包括提供具有入口和分支点的测量管，该管在分支点处岔分为两个分支管道，将其中具有悬浮颗粒流的流体流导入管的入口，这样该颗粒通常流过第一个分支管道，并且在分支点的上游提供两个相对的边路通道用于使管道中的液流暂时发生偏转。第一个边路通道液压式地与第一个气泡阀的加压腔室相连，该气泡阀通过用于改变其中压力的外部致动器来激活。第二个边路通道与第二个气泡阀的缓冲器腔室液压式连接用于吸收压力变化量。该方法进一步包括沿边路通道上游的测量管提供测量站，用于检测液流中颗粒的预定特性，并且当检测到预定的特性时产生信号。该方法进一步包括以下步骤响应于对预定特性的检测，激活外部致动器用以在边路通道之间的管道中产生流动干扰，从而使具有预定特性的颗粒发生偏转并使所选颗粒流向第二分支管道的下游。
本发明的另一些方面，通过分别并联多个分选模块或者以二叉树形构造串联多个分选模块，分别增加了颗粒的分选速率或者增加了被分选颗粒的类型。
根据本发明的一个方面，提供了一种颗粒分选系统。该颗粒分选系统包括用于运送限制在载液中的悬浮颗粒流的第一管道，其包含入口、第一出口和第二出口，用于检测颗粒的预定特性的传感器，与第一管道相连通的边路通道，位于边路通道附近的封闭腔室，其中载液在边路通道中形成弯液面以将封闭腔室与载液相隔开；以及致动器。当传感器检测到所述的预定特性时，致动器改变封闭腔室内的压力使弯液面发生偏转。弯液面的偏转使得具有预定特性的颗粒流向第二出口，而不具有预定特性的颗粒流向第一出口。
预计本发明在高通过量的筛选中将十分有价值；例如在针对抗对一种或多种细胞的活性筛选大量候选化合物时。其对于例如，筛选合成或天然产物库中的活性化合物或生化特性时尤其具有价值。
另外还预计本发明在高通过量地筛选样品中的多个诸如生物分子这样的分子时，将十分有价值。本发明可用于筛选样品，以确认大量生物分子的存在与否，例如多肽、受体配体、酶底物、酶或受体活性的激动剂或拮抗物，或者核酸。
附图简述
图1是根据本法明的说明性实施方案的颗粒分选系统的示意图。
图2至图4表示了图1中的颗粒分选系统的工作过程。
图5表示具有用于致动器腔室和缓冲器腔室的备选位置的颗粒分选系统。
图6表示根据本发明的另一个实施方案的颗粒分选系统。
图7表示适用于本发明的颗粒分选系统的气泡阀。
图8是本法明的说明性实施方案的颗粒分选系统的示意图。
图9表示根据本发明教导的用于分选平行颗粒流的颗粒分选系统的一个实施方案。
图10表示根据本发明教导的构造成二叉树型分选构造的颗粒分选系统的一个实施方案。
图11表示用于以多个阶段分选平行颗粒流的多级颗粒分选系统的另一个实施方案。
图12表示根据本发明的备选实施方案的并联颗粒分选系统。
图13表示根据本发明另一个实施方案的并联颗粒分选系统。
图14a和14b表示根据本发明另一个实施方案的颗粒分选系统，包括用来测量颗粒尺寸和/或速度的光掩模。
图15表示根据本发明另一个实施方案的具有可变通道的并联分选系统。
图16表示根据本发明另一个实施方案的并联分选系统的可变阵列设计。
图17表示根据本发明另一个实施方案的并联分选系统。
图18表示用于实施本发明的颗粒分选系统的药物筛选系统。
发明详述本发明提供了一种用于分选悬浮在液体中的颗粒的颗粒分选系统。该颗粒分选系统具有对预定特性颗粒的高通过量和低错误分选度。以下将结合说明性实施方案来详细描述本发明。本领域技术人员应明白本发明可以具有多种应用方式和实施方案，并不特别局限于应用在此处所描述的特定实施方案中。
在此所用的术语“管道”“通道”和“流动通道”指的是在媒质里形成的或者穿过媒质形成的允许流体如液体和气体移动的路径。在微流控系统中通道的横截面尺寸优选为大约1.0μm至大约500μm，优选为大约25μm至大约250μm，最优选为大约50μm至大约150μm。一个本领域的普通技术人员能够确定该流动通道的容积和长度。该范围意在包括上述值作为上限或下限。流动通道可具有任何选定的形状或排布方式，例如包括线性的或非线性的构造以及U型构造。
术语“颗粒”指的是物质的离散单元，包括但不限于细胞。
在此所用的术语“传感器”指的是用于测量目标物质，例如颗粒的特性的装置。
在此所用的术语“气泡阀”指的是可产生压力脉冲以控制通过通道的流体流动的装置。
在此所用的术语“载液”指的是用于运载一个或多个颗粒通过管道或通道的颗粒周围的相容性液体外层。
图1是根据本发明教导的颗粒分选系统10的示意说明。根据本发明的一项应用，颗粒分选系统10包括用于分选颗粒的毛细尺寸的封闭通道系统。该通道系统包括用于引入颗粒流18的第一供管12和用于提供载液的第二供管14。第一供管12形成管口12a，并且将颗粒流引入载液流中。第一供管12和第二供管14与测量管16流体连通，用于运送悬浮在载液中的颗粒。测量管在分支点21处岔分成第一支路通道22a和第二支路通道22b。测量区域20限定在测量管16中，并且与检测器19联合以检测通过测量区域20的颗粒的预定特性。两个相对的气泡阀100a和100b相对于测量管放置并与其流体连通。这些阀彼此相对地隔开，当然普通技术人员应明白还可以用其它的构造方式。气泡阀100a和100b通过一对相对的边路通道24a和24b分别与测量管16连通。液体可以部分填充这些边路通道24a和24b从而在其中形成弯液面25。弯液面确定了载液与相关气泡阀100的储液池中其它流体，譬如气体的分界面。还提供了一个致动器26用于启动其中一个气泡阀，当其被致动器26激活后可以在管道中暂时地造成流动干扰使其中的流体发生偏转。如图所示，致动器与气泡阀100b耦连。第二气泡阀100a用作缓冲器以吸收由第一气泡阀100b产生的压力脉冲。
第一个边路通道24b与第一个气泡阀100b中的加压腔室70b液压式地相连，这样如果该加压腔室的压力升高，边路通道附近的测量管中的流动就向内位移，基本垂直于与管内常规的流动方向。与第一边路通道24b相对设置的第二边路通道24a与在第二气泡阀100a内的缓冲器腔室70a液压式的相连接，用于吸收瞬间压力。第一边路通道24b与第二边路通道24a协同作用从而控制了前面所提到的通过向加压腔室70b加压而造成的液体位移，这样该位移就具有与通过测量管的常规颗粒流的方向相垂直的分量。
通过向加压腔室70b加压，许多液体瞬间从第一边路通道24b中放出。一旦加压释放时，第二边路通道24a的弹性就导致管道中的瞬间液流流入第二边路通道24a。通过外部致动器26响应于检测装置19发出的信号而向加压腔室70b加压和减压，两个边路通道的协同作用和它们相互交连的流控构造使得通过测量管16的流体瞬间来回地移动到支路中。这种瞬间液体位移具有与管道中常规流动相垂直的分量，可以被用于使具有预定特性的颗粒发生偏转，以便将它们和混合物中的剩余颗粒分离开来。
如图所示，测量管16在分支点21岔分为两个支路22a，22b，这些支路中的流体流动速度调整后使得颗粒通常流过两个支路中的第二个支路22b。支路22a和22b之间的角度为0至180度，优选为10至45度。然而，该角度甚至可以为0度，这对应于两个彼此间具有直型隔壁的平行管道。
优选将被分选颗粒提供到中心流体流的测量位置上，其周围是不含颗粒的液体外层。限制颗粒流的方法是已知的，通常称为“外层流”构型。通常，通过将悬浮颗粒流经过狭窄出口喷嘴注射到在管道16中流动的不含颗粒的载液中，可以得到限制构型。通过调节悬浮液和载液的流速，就可以调整管内的径向限制构型以及内部颗粒距离。较大流速的载液会导致更受限制的颗粒流，其颗粒之间具有较大的距离。
在由第一供管12引入的悬浮液中，可以区分开两种类型的颗粒，普通颗粒18a和目标颗粒18b。一但检测到测量区域20中的颗粒18b有预定特性，检测器19就发出信号。当外部致动器26收到由检测器19响应于所检测的预定特性而发出的信号，就激活第一致动器气泡阀100b在边路通道24a，24b之间的测量管16内产生流动干扰。该流动干扰使具有预定特性的颗粒18b发生偏转，使之流向第一支路管道22a而并非第二支路管道22b的下游。检测器与致动器26连接，使得当检测器19检测到颗粒的预定特性时，致动器就激活第一气泡阀100b，以在第一气泡阀的储液池70b中产生压力变化。第一气泡阀的激活使在第一气泡阀100b内的弯液面25b发生偏转并在第一边路通道24b中造成瞬间压力变化。第二边路通道24a和第二气泡阀100a吸收测量管16中由致动器26引起的瞬间压力变化。主要来说，第二气泡阀100a的储液池70a是具有弹性壁或者装有可压缩流体如气体的缓冲器腔室。该弹性特性使得液流从测量管进入第二边路通道24a，使压力脉冲被吸收并且防止颗粒流中的非选择的颗粒的流动受到干扰。
在测量区域20，利用适当的传感器19来检测单个颗粒的特定特性，例如尺寸、形态、荧光强度以及其它对本领域技术人员来说显而易见的特性。可用的传感器例如本领域公知的各种类型的光学检测系统，例如显微镜，机器视觉系统以及用于测量颗粒的电子特性的电子装置。用于测量颗粒的荧光强度的系统是本领域尤为公知的系统。这些系统包括具有适当波长用以引发荧光的光源，以及用于测量所引发的荧光强度的检测系统。该方法常常与用荧光标记物标记的颗粒结合使用，荧光标记物即那些用特定的第一波长光照射时会产生另一种特定波长光(荧光)的附着分子。如果检测到该第二波长的光，就感测到所述特性并发出信号。
其它例子包括测量被流经测量区域的颗粒散射的光。分析散射光可得到有关颗粒尺寸和形态的信息，当检测到预定特性时这些信息可被用于引发信号。
用于向第一气泡阀的加压腔室加压的致动器26可包括外部致动器，其可对传感器发出的颗粒具有预定特性的信号产生响应。适合于加压的外部致动器有两种。第一种直接向第一边路通道24b内的液体提供气压。例如，致动器包括加压气体供源，其与边路通道24b内液柱的转换阀相连接。转换器的激活将通道与加压气体供源相连接，使得液体内的弯液面发生偏转。一旦停止激活后，转换器又将通道24b连接回常规的工作压力。
或者，位移致动器可以与具有可移动壁的加压腔室结合使用。当位移致动器使加压腔室的壁发生向内的位移时，其内部的压力就升高。如果可移动壁向后位移到最初的位置，则压力又降回至常规的工作压力。合适的位移致动器例如通过励磁线圈使活塞发生位移的电磁致动器。另一个例子是使用压电材料，例如以柱状或者叠层圆片的形式，通过施加电压来产生线性位移。两种类型的致动器都可驱动加压腔室70的可移动壁，使其中的压力发生改变。
图2-4表示图1的颗粒分选系统10中的转换器40的转换操作情况。图2中，检测器19检测到颗粒中的预定特性并发出信号激活致动器26。一旦致动器被激活，第一气泡阀100b的储液池70b内的压力升高，弯液面25b发生偏转并使液体瞬间从第一边路通道24b释放，如箭头所示。由于第二气泡阀100a的储液池的弹性性能，管内该处压力的突然增加使得液体流进第二边路通道24a。箭头表示出了液体进入第二边路通道24a的移动过程。结果，如图所示，测量管16内的流体流动发生偏转，使位于第一边路通道24b和第二边路通道24a之间的所选目标颗粒18b朝着与其常规状态下的流向相垂直的方向转移。选择对测量管16、第一支路22a以及第二支路22b的流动阻力，使到达或者来自第一边路通道24b和第二边路通道24a的流体的优选流动方向具有明显的与测量管16中常规流动方向垂直的分量。该目标可以通过例如第一支路22a和第二支路22b来达到，使它们对流体的阻力比第一边路通道24b和第二边路通道24a的大。
图3表示第一气泡阀的储液池处于减压过程中的颗粒分选系统10，此时目标颗粒18b已离开第一边路通道24b和第二边路通道24a之间的容积。致动器26停止激活后，使储液池70a，70b内的压力回到常规的压力下。在该减压阶段，气泡阀的两个储液池70a，70b之间存在负压差，使第一边路通道24b和第二边路通道24a之间通过的液流方向与前幅图中箭头所示的液流方向相反。
图4表示完成了转换顺序的颗粒分选系统10。气泡阀的储液池内的压力相等，使通过测量管16的流体流动趋于正常。因为目标颗粒18b已经发生径向位移，其将流入第一支路22a，而其它的颗粒则继续流入第二支路22b，从而根据预定的性质将颗粒分离开。
检测和选择性地使颗粒发生偏转的这种过程可以每秒钟重复多次，从而高速地分选颗粒。采用所述的流体转换过程时，转换操作可以每秒钟执行到大约几千次之多，达到的分选速率为每小时大约分选百万个颗粒。
根据本发明的另一个实施方案，致动器气泡阀100a和缓冲器气泡阀100b可放置到不同的位置。例如，如图5所示，致动器气泡阀100a与第一边路通道24a和/或缓冲器气泡阀100b与第二边路通道24b可以设置在分支点21的上游。这些元件可设置在任何适当的位置，以使致动器腔室70a和缓冲器腔室70b之间的流动阻力小于任何这些后面的组件与其它压力供源之间的流动阻力。更特别的是，致动器腔室70a和缓冲器腔室70b可设置得使它们之间的流动阻力小于在颗粒流中的所选颗粒与后继颗粒之间的流动阻力。这些组件以这种方式放置，因而防止了由上述使单个所选颗粒发生偏转的方法产生的压力波向上游或者下游传播，以及避免影响颗粒流中其余颗粒的流动。流动阻力之间较大的差异使得具有相关瞬间压力的流控转换操作和系统中剩余部分的流动特性以较高水平分隔开。此外，现场抑制所产生的用于分选的压力脉冲允许实施包含多个转换器40的分选网络，每个转换器与其它的转换器之间液压和气压地隔离开。
根据另一个实施方案，如图6所示，本发明的颗粒分选系统可将任何适合的压力波发生器(代替气泡阀)与一个或多个作为缓冲器的气泡阀，例如阀100b结合使用。例如，压力波发生器260可包含诸如压电柱或步进电机这样的致动器，其具有直接或通过通道系统的偏转而对流动液体起作用的活塞，用以在致动器被信号激活时选择性地使颗粒发生偏转。其它合适的压力波发生器包括电磁致动器、热力气动致动器以及热脉冲发生器，通过施加热脉冲用以在流动液体中产生蒸汽气泡。缓冲器气泡阀100b设置成可吸收由压力波发生器260产生的压力波以防止对颗粒流中其它颗粒的干扰。通过改变缓冲器腔室70b的容积，边路通道24b的横截面面积和/或构成缓冲器腔室70b的弹性膜(图7中附图标记72)的刚性或厚度，可使缓冲器100b的弹性常数根据特定的需要而改变。
图7表示根据本发明的教导，适用于产生压力脉冲来将目标颗粒从颗粒流中的其它颗粒中分离出来和/或起到缓冲器作用以吸收压力脉冲的阀100的实施方案。如图所示，阀100与基板上形成的通向测量管16的边路通道24a或24b相邻近。边路通道24a包括由通道侧壁上的开口形成的流体分界面口17。密封的加压腔室70位于边路通道24a附近并通过流体分界面口与边路通道相连通。所示腔室70由密封壁71和弹性膜72构成。边路通道24a中的载体流在边路通道和腔室之间的分界面形成弯液面25。致动器26压下弹性膜使腔室内的压力升高，使弯液面发生偏转并在载液中形成压力脉冲。
图8表示分选模块50，其具有适当供管52用于提供被分选的颗粒流，以及第一出口管54和第二出口管56，两个出口管都可运载在分选模块50中被分选的颗粒。分选模块50包括检测系统19，用于检测通过供管52进入分选模块50的颗粒，供管52可操作地与转换器40连接用以提供所需的转换性能来分选颗粒。图1中的第一支路22b与第二支路22a可设置成与出口管54第二出口管56流控连接。
图9表示根据本发明另一备选实施方案的颗粒分选系统500，包括多个可以以任何结构连接在一起的分选模块50。例如，该实施方案中的模块50成并联形式。分选模块50的出口管54与第一联合出口58相连接，第二出口管56与第二联合出口60相连接。该分选模块的并联排布形式得到联合的分选模块50系统，其具有的总分选速率为单个分选模块50分选速率的N倍，其中N为所并联的分选模块50的数目。
图10表示根据另一个实施方案的颗粒分选系统550，包括与第二分选模块50b串联的第一分选模块50a。第二分选模块50b用于分选具有预定特性的颗粒，该性质与第一分选模块50a所分选颗粒的预定特性相同或者不同。颗粒流通过供管52进入第一分选模块50a，可含有至少两种类型的颗粒。第一类型的颗粒在第一分选模块50a中分选出，并通过第一出口管54a流出。其余的颗粒通过第二出口管56a流出第一分选模块50a，并通过第二供管52b进入第二分选模块50b。具有其它预定特性的颗粒从该颗粒流分选出来并通过第二出口管54b流出。两种预定特性都不具备的颗粒通过第二出口管56b流出第二分选模块50b。本领域技术人员容易得知，根据所需要的结果，可使用任何适合类型的分选模块50，并以各种方式相连接。
图11表示根据本发明另一个实施方案的高通过量-低误差性分选过程的分级构造。该说明性实施方案为两级颗粒分选系统800，第一步用于分选多个平行的颗粒流，汇集第一步的流出结果，然后在第一步流出结果的基础上实施第二级分选过程。来自颗粒输入腔室88的悬浮液80中的流入颗粒流被分在N个单独的分选通道81a-81n中，每个通道每秒钟能够分选预定数目的颗粒。每个通道81包括检测区域84，用于检测颗粒并识别具有预定特性的颗粒，以及转换区域82，用于将具有预定特性的颗粒与流体中的其它颗粒分离开来，如上面所述。转换区域82根据在检测区域84所测的颗粒特性在该转换区域82形成两股颗粒的流出流“选定”流和“废弃”流。来自每一通道的“选定”流在汇集区域86汇集成一股流，以便在二级分选通道810中再次被分选。如图所示，二级分选通道810根据预定的特性重复检测和分选的分选过程。
假如每个单独通道的分选过程产生某个误选择的误差(y)率(y是颗粒被错误选择的概率，小于1)，则对如图所示的2步分级过程来说分级构造产生更低的错误率y2，或者对n步分级过程来说产生错误率为yn。例如，如果单个通道的错误率为1％，则2步的错误率为0.01％，或者104分之一。
或者，该构造是每个二级通道有M套初级装置，每套初级装置包含N个分选通道。假设在该应用中需要捕获在输入流中存在概率为Z的颗粒，并且单个的通道分选器的每秒最大颗粒分选率为x。系统的通过量为M*N*x个颗粒每秒。每秒聚集在N个通道中的颗粒数目为N*x*z，这样N*z必须小于1以使从N个通道聚集的所有颗粒可以由单个二级通道来分选。为了使通过量高于N＝1/z，必须增加并联的N个初级+1个二级通道。这样总通过量就来自M*N*x并具有M个二级通道。
图12表示根据本发明另一个实施方案的并联-串联颗粒分选系统160。该并联-串联颗粒分选系统160包括第一并联分选模块161和第二并联分选模块162。第一并联分选模块161用于分选多重标记的颗粒，并且分选出具有两种标记物的颗粒并运送到出口通道165。
图13表示另一种并联-串联颗粒分选系统170。第一并联分选模块171分离具有第一标记物的颗粒，收集这些来自于不同通道的颗粒并运送这些具有第一标记物的颗粒通过第一出口通道175。然后所有其它的颗粒被引入第二并联分选器172，用以分选具有第二标记物的颗粒。收集具有第二标记物的颗粒并运送通过第二出口通道176。既不具有第一标记物也不具有第二标记物的颗粒被运送通过第三出口通道177。
根据本发明的一个实施方案，如图14a和14b中所示，颗粒分选系统可包括用于测量颗粒速度、位置和/或尺寸的传感器。对速度、位置和/或尺寸的测量可以与对分选颗粒的分类同时进行或不同时进行。如图11所示，基于并联通道的系统中，不同的通道可具有不同的流动阻力，使每个通道中颗粒或细胞的速度不同。在检测区84与转换区域82以距离L相隔开的系统中，必须已知通道81中颗粒的速度以便设定转换滞后时间T(即相对于检测目标颗粒的时刻滞后的致动转换时间)。
在用于检测细胞或颗粒的大多数光学系统中，在其中细胞引起检测区中的光电检测器发光的区域具有比细胞直径大得多的尺寸。这样，当在检测区域检测到光时，细胞可以在该区域的任何位置，使得难以定位细胞的确切位置。为了提供更精确的检测，可以使光学检测器的多个像素覆盖检测区，但是这样将会造成很高的费用而且需要复杂的支持电子设备。
根据本发明所示的实施方案，可将光掩膜140加到检测区域，以便通过在分选芯片上直接沉积“掩膜图案”，提供对速度的准确检测。可以这样沉积掩膜图案，使掩膜图案的边缘相对于细胞分选致动器区域82定位精确(现有技术精确至＜1um)。当细胞没有被掩膜时，用于捕获检测区84内细胞发出的光的单个光学检测器就可见到光。通过已知长度的掩膜的不透明连接组件“条”中的一个所产生的避光持续时期，可以对速度进行测定。
具有一些尺寸为10um到30um、变化幅度为1um的条141的掩膜图案导致只有尺寸大于细胞的条可以最小化来自于细胞的信号。因此，这样的图案也可以用于测量细胞大小，而不依赖细胞的信号。这样一种“梯度掩膜”也可在光学检测器上产生图案，其可用于多次分析和测量速度以减小速度估计值的偏差。由掩膜140引起的光图案还使检测器能识别掩膜140的每条边缘。如果所有条141都相同，则对每个条的光信号也相同，并且人们只有通过顺序才可以把它们区分开。因此，梯度掩膜图案将使得单个检测器监测到较宽范围的区域(细胞大小的几倍)，从而测量细胞的速度，测量检测区域84内位置精度为1um，其和通道结构以及芯片上致动器的位置相关的准确，以及识别细胞尺寸，其精度由梯度图案决定。梯度掩膜140使检测器能测量这些参数，而与光学系统的放大倍率或光学检测器本身的性质无关。
本领域技术人员应明白，按照本发明的教导，分选系统也可以利用用于测量颗粒尺寸、位置和或速度的其它装置。这些适合的装置对本领域普通技术人员来说是很容易获得并已知的。
根据被发明的另一个实施方案，如图15所示，颗粒分选系统包括不相同分选通道的阵列8000。就空间、光强度利用以及和最佳外部致动器的适配性来说，使用包括一系列不相同的分选器通道810a-810n的并联阵列更为有效率。由于能够准确地感测颗粒的速度，因此在性能检测过程和使具有预定特性的颗粒发生偏转的转换激活过程之间，通道就不需要固定的滞后段。这样就可以改变通道的一些参数，例如检测器84和转换器82之间的距离L，或检测器84与转换器82之间的通路形状。
将单个激光器用作垂直于芯片方向的单波长光源时，需要该激光器照射的区域限定为(通道数目)×((检测区域处通道的宽度)+(内部通道间隔C))(见图15)。然而，能吸收光从而产生荧光的活性区域仅仅是通道面积(通道数目)×(通道宽度)，其得到填充因子为(通道宽度)/(通道宽度+C)。优选接近100％的填充因子以避免浪费有效入射光。
因此，使并联分选系统的通道间间隔最小化对于光检测区域和光学系统的效率来说十分重要。在本发明的可变阵列设计中，如图16所示，在检测区域84中的通道间隔达到了通道的宽度，这样光利用率达到了大约50％。在致动区域82中的通道间隔可以更大，如图16所示。沿通道的致动器26的位置也可以改变以便使外部驱动致动器具有较大的有效半径。
可变阵列8000在选定通道处还可包括用于平衡所有通道的流动阻力的曲径(meander)，这样假如所有通道的压力都降了定值，颗粒的速度也几乎相匹配。这些可以加在所示系统的上游或者下流，即在检测器和致动器之间的区域中。由于通过设计可以得知每个通道的检测区域82I与其致动器26i之间的长度Li，测量颗粒速度与确定哪些颗粒应保留下来可以同时进行，就提供了一种改进的细胞分选系统。
图17表示根据本发明另一个实施方案的颗粒分选系统1700。该颗粒分选系统1700包括多个并联工作的分选模块1701。颗粒分选系统1700包括用于将样品引入各个分选模块的注入区域1710和用于测量检测区域内每个分选通道1702中的颗粒预定特性的检测区域1720。系统还含有转换区域1730，包括在每个分选模块中的致动器，用于将具有预定特性的颗粒与不具有预定特性的颗粒分离开来。如图所示，在图17的实施方案中，检测区域1720中每个分选通道1702之间的分选通道距离小于转换区域1730中通道间距离。检测区域中靠近的间距节约了用激光检测颗粒时的成本，而转换区域1730内较大的距离间隔可适应各种尺寸的致动器。
颗粒分选系统1700还可包括二级分选模块1740，用于根据预定的特性重复检测和分选的分选过程，以提高分选过程的准确度。根据一个实施方案，在初级分选模块1701和二级分选模块1740阵列之间，系统可包括富集区域1750，用于将颗粒从初级分选过程过渡到二级分选过程。根据所示实施方案，富集区域1750对颗粒的过渡是通过在颗粒进入二级分选模块1740之前从颗粒中去除多余的载液来完成的。富集区域1750还可包括水合装置，用于向富集后的颗粒中加入二级载液。富集区域1750可包括插入出口通道1703的膜件，隔断出口通道1703的富集通道，以及将出口通道与富集通道相隔开的膜件。在将所选颗粒送入第二分选模块1740之前，通过膜件去除出口通道1703中所选颗粒流中的过量载液，并将其送入富集通道。
申请号为10/329018，题目为“微流控系统中微流控组件的实现”的美国专利中描述了适用于形成富集区域的系统，在此引入其内容作为参考。
根据所示实施方案，去掉的载液可以再利用并填注回初级通道的入口。回收通道或者其它装置可以将富集区域连接到初级通道，使后面的分选过程可以再利用上述载液。或者，可以在去除废弃颗粒之前将载液中从废弃颗粒中去掉并引入初级通道进口中。
本发明的颗粒分选系统在微流控技术领域具有多种应用。根据一种应用，可以将颗粒分选系统实施于如图18所示药物筛选系统中。如图18所示，药物筛选系统140包括颗粒分选模块10，用于将目标细胞从包含该目标细胞的样品中识别和分离出来。将含有目标细胞的样品由注入通道引入筛选系统，并通过颗粒分选模块，其使目标细胞与剩余样品分离开来并使目标细胞经过混合温育区域141。将测试化合物通过测试通道142引入混合温育区域141并与由颗粒分选子系统10提供的目标细胞接触。然后在检测区域145检测测试化合物对目标细胞产生的效果。
具有颗粒分选器10的说明性药物筛选系统140可以使用多种类型的标记物。该药物筛选系统可使用能测量特定酶的活性的标记物，从而可以用来搜寻对酶存在的通路的调节器。药物筛选系统还可以使用能测量任何细胞内信使/信号和标记物的浓度的标记物，以识别特定细胞类型，特别是稀有的(每一百个细胞中少于一个)类型。例如，适合的标记物包括但不限于，细胞表面标记物，如抗体和重组体显示技术，以及荧光酶底物标记物，细胞内信号结合化合物如Ca++结合荧光染料(Fura-3，Indo-1)，和生物发光酶底物标记物。在荧光酶底物标记物中，化合物进入细胞并被特定的细胞内酶转变成荧光物质。例如用于ALDH酶的Bodipy氨基乙醛或BAAA，用于磷酸酶的MUP(4-methylumbelliferyl phosphate)和用于细胞氧化还原体系的二氢罗丹明123。可用于本发明方法的其它荧光染料的例子包括，在生物发光酶底物标记物中，化合物进入细胞并与特定的胞内酶作用直接发光。通常该技术可与报道基因结合以观察基因的活化。例子包括D-荧光素和相关的报道基因，以及DMNPE和相关的报道基因。
在所示的应用中，可以根据对各种化学和生化体系的效应筛选任何数目的不同化合物。例如可以筛选化合物对阻断、减缓或其它方式抑制与效应不可预料的生化体系相关的关键事件的效应。例如，可以筛选测试化合物阻断体系的能力，该体系造成，或至少部分造成了疾病的发作或疾病出现特殊的症状，包括例如，遗传性疾病，癌症，细菌或病毒感染等等。在这些筛选测定方法中显示了乐观结果的化合物可接着被用于进一步的试验以鉴别对疾病或疾病症状治疗有效的药理学试剂。
或者，可以针对促进，提高或者其它方式引发生化体系的能力筛选化合物，该生化系统具有预期的功能，例如治疗患者中存在的缺陷症。
本发明可用于分离稀有细胞(即组成不到注入样品的0.1％-1％)的各种应用，例如但不限于细胞再植，细胞移植和细胞转染或者再植或移植前的基因修饰。本发明还可用于分离样品中的肿瘤细胞，以用于发展特定治疗法。
本发明还可被用于筛选作用于原生细胞的化合物，例如在通过血液分离(apheresis)获得1011个细胞并且筛选任何亚群而非细胞系。本发明还可以用于筛选作用于不完全细胞系的化合物，其中在该筛选程序中不到100％的细胞系表达了正确的基因。本发明还可被用于筛选对处于特定细胞周期阶段的细胞起作用的化合物，例如，筛选对仅处于复制期的细胞起作用的化合物。
本发明已通过有关说明性实施方案进行了描述。由于在不偏离本发明范围的情况下，上述构造可以做一定的改变，因此上述说明中所包含或附图所示的所有内容只意在解释性说明而并无限制性含义。
还应明白的是，下面的权利要求将包含这里描述的本发明的所有一般和特殊的特征，并且可以说本发明所有要求的范围，作为语言表述，都落在其中。
说明了本发明之后，作为新发明所要求的并被专利许可证保护的内容有
权利要求
1.一种微流控系统，包括基板形成于所述基板上的细胞分选系统，用于基于预定的特性分选细胞；以及形成于所述基板上用于筛选细胞的筛选系统，所述筛选系统具有用于混合具有预定特性的细胞和测试化合物的混合区域，以及用于检测所述测试化合物对具有特定特性细胞的作用的检测区域。
2.如权利要求1的微流控系统，进一步包括在细胞分选系统和筛选系统之间的连接通道，用于将所选定的细胞从细胞分选系统运送到筛选系统。
3.如权利要求1的微流控系统，其中所述细胞分选系统包括用于运送载液中的悬浮细胞流的第一管道，包括入口、第一出口和第二出口；用于检测颗粒的预定特性以及颗粒的尺寸和速度之一的传感器；与第一管道相连通的边路通道；位于所述边路通道附近的封闭腔室，其中载液在边路通道中形成弯液面以将封闭腔室与载液相隔开；以及致动器，当检测器检测到所述预定特性时，该致动器改变封闭腔室内的压力使弯液面发生偏转，借由弯液面的偏转使得具有所述预定特性的细胞流进第二出口，而不具有所述预定特性的颗粒流进第一出口。
4.如权利要求3的微流控系统，其中所述细胞分选系统进一步包括用于吸收第一管道中压力变化量的缓冲器。
5.如权利要求3的微流控系统，其中所述致动器包括加压气体源。
6.如权利要求3的微流控系统，其中所述封闭腔室包括可移动壁。
7.如权利要求5的微流控系统，其中所述致动器包括位移致动器，用于移动所述封闭腔室的可移动壁以改变所述封闭腔室中的压力。
8.如权利要求7的微流控系统，其中所述致动器包括电磁致动器和压电元件中的一种。
9.一种用于筛选测试化合物的系统，包括一种用于将目标颗粒从含有所述目标颗粒的样品中分离出来的颗粒分选系统，所述颗粒分选系统包括用于运送样品的第一管道，包括入口、第一出口和第二出口；用于检测目标颗粒中的预定特性的传感器；与第一管道相连通的边路通道；位于所述边路通道附近的封闭腔室，其中所述第一管道中的载液在所述边路通道中形成弯液面以将所述封闭腔室与所述载液相隔开；以及致动器，当传感器检测到所述预定特性时，该致动器改变封闭腔室内的压力使弯液面发生偏转，借由弯液面的偏转使得具有所述预定特性的颗粒流进第二出口，而不具有所述预定特性的颗粒流进第一出口与所述第二出口连接的混合温育区域，用于接收目标颗粒和测试化合物以及用于将所述测试化合物与所述目标颗粒混合；以及用于检测所述测试化合物对目标颗粒的作用的检测区域。
10.一种测试化合物对靶细胞的作用的方法，包括基于预定的特性分选一组细胞；通过连接通道将具有所述预定特性的细胞运送到混合区域；以及将化合物引入到所述混合区域。
11.一种筛选原生细胞的方法，包括分选一组细胞以将一个细胞亚群从该组中分离出来；将化合物加入所述细胞亚群中；以及分析所述细胞亚群以确定所述化合物对所述细胞亚群的作用。
12.一种分析化合物副作用的方法，包括提供一组原生细胞；将化合物加入所述原生细胞中；测量所述原生细胞以确定由所述化合物引起的活性；将具有活性的原生细胞与不具有活性的原生细胞分离开来。
13.权利要求10所述的方法，其中所述预定特性为存在预期的标记物。
14.权利要求13所述的方法，其中所述预期的标记物为抗体、酶、底物、辅助因子、荧光染料或者报道基因。
15.一种用于筛选化合物对调节细胞活性的能力的方法，其中使所述细胞与测试化合物接触，并且用权利要求1的微流控系统监测所述细胞对所述测试化合物的响应。
16.一种利用微流控系统从细胞群体中分离细胞亚群的方法，包括从具有预期表现型的群体中识别细胞；以及从不具有所述预期表现型的细胞中分离所述细胞。
17.权利要求16所述的方法，其中所述细胞群体为分离的原生细胞培养物。
18.权利要求16所述的方法，其中所述细胞群体为细胞培养物。
19.一种分离用于细胞移植的细胞亚群的方法，包括识别具有预期表现型的细胞；利用微流控装置分离所述细胞；从而分离用于移植的细胞亚群。
20.一种分离将进行遗传修饰的细胞亚群的方法，包括基于预期的表现型识别细胞群体中的细胞亚群；利用微流控装置分离所述细胞；从而分离将进行遗传修饰的细胞亚群。
21.权利要求20的方法，其中所述分离的将进行遗传修饰的细胞被再植入目标中。
22.一种分离细胞亚群的方法，包括识别显示了细胞周期阶段特定标记物的细胞亚群；利用微流控装置分离所述细胞；从而分离处于相同细胞周期阶段的细胞亚群。
23.一种测试化合物对体内酶活性调节能力的方法，包括向细胞群体加入化合物，其中所述化合物被所述细胞酶激活时会发出荧光；以及测量所述细胞荧光以确定所述化合物对调节酶活性的能力。
全文摘要
本发明涉及一种通过毛细尺寸的封闭通道系统来分选颗粒的方法和设备，包括气泡阀，用于选择性地产生压力脉冲以将具有预定特性的颗粒从颗粒流中分选出来。该颗粒分选系统可进一部包括用于吸收所述压力脉冲的缓冲器。颗粒分选系统可包括多个紧密相连的分选模块，它们相结合可进一步提高分选率。颗粒分选系统可包括多级分选装置，用于连续地分选颗粒流，以降低错误率。
文档编号B07C5/00GK1735466SQ03825178
公开日2006年2月15日 申请日期2003年9月16日 优先权日2002年9月16日
发明者J·R·吉尔伯特, S·贝姆, M·德什潘德 申请人:塞通诺米公司