分析物的分离的制作方法

专利名称：分析物的分离的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于分离材料的设备和方法，且更具体地涉及使用高压液相色谱(HPLC)进行分析物的基于尺寸的分离。
发明背景
色谱方法通常通过将混合物溶解到流动相内并使流动相经过固定相来将混合物分离成其组成成分。分离通过混合物的成分在流动相与固定相之间的差异性分开来实现。分析物的混合物可通过利用分析物的固有特性，诸如极性、电荷、功能和大小而色谱分离成离散亚群。
各种色谱方法对于基于尺寸的分析物分离是已知的。最常见的方法利用填充有固体相的钢柱，固体相由二氧化硅或聚合物的球形颗粒组成，球形颗粒的直径通常在约4至17微米范围内。球形颗粒具有变化尺寸的孔。当流动相经过特定固定相时，分析物根据分析物的尺寸以及各孔的尺寸进入各孔。较小的分析物进入比较大分析物更多的孔，且因此往往在柱内驻留更长时间。因此，柱的流出物中较大分析物的浓度往往在过程开始时最大，而流出物中较小分析物的浓度往往在过程稍后时间最大。
基于尺寸的色谱方法包括尺寸排阻色谱法(SEC)、凝胶过滤色谱法(GFC)以及凝胶渗透色谱法(GPC)。尽管这些方法使用广泛，但它们也并非没有缺点。
第一个缺点是色谱柱中的微粒固定相可用作过滤器。某些大分析物可能根本不穿过柱，且因此不被探测到。
第二个缺点是利用色谱柱的分离往往较慢。分离和柱重新平衡通常需要60分钟或更久。理论上，可通过增加流动相的流率来缩短分离时间。但是，最多可缩短适当量的分离时间，因为增加流率会增加固定相上的压力，且增加的压力会压缩多孔颗粒，损坏柱的分离能力。
第三个缺点在于当暴露于具有碱性pH (即大于8的PH)的液体时，基于二氧化硅的固定相中的颗粒开始溶解。另一方面，尽管基于聚合物的固定相可容易地适应更大的PH范围，但某些分析物会被基于聚合物的颗粒吸收。一些分析物和聚合物颗粒的相互亲和性为分离过程引入另外的区分性能，且该过程变为混合模式过程，不再仅基于分析物的大小。
毛细管动力学分级法(CHF)是另一种基于尺寸的分离技术。在CHF中，液体流过长而窄的毛细管。流过毛细管的速度分布是大致抛物线形的(泊肃叶流动)。液体的速度在毛细管中心处最大，并朝向毛细管壁减小，在毛细管壁处液体几乎停滞。注入毛细管内的分析物散布整个毛细管的孔，并经历所有可能的流率。在任何给定时刻，分析物颗粒以最接近其流体动力学中心的流率移动。分析物颗粒的流体动力学中心到毛细管壁的最近路径大致等于颗粒的流体动力学半径。因此较小的分析物会比较大的分析物更靠近毛细管壁，且更靠近毛细管壁时它们的运动受到与毛细管壁相邻的较低液体流率的影响。于是，较大的分析物保持在毛细管内较高流率的附近，并具有比较小分析物高的平均速度。因此较大的分析物首先被洗提并与较小分析物分离。
由于可实现快速分离时间(例如7-10分钟)，所以CHF中缺少颗粒固定相是有利的。但是，CHF技术具有差的分辨率且主要应用于胶体的分离。此外，非常窄的毛细孔(通常具有范围从约I至约10微米的直径)使得难以探测分析物。
CHF尚未发现在诸如蛋白质的生物分子分离中的显著应用，生物分子通常具有比CHF中约0.015至I微米的典型分离范围小的尺寸。
流体动力色谱法(HDC)是基于尺寸的分离技术，该技术包括GPC和CHF两者的元素。HDC利用如GPC中包含颗粒固体相的管状柱。但是,不像GPC中的固体相颗粒，HDC中的颗粒固体相是非多孔的。非多孔颗粒形成液体流动相可到达的间隙空间的网络。间隙空间用于模拟CHF中存在的长毛细管。如CHF中那样，由于沿柱的壁和沿形成间隙空间的非多孔颗粒的表面的泊肃叶流动，在HDC中基于其平均速度分离分析物。
用于HDC的典型分离范围为约0.01-10微米，且主要限制了用于亚微米级的胶体颗粒分析的技术。HDC具有许多与GPC相同的缺点，包括长的分析时间和由于高压可能造成的柱损坏。
流场-流动分馏(FFF)是可应用于生物分子(例如蛋白质)和胶体的尺寸分离技术。分馏装置由约10-50厘米长、1-3厘米宽且0.01-0.05厘米厚的分离通道组成。该通道由上壁和下壁界定，下壁称为“积聚壁”。上壁由可渗透隔膜形成，且下壁是多孔的并由用作分析物的阻挡件的过滤器覆盖。在分离过程期间，液体在通道内沿长度方向层流，具有类似于CHF中存在的抛物线轮廓。同时，从形成上壁的膜发源的垂直于通道长度的流动，形成对流通量。液体穿过积聚壁和通道的远端两者流出通道，分析物探测器定位在通道远端。由通道内垂直交叉流产生的对流通量促进基于其扩散系数的差异进行分析物的分离。如由斯托克斯-爱因斯坦公式定义的，分析物的扩散系数与其尺寸负相关。D=kBT/6 Ji nr,其中D是分析物的扩散系数，kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，η是液体的动态粘度，而r是分析物的流体动力学半径(即分析物的尺寸)。因此基于分析物的扩散系数的分离类似于基于尺寸的分离。
在FFF分离期间，交叉流朝向积聚壁驱动分析物，且分析物浓度随着到积累壁距离的减小而增加。这形成分析物浓度梯度，该分析物浓度梯度触发分析物远离积聚壁并朝向通道中心的扩散，由于抛物线流动分布，在通道中心流率最大。因此，具有较高扩散系数(即较小尺寸)的分析物扩散到通道内流率最大的区域，并比较大颗粒物更早洗提。这解释FFF分离对于生物大分子和亚微米颗粒是有效的，但并不适用于较大的微米大小的颗粒。
FFF是用于基于尺寸分离、尤其是对于生物大分子的分离的相对新的方法。但是，由于需要专用且昂贵的设备，用于基于尺寸分离的FFF应用尚未得到广泛使用。此外，FFF分离相对慢，通常需要一个小时或更久来完成。
几种已知电泳方法能够根据分析物的尺寸分离分析物。这些方法包括凝胶电泳和毛细管电泳。
凝胶电泳利用电场来使分析物运动通过半固体介质，半固体介质最通常由聚丙烯酰胺或琼脂糖组成。用于尺寸分离的凝胶电泳方法大多数应用于诸如蛋白质和核酸的生物分子。这些方法使用普遍，但它们都具有几个缺点。首先，分析物通常在分析之前在苛刻条件下进行预处理。在许多情况下，预处理改变分析物的结构和尺寸，致使尺寸分离结果不精确。第二，凝胶电泳相对劳动密集。第三，分析时间冗长，通常超过2小时。第四，样品输出量低。一般在单个凝胶中可分析仅5-10个样品。
毛细管电泳(CE)是凝胶电泳的替代方式。CE尺寸分离技术利用包含聚合物溶液的窄孔毛细管，聚合物溶液用作施加电场的筛分基体。尽管CE提供比凝胶电泳更高样品输出量和更快分析时间的可能，但CE中的某些尺寸分离结果由于样品、尤其是蛋白质的破坏性预处理而不精确。
分析超速离心法(AUC)是基于离心转动时其沉降速度将不同尺寸的分析物分离的非色谱法。AUC是低输出技术，通常仅能够一次处理几个样品。每次分析需要几个小时。AUC高度专业化的技术，需要在常规使用之前对使用者大量培训。
发明概述
本发明是用于基于分析物尺寸快速且高效分离分析物的方法和设备。
根据本发明的设备包括储液器、分析物探测器、布置成将液体从储液器通过液体路径传送到分析物探测器的泵、以及用于将样品注入液体路径的端口、所有常规部件。该设备的特征在于特别形成的毛细管通道，该毛细管通道构成注入端口下游的液体路径的至少一部分。毛细管通道包括一系列细长段，每个所述段具有平缓直线或曲线形状，其中包含样品的液体流可通过注入端口注入。该系列中每个连续成对的细长段的各细长段沿不同方向延伸并通过液体路径中的弯曲部彼此连接，该弯曲部足够急剧以在弯曲部附近产生液体的非层流流动或对流流动。每个细长段具有上游端和下游端并足够长以允许在细长段上游端的非层流流动消散并在其上游端与下游端之间的位置重新形成层流流动。
在某些较佳实施例中，毛细管通道包括细长管，该细长管由通过急剧的弯曲部彼此连接的一系列细长段组成。细长管可形成成由具有大致矩形投影的圈组成的螺旋形。
在其它较佳实施例中，毛细管通道设置成其中心线大致在一平面内。这些实施例可通过在第一板或微芯片的表面上蚀刻通道并通过面向所蚀刻表面的盖覆盖通道来形成。较佳地，该通道呈包括通过急剧弯曲部连接的一系列细长段的盘旋形。
本发明的另一方面是一种基于尺寸分离分析物的方法。该方法包括:将含有样品的液体泵吸通过细长、毛细液体路径，该样品包括具有不同尺寸的至少两种不同的分析物；以及在毛细液体路径内建立非层流和层流的交替区域，由此加强分析物的分离，因为具有较高扩散系数的较小分析物往往积聚在非层流区域的中心部分，并在重新建立层流流动时进入流体流的更快速流动的中心区域。
非层流区域较佳地通过沿包含样品的液体流动方向的急剧变化形成。层流区域较佳地通过细长毛细液体路径的平缓弯曲或直段形成。
较佳地控制包含样品的液体的流率以允许沿每个平缓弯曲或直段长度的主要部分发生层流。
附图的详细描述


图1是示出根据本发明用于分析物的色谱分离的设备的示意图2是一示意图，示出在分离不同尺寸分析物时扩散和层流的效果；
图3是根据本发明第一实施例的毛细管通道的示意性立体图4是根据本发明第二实施例的毛细管通道的示意性立体图。
较佳实施例的详细描述
根据本发明的分离设备利用开口毛细管通道，即不包含颗粒介质的毛细管通道。开口毛细管通道包括通过角形弯曲部连接的多个直线或曲线段。在本发明的一实施例中，通道可由不锈钢或聚合树脂组成的毛细管形成，聚合树脂例如是称为“PEEK”的聚(芳基-醚-醚-酮)树脂，例如聚(氧-1，4-亚苯基-氧-1，4-亚苯基-羰基-1，4-亚苯基)。在另一实施例中，毛细管通道可在板或芯片的表面上蚀刻而成并通过对板或芯片施加盖来完成。
如图1所示，根据本发明的基本设备由储液器10、常规液体色谱泵12、常规样品注射器14、常规分析物探测设备16以及特别构造的毛细管通道18组成。毛细管通道可采用各种形式中的任何形式，但在每种情况下，其包括通过足够急剧以在弯曲部附近的液体流中引起非层流流动的弯曲部彼此连接的一系列细长段，每个细长段具有平缓直线或曲线形状。本文使用的术语“非层流”流动是指紊流或瞬态流，瞬态流即在层流与紊流之间过度时发生的流动。每个段应当足够长以允许非层流流动在其上游端扩散，并在其上游端与下游端之间的位置重新建立层流流动。较佳地，应当在每个段内与靠近出口端相比更靠近入口端的位置重新建立层流流动，使得在每个段长度的主要部分内存在层流流动。
本发明的设备和方法中的分析物分离是基于扩散原理。如在流场-流动分馏(FFF)技术中那样，如由斯托克斯-爱因斯坦公式定义的，分析物的扩散系数与其尺寸负相关。D=kBT/6nr。简而言之，小分析物具有更大的扩散率，因为它们具有更高的扩散系数。
图2示出了图1的毛细管通道18的一部分，其中如箭头24所示在平缓的直通道段20内发生分析物的混合物在载体液体中的层流流动。箭头的长度指示通道内的大致抛物线速度分布。通道的中心部分内的流率最高，并朝向通道的侧壁逐渐减小。
在弯曲部22(在所示实施例中是90°弯曲部)处，流动变成非层流。液体进入通道的弯曲部分的流动施加矢量力，该矢量力使弯曲部分内的分析物抵靠通道的外壁26集中。但是，由通道段20内的流动施加在分析物上的力被分析物的扩散和由流出弯曲部22到直段20’的流动施加的力抵消。
具有较高扩散系数的较小分析物28更强烈地抵消由液体流动施加到弯曲部的力，且因此朝向毛细管通道的中心更远离毛细管的外壁26移动。另一方面，具有较低扩散系数的较大分析物30往往保持更靠近外壁26。于是，当载体液体和分析物离开弯曲部并行进到段20’内时，较大分析物30集中在通道壁附近，而较小分析物28集中在通道的中心部分。
在到弯曲部的短距离内，重新建立箭头32所指示的层流流动。由于在段20’中层流流动条件下，流动速度在毛细管中心最大且在毛细管壁附近接近零，所以流出弯曲部22的较小分析物28在段20’内达到比较大分析物30大的速度。
当分析物进入毛细管的第二角形部分时，重复该过程，发生较小分析物从较大分析物的进一步分离。通过毛细管通道18的另外的弯曲部和中间的直的或平缓弯曲段的继续流动致使具有高扩散系数的较小分析物与具有较低扩散系数的较大分析物的进一步分离。
毛细管通道较佳地包含大量胶体的直或平缓弯曲端和急剧弯曲部。为了空间的高效利用，通道可以是螺旋形式的管状通道，其中，每个圈的轴向投影是大致矩形形状。矩形螺旋管的实例是图3所示的管34，其具有入口开口 36、大致直段38、90°弯曲部40以及出口开口 42。
矩形圈可紧密堆叠以优化空间使用。矩形/螺旋管34理想地适于用在现有色谱设备中，且管的入口和出口开口可设有用于附连到常规色谱设备的适当配件(未示出)。
如图4所示，可通过在板或微芯片上蚀刻开口通道来形成根据本发明的通道的替代形式。具有矩形横截面的通道44通过在板48的表面46上蚀刻、机加工或其它适当工艺形成并盖上另一板50。该通道由通过弯曲部54连接的一系列细长段52组成。沿板48的边缘形成入口开口 56，且在板50上与通道44的端部60对准的位置形成出口开口 58。该通道大致呈由尖锐直角弯曲部连接的各直细长段组成的盘旋形。通道的中心线、即在通道的横截面中心内纵长延伸的线大致位于一平面内。通道44的功能与图1中通道18和图3的管34内的通道相同。
如果流动的液体用作基准框架，则除了通道端部处的弯曲部，各弯曲部在图3的矩形螺旋构造和图4的平面盘旋构造中都沿相同方向转弯。即，从分析物分子随着毛细管通道内液体一起移动的观点看，所有的圈都是“左旋”圈或者所有的圈都是“右旋”圈。使基本上所有的圈或至少大部分圈沿相同方向有助于将较大分析物分子保持在通道的相同侧上，致使较小分析物分子与较大分析物分子的更有效分离。
用其它通道结构也可实现本发明的某些优点。例如，平坦通道形式可由通过急剧弯曲部彼此连接的交替的平缓弯曲U形段和直段形成。也可利用用于蚀刻通道的各种非平坦构造。
在上述实施例的多个其它变型中也可实现本发明的优点。例如，弯曲部的角度无须是90°角。所有的角度也无须相等。角度只需足够急剧以在通道内载体液体中产生非层流流动区域即可。类似地，直的或平缓弯曲通道段的长度可以变化且无须相等。只需通道段的长度足以在连续弯曲部之间的某些中间点重新建立层流流动即可。毛细管通道的总长度和角形弯曲部以及中间直的或平缓弯曲段的总数量可在宽范围上变化。
毛细管通道的内径应当使得允许在设备的直的或平缓弯曲部分内进行层流流动。通常层流流动由小于2300的雷诺数定义。雷诺数(Re)定义为Re=pQDh/nA，其中P是密度，Q是体积流率，Dh是水力(内)直径，A是横截面面积，且η是动态粘度。较佳地，毛细管通道(如果是圆的)的内径小于2mm。
中间的直的或平缓弯曲段的长度必须足以允许重新建立层流流动。在毛细管内重新建立层流流动之前的长度称为入口长度(Le)，其中对于层流流动Le=0.06Re (Dh)。在本发明中理想的是中间直的或平缓弯曲段的长度至少是入口长度的1.5倍。
有实现特定分离所必须建立的几个变量。将10，000道尔顿的分子与100，000道尔顿的分子有效分离的条件可能无法有效地将300，000道尔顿的分子与1，000，000道尔顿的分子分离。因此，必须经验地建立这些变量。用于设备的变量包括角部分的数量、这些角的大小、中间段的数量以及这些段的长度。过程变量包括流率、载体流体的成分和流体的温度。流率必须足够低以允许在中间直的或平缓弯曲段内进行层流流动。载体流体的成分也很重要，因为其粘度对分析物的扩散系数有影响。此外，将诸如聚乙二醇、聚蔗糖、或者其它相关化合物的添加剂混合到流体中可能由于分子拥挤而进一步影响分离。流体温度也通过影响分析物的扩散系数直接地影响分离并通过改变载体流体粘度间接地影响分离。
权利要求
1.一种基于尺寸分离分析物的设备，所述设备包括: 储液器； 分析物探测器； 泵，所述泵布置成将液体从所述储液器通过液体路径传递到所述分析物探测器； 用于将样品注入所述液体路径的端口；以及 毛细管通道，所述毛细管通道形成所述端口下游的所述液体路径的至少一部分，所述毛细管通道包括一系列细长段，每个所述段具有平缓的直线或曲线形状，在每个所述段内发生包含通过所述端口注入的样品的液体的流动； 其中，所述系列中每个连续成对的细长段的各细长段沿不同方向延伸并通过所述路径中的弯曲部彼此连接，所述弯曲部足够急剧以在所述弯曲部附近产生液体的非层流流动；以及 其中每个所述细长段具有上游端和下游端并足够长以允许在所述细长段上游端的非层流流动消散并在其上游端与下游端之间的位置重新形成层流流动。
2.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细管通道包括细长管，所述细长管由通过急剧的弯曲部彼此连接的一系列细长段组成。
3.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细管通道包括通过急剧弯曲部连接的一系列细长段，所述通道具有大致设置在平面内的中心线。
4.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细管通道具有大致设置在平面内的中心线，且呈盘旋形状，包括通过急剧弯曲部连接的一系列细长段。
5.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细管通道包括形成成螺旋线的细长管，由具有大致矩形投影的各圈组成。
6.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细管通道由第一板的表面内的细长凹陷以及面向所述表面的盖形成。
7.一种基于尺寸分离分析物的方法，所述方法包括: 将含有样品的液体泵吸通过细长、毛细管液体路径，所述样品包含具有不同尺寸的至少两种不同的分析物； 在所述路径内建立非层流和层流的交替区域，由此加强所述分析物的分离。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述非层流区域通过沿包含样品的所述液体流动方向的急剧变化形成。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述层流区域通过所述细长毛细管液体路径的平缓弯曲或直段形成。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，控制包含样品的所述液体的流率以允许沿每个所述平缓弯曲或直段长度的主要部分发生层流。
全文摘要
描述涉及用于基于尺寸分离分析物的开口毛细管通道的构造的方法和设备。开口毛细管通道包含由毛细管的中间直线段或曲线段分开的定义角度的多个转弯。通道的该构造允许基于扩散系数进行分析物区分且因此基于尺寸分离分析物。
文档编号B03B5/52GK103108701SQ201180044834
公开日2013年5月15日 申请日期2011年9月23日 优先权日2010年9月26日
发明者D·奥基弗 申请人:大玉企业有限公司