专利名称：：蛋白质作为燃料中消泡剂成分的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及至少一种疏水蛋白或其衍生物在添加剂组合物或燃料中作为消泡剂的用途、燃料消泡的方法、含有至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂的添加剂和燃料组合物，和生产至少一种燃料组合物的方法。
背景技术：
：烃混合物可作为燃料使用，燃料也可以包括芳香族、粗柴油和煤油，这些化合物具有不好的特性，当将其转移到储藏容器(例如储藏桶和机动车辆的燃料箱)时，它们结合空气而产生泡沫。这导致转移操作阻滞和不令人满意的容器充填。因此通常向柴油机燃料中添加消泡剂。这些消泡剂应该在最小浓度下有活性，并且它们在柴油机燃料在发动机中燃烧的过程中一定不能形成任何有害残渣、或对燃料的燃烧产生不利影响。本专利文献中描述了相应的活性消泡剂。例如，基于硅元素的防沫剂和消泡剂是公知的。例如，DE10313853A公开了有机功能修饰的聚硅氧烷和其用于消除液体燃料(尤其是柴油机燃料)的泡沫的用途。GB-B2173510涉及消除柴油机燃料和喷气式发动机燃料的泡沫的方法，其中向燃料中加入了基于硅聚醚共聚物的防沫剂。消泡剂的一个公知的缺点是其对含水柴油机燃料的消泡能力弱。含水柴油燃料应理解为包含约250ppm的水的柴油机燃料。这些水可能是在储藏桶中进入燃料的凝结水，或在油车运输过程中因为罐中的水未完全排空而引入燃料中的。US5542960也公开酚衍生物(更优选丁香酚)呈现对含水柴油机燃料相对较好的消泡能力。所述消泡剂和从现有技术已知的更多柴油机燃料的消泡剂具有多种缺点。例如，通常聚硅氧烷-聚氧化烯共聚物的硅含量为重量的10-15%、或甚至20-25%。由于有如此高的硅含量的化合物在燃烧过程中会导致在发动机中产生不希望的二氧化硅沉淀，因而需要具有减少硅成分的消泡剂用于柴油机燃料，或者至少改良的防泡和消泡能力以能够减少这些添加剂的使用浓度。已知消泡剂的另一个缺点是它们同添加剂包的匹配性(可混合性)通常很低，这些添加剂被加入粗制柴油中从而提高燃料品质。添加剂包应理解为不同添加剂的均匀混合物，例如含有提高燃烧性能的物质、减少烟雾形成的物质、减少有害废气形成的物质、减少发动机及其部件腐蚀的抑制剂、界面活性物质、润滑油等等。例如，在JP-05132682、GB-2248068和杂志Mineral61technik，37(4)，20中描述了此类添加剂包。添加剂包中的添加剂都被溶解于有机溶剂中形成浓缩储藏液，使用时直接加入到粗制柴油机燃料中。而带有极性基团的消泡剂通常不能均匀掺入这些添加剂包或在储存过程中分离出来。一个可能的方案是具有理想性质的天然存在的添加剂。存在合适品种的物质，例如蛋白质。蛋白质是由氨基酸形成的大分子。这些多肽链的长度范围可以从低于50个(例如10个)氨基酸，直到大于1000个氨基酸。关于蛋白质的作用模式，它们的三维结构是十分重要的。蛋白质的结构可以用一级结构、二级结构、三级结构和四级结构来描述。一级结构指在多肽链内单个氨基酸的排列顺序。二级结构指蛋白质氨基酸的三维排列。三级结构是多肽链的超二级结构的三维排列。其由氨基酸残基(即侧链)之间的作用力和键决定。如果三维排列中多数分子形成超级功能单位，即称为四级结构。两个主要蛋白质组之间存在区别，球状蛋白质的三级或四级结构具有4近似球形或梨形的形状，其通常易溶于水或盐溶液，而纤维状蛋白质具有丝状或纤维状结构，其通常不可溶并属于支持和骨架物质。疏水蛋白是约100-150个氨基酸的小蛋白质，其为丝状真菌(例如普通裂褶菌(^^&印/^//附co/w附朋e))的特征蛋白质。它们通常含有8个半胱氨酸单位。疏水蛋白对于接触面有显著的亲和力，因此适合用于包,皮表面，从而通过形成两亲的膜来改变界面性质。例如，通过用疏水蛋白包被聚四氟乙烯树脂(Teflon)来获得亲水表面。可以从天然来源中分离疏水蛋白。疏水蛋白及其衍生物的制备方法同样是公知的。例如DE102005007480.4公开了制备疏水蛋白及其衍生物的方法。由于疏水蛋白用于包被表面的特殊性质，这些蛋白质很可能用于多种工业应用。现有技术提出疏水蛋白用于多种应用的用途。WO96/41882提出了疏水蛋白作为乳化剂、浓缩剂、表面活性物质、以及用于使疏水表面亲水、改良亲水物质的抗水性、制备水包油乳剂或油包水乳剂的用途。也提出了其在制药(例如生产软膏或乳膏)中的应用，还有在化妆品(例如护肤或生产洗发香波或洗发剂)中的应用。WO96/41882另外要求了包含疏水蛋白的组合物，尤其是药物应用的组合物的权利。EP-A1252516公开了用包含疏水蛋白的溶液在3O-80°C包被窗户、隐形眼镜、生物传感器、医药器械、用于进行实验或储存的器皿、船外壳、固体微粒或载客运输工具的框架或底盘。WO03/53383公开了疏水蛋白用于处理化妆品应用中的角蛋白材料的用途。WO03/10331公开疏水蛋白具有表面活性的性质。例如，公开了疏水蛋白包被的传感器(例如测试电极)，该传感器上非共价连有其他物质，如电活性物质、抗体或酶。WO2004/000880同样公开了用疏水蛋白或者疏水蛋白类物质包#皮表面。也公开了添加疏水蛋白能够稳定水包油或者油包水乳剂。WO01/74864涉及疏水蛋白类蛋白质，也公开了它们可以用于稳定分散体和乳剂。EP05007208.1指出蛋白质(尤其是疏水蛋白或其衍生物)作为反乳化剂的用途。
发明内容基于现有技术，本发明的目标是提供具有好的消泡活性并且硅含量低的消泡剂。本发明的另一个目标是提供不仅具有好的消泡活性、而且还廉价的消泡剂。本发明的另一个目标是提供不仅具有好的消泡活性、而且还廉价和与环境相匹配的消泡剂。根据本发明，通过在添加剂组合物或燃料中使用至少一种疏水蛋白或其衍生物作为消泡剂来实现该目标。使用疏水蛋白或其衍生物的优点在于它们是可生物降解的天然存在的物质，因此不会导致环境污染。而且，其降解形式几乎不产生任何可导致在发动;f几内沉淀的物质。根据本发明，疏水蛋白或其衍生物被用作消泡剂，即减少燃料或燃料组合物的泡沫形成。根据本发明，可以向燃料中单独加入至少一种疏水蛋白或其衍生物作为消泡剂。然而，同样可以将至少一种疏水蛋白或其衍生物与至少另一种用作消泡剂的化合物组合4吏用。同样可以将不同的疏水蛋白或其衍生物组合使用。在本发明的上下文中，疏水蛋白或其衍生物应理解为疏水蛋白或修饰的疏水蛋白。例如，修饰的疏水蛋白可以是疏水蛋白融合蛋白质或者与疏水蛋白的多肽序列至少有60%、例如至少70%、尤其至少80%、更优选至少90%、尤其优选至少95%同一性的蛋白质，并且其满足疏水蛋白生物学性质的程度达到50%、例如60%、尤其70%、更优选80%的蛋白质，所述性质尤其是通过用这些蛋白质包被改变表面特性，即在用这些蛋白质包被玻璃表面之前和之后使水滴的接触角增加至少20。、优选至少25。、尤其至少30°。令人惊讶的，疏水蛋白或其衍生物用作消泡剂时展现良好的结果。关于疏水蛋白的定义，关键是疏水蛋白的结构特异性而不是序列特异性。尽管成熟疏水蛋白的氨基酸序列非常多样化，但是它们都具有8个保守半胱氨酸残基的高度特征性模式。这些残基形成四个分子内二硫键。其N末端和C末端可以在相对大的范围变化。这就允许借助本领域才支术人员已知的分子生物学技术加上长度为10-500个氨基酸的融合配偶体蛋白质。而且，在本发明的上下文中，疏水蛋白及其衍生物也可理解为具有相似结构和同等功能的蛋白质。在本发明中，术语"疏水蛋白"在下文应该理解为具有通用结构式(I)的多肽，其中X可能是任意的20个天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe,亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。在公式中，X可能在各情况下是相同或不同的。X旁边的指数表示各情况下的氨基酸数，C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中C表示的残基中至少4个是半胱氨酸，并且指数n和m表示不依赖于彼此的0-500、优选15-300之间的自然数。公式(I)的多肽也通过该特征来表征，即，在室温、包被玻璃表面之后，与相同大小的水滴和未包被的玻璃表面形成的接触角相比，其可使水滴接触角增加至少200、优选至少25°和更优选30°。指定为d至cs的氨基酸优选为半胱氨酸；但是可以用具有相似空间7充填的其它氨基酸代替它们，优选丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、曱硫氨酸或甘氨酸。然而，d至CS中至少4个、优选至少5个、更优选至少6个和尤其至少7个位点应该由半胱氨酸组成。在本发明的蛋白质中，半胱氨酸可以是还原形式者彼此形成二硫键。尤其优选形成分子内C-C桥，尤其具有至少1个、优选2个、更优选3个和最优选4个分子内二石克键。对于上述以具有相似空间充填的氨基酸代替半胱氨酸的情况，这样的在能互相形成分子内二硫键的配对中C位点是有利于代替的。如果半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸或苏氨酸也被应用于X所指定的位点，那么在通用结构式中单个C位点的数目可以相应的改变。本发明优选应用具有通式(II)的疏水蛋白进行，Xn画C、X3-25-C2-Xo-2-C3曙Xs-5(rC4-X2陽35"C5-X2-l5-C6匿Xo-2陽C7曙X3-35-C8画Xn！(II)其中X、C及X和C旁边的指数与上述定义一致，指数n和m在0-300之间，而且还根据上述接触角的改变来区分蛋白质，并且至少6个指定为C的残基为半胱氨酸。更优选所有C残基都是半胱氨酸。尤其优选应用具有通式(III)的疏水蛋白Xn-Cl-X5-9-C2-C3-Xn-39_C4-X2-23_C5-X5-9-C6_C7-X6.l8-C8-Xm(III)其中X、C及X旁边的指数与上述定义一致，指数n和m是在0-200之间的各个自然数，而且蛋白质的额外特征是上述说明的接触角的变化。Xn和Xm残基可能是天然连接于疏水蛋白的肽序列。然而，也可能其各自或两者都不是天然连接于疏水蛋白的肽序列。这也理解为意指那些Xn和/或Xm残基，其中疏水蛋白中天然存在的肽序列由非天然存在于疏水蛋白中的肽序列而延长。如果xn和/或xm不是天然连接于疏水蛋白的肽序列，此类序列通常长度为至少20个氨基酸，优选至少35个，更优选至少50个和最优选至少100个氨基酸。此类非天然连接于疏水蛋白的残基也指下文中的融合配偶体。这是为了说明所述蛋白质可能由至少一个疏水蛋白部分和一个融合配偶体部分组成，自然条件下它们并不以这种形式共同存在。融合配偶体部分可能选自多种蛋白质。对于多数融合配偶体，其也可能连接一个疏水蛋白部分，例如连接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(XJ。然而，也可能例如两个融合配偶体连接于本发明蛋白质的一个位点(Xn或Xm)。尤其合适的融合配偶体是在微生物、特别是大肠杆菌(ECO/i)或枯草芽孢杆菌(5fl"7/附S"6说l》中天然存在的蛋白质。此类融合配偶体的实例M列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)、和石克氧还蛋白。同样高度适用的是这些序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、优选70-99%、更优选80-98%,或相对于所述序列其中个别氨基酸或核苷酸发生了改变，在各情况中所述百分比基于氨基酸数。还可以例如通过糖基化、乙酰化或其它通过化学交联(例如用戊二醛交联)另外修饰根据本发明作为疏水蛋白或其衍生物使用的蛋白质的多肽序列。根据本发明使用的疏水蛋白或其衍生物的一个特征是当使用所述蛋白包被表面时，该表面性质改变。例如通过测量用蛋白质包被表面前后的水滴接触角并确定两次测量之差，可以试验性确定表面特性的改变。接触角的测量原则上是本领域技术人员所公知的。测量基于室温和5ji1的小水滴。用于测量接触角的合适方法的实例的精确实验条件在实验部分说明。在其中所述的条件下，与未包被的玻璃表面和同样大小水滴的接触角相比，根据本发明使用的蛋白质具有增加接触角至少20。，优选至少25°，更优选至少30。的特性。目前已知的疏水蛋白或其衍生物中，疏水蛋白部分的极性和非极性氨基酸的位置是保守的，导致特征性的疏水性图谱。根据生物物理学性质和疏水性的差异将目前已知的疏水蛋白分为两类，I类和II类(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol"32，413-437)。I类疏水蛋白组装的膜高度不可溶(即使是升高温度在1%的十二烷基硫酸钠(SDS)中也是如此)，并且只能通过浓缩的三氟乙酸(TFA)或甲酸而再次解离。与之相反，II类疏水蛋白的组装形式较不稳定。它们通过60%浓度的乙醇或1%SDS(在室温)即可再次解离。氨基酸序列的比较揭示，在II类疏水蛋白中C3和C4半胱氨酸之间区域的长度明显小于I类疏水蛋白。II类疏水蛋白还比I类疏水蛋白具有更多带电荷的氨基酸。实施本发明尤其优选的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型疏水蛋白，下文的序列表对其进行了结构表征。它们也可能仅为所述类型的部分或其衍生物。也可能将多个相同或不同结构的疏水蛋白部分(优选2个或3个)一起连接于并非天然连接疏水蛋白的相应适宜多肽序列上。实施本发明尤其适合的还有具有SEQIDNO:20、22、24中所示多肽序列的融合蛋白质及其编码核酸序列，尤其是根据SEQIDNO:19、21、23的序列。尤其优选的实施方案还包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通过取代、插入或缺失至少l个至多10个、优选5个、更优选所有氨基酸的5%而衍生的蛋白质，所述蛋白质仍然具有起始蛋白质至少50%的生物学特性。此处蛋白质的生物学特性指上述接触角至少改变20。。合适的融合配偶体是导致由此产生的融合蛋白质能够包被表面和同时抵抗去污剂处理的蛋白质。融合配偶体的实例是例如大肠杆菌中的yaad和yaae，以及石克氧还蛋白。已经发现通过此种途径产生的融合蛋白质有功能上的活性，并且如文中所述，该疏水蛋白不必被解离而是通过三氟乙酸或甲酸将其激活。包含这些融合蛋白质、或将融合蛋白质剪切以后仅包含疏水蛋白的溶液适合直接用于包被表面。在C-或N-末端融合的亲和标签(例如His6、HA、钙调节蛋白-BD、GST、MBD、几丁质-BD、链霉亲和素-BD-Avi-标签、Flag-标签、T7等等)有利于快速和有效的纯化。相应的标准方法可以从亲和标签供应商那里获得。可以利用疏水蛋白和融合配偶体之间的切割位点，从而以非衍生形式释放纯化的疏水蛋白(例如通过在甲硫氨酸的BrCN切割、Xa因子切割、肠激酶切割、凝血酶切割、TEV切割等等)。也可以从连接一种融合配偶体(例如yaad或yaae)和甚至不同序列的多种疏水蛋白(例如DewA-RodA或Sc3-DewA、Sc3-RodA)产生融合蛋白质。同样可以使用具有高达70。/。同源性的疏水蛋白片段(例如N-或C-末端截短)或突变体。在各情况下，根据特定用途(即要消泡的燃料)来选择最佳构建体。可以通过已知的肽合成方法化学，例如通过Merrifield固相合成来制备根据本发明使用的多肽或存在于本发明组合物中的多肽。可以通过合适的手段将天然存在的疏水蛋白从天然来源分离出来。例如可见Wiisten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。优选通过基因工程方法制备融合蛋白质，其中一个编码融合配偶体的核酸序列(特别是DNA序列)与一个编码疏水蛋白部分的核酸序列组合，从而通过组合核酸序列的基因表达在宿主生物体中产生所需要的蛋白质。例如在DE102005007480.4中公开了此类制备方法。此处用于所述制备方法的合适的宿主生物体(生产生物体)可以是原核生物(包括古细菌(/4rc/^ea))或真核生物，尤其是细菌包括嗜盐杆菌(/^/Mflcten'fl)和甲烷球菌(附e^""oo^d)，真菌，昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞，更优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(5fl"7/附附^^m'M附)、米曲霉ofyz—、构巢曲霉(Js/^fg///"^"'V/"/a"s)、黑曲霉045^1^///附"/^|0、巴斯德毕赤酵母(尸/cA/a/;做toWs)、假单胞菌属物种(i^e"^/o柳o""51spec.)、乳酸杆菌(/"cto6flc////)、多形汉逊酵母(H"附efiw/a/w(V附or/^")、里氏木霉(7y7^W^7mi"Mei)、SF9(或相关细胞)等等。在此方法中，使用在调控核酸序列的遗传控制下的、包含编码根据本发明使用的多肽的核酸序列的表达构建体，和包含至少一个这些表达构建体的载体。所用构建体优选包含特定编码序列的5'上游启动子和3，下游终止序列，适用的情况下还包含各自与编码序列有效连接的其他常用调控元件。在本发明中，"有效连接"应理解为启动子、编码序列、终止子和适用情况下的其他调控元件的有序排列，从而使每个调控元件能够实现其表达编码序列所需的功能。有效连接序列的实例为寻乾序列以及增强子、多腺苷酸化信号等等。其它调控元件包含可选标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控序列在例如Goeddel，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，SanDiego,CA(19卯)中描述。除这些调控序列以外，可能在实际结构基因的上游仍存在对这些序列的天然调控，且适用的情况下可对之进行遗传修饰，从而通过关闭天然调控而增强基因表达。优选的核酸构建体最好还包含一个或多个与启动子功能性连接的所谓"增强子"序列，以增强核酸序列的表达。其他有利的序列，例如其他的调控元件或终止子也可插入到DNA序列的3，末端。构建体中可能具有一个或多个拷贝的核酸。如果为筛选所述构建体所需，构建体也可能包含其他标记，例如抗生素抗性或营养缺陷型补偿基因。提出的对制备有利的调控序列为，例如，启动子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq曙T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、X-PR或imlambda-P启动子中，这些启动子最好在革兰氏阴性菌中使用。提出的其他有利的调控序列，例如在革兰氏阳性的启动子amy和SP02,和酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以使用合成的启动子进行调控。为了在宿主生物体中表达的目的，最好将核酸构建体插入例如能够使基因在宿主细胞中最优表达的载体(例如质粒或噬菌体)。除质粒和噬菌体以外，载体也指本领域技术人员所公知的所有其它载体，例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环状DNA，以及农杆菌系统。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。合适质粒是例如在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III"3-Bl、tgtll或pBdCI，在链霉菌(5^印to附j;c^)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在杆菌中的pUB110、pC194或pBD214，在棒状杆菌(Cw^"WffcteW"附)中的pSA77或pAJ667，在真菌中的pALSl、pIL2或pBB116，在酵母中的2a、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或在植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒是可能质粒的一小部分选择。其它质粒是本领域技术人员所公知的，并且能够在例如《克隆载体》(PouwelsP.H.等人编辑Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。为了表达其它存在的基因，核酸构建体还最好包含3，-末端和/或5，-末端调控序列来增强表达，根据宿主生物和基因或所选的基因来选择所述调控序列，以达到最佳表达。这些调控序列旨在控制基因和蛋白质的表达。这意味着取决于宿主生物体，例如基因只在诱导后表达或过表达，或者立即表达和/或过表达。优选调控序列或因子具有正面影响，从而增强被引入的基因的表达。因此，使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)在转录水平增强调控元件是有利的。除此之外，也可能通过例如改良mRNA稳定性来增强翻译。在载体的另一实施方案中，包含核酸构建体或核酸的载体也可能以线性DNA的形式净皮有利地引入微生物中，并通过异源或同源重组的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可能由线性化载体(例如质粒)组成，或仅由核酸构建体或核酸组成。为实现生物中异源基因的最佳表达，最好根据生物中特定的密码子使用来修饰核酸序列。通过计算机评估所研究生物的其他已知基因，可以确定"密码子使用"。将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止信号或多聚腺苷酸信号融合来制备表达盒。为此使用的常规重组和克隆技术见于例如T.Maniatis，E.F.Fritscb和J.Sambrook，分子克隆实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.13Silhavy,M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，现代分子生物学实验方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。为了实现在合适宿主生物体中的表达，最好将重组核酸构建体或基因构建体插入宿主特异性载体中，这可使基因在宿主中最优表达。载体是本领域技术人员所熟知的，并且能够在例如"克隆载体"(PouwelsP.H.等人编辑，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用载体制备例如由至少一个载体转化的可用于生产本发明所用疏水蛋白或其衍生物的重组微生物。最好将上述重组构建体《1入合适的宿主系统并表达之。优选使用本领域技术人员熟知的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等，以引起所述核酸在特定表达系统中表达。合适的系统在例如现代分子生物学实验方法，F.Ausubel等人编辑,WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等人，分子克隆实验室操作手册，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中描述。也可以制备同源重组孩t生物。为此，可制备包括至少一部分所用基因或编码序列的载体，适用的情况下，向所述编码序列中引入至少一个氨基酸缺失、添加或取代，从而改变(例如功能性破坏)该序列("敲除"载体)。引入的序列也可为例如相关微生物的同源物或由哺乳动物、酵母或昆虫来源衍生而来。可选择地，可设计用于同源重组的载体，从而使内源性基因在同源重组时发生突变或其他改变，但仍然编码功能性蛋白质(例如改变上游调控区域由此改变内源性蛋白质的表达)。本发明所用的基因的改变的部分位于同源重组载体中。适合同源重组的载体的构建在例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中描述。原则上，适合此类核酸或核酸构建体的重组宿主生物体是所有原核或真核生物体。最好^f吏用孩i生物例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物体。最好使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选来自肠杆菌科(五"teAacte/7Vicefle)、假单胞菌科(/^g"flto附o"flflfaceflc)、才艮瘤菌科(及A&oA/fl""e)、链霉菌科(5^e/to附j;ce似ceflre)或i若卡氏菌科(A^awYZ/"ceag)的细菌，更优选埃希氏菌属(五sc^n'c/^1)、假单胞菌属、链酶菌属、诺卡氏菌属、伯克霍尔德菌属(5"/^Ao/flfenVi)、沙门氏菌属(5>/附朋6//")、农杆菌属或红球菌属(及/^flto"ccws)的细菌。依据宿主生物体，按本领域技术人员公知的方法生长或培养上述制备融合蛋白质的过程中使用的生物体。微生物通常生长在液体培养基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式例如酵母提取物，或例如硫酸铵等盐类)、微量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)、以及适用情况下的维生素，生长温度在0。C到100。C之间，优选10。C到60。C，同时供以氧气。培养液pH值可以维持在固定值，即在培养过程中可以调节或不调节。可以进行分批发酵、半分批发酵或连续培养。可以在发酵最初开始时引入营养素，或以半连续或连续方式进行随后加料。可以通过实施例中所描述的方法从生物体中分离酶，或者在反应中使用酶粗提物。可以用重组方法制备本发明使用的蛋白质或其功能生物活性片段，通过培养产生多肽的微生物，适用的情况下诱导表达蛋白质，而且从培养液中分离所述蛋白质。如果需要，也可以通过此种方法在工业上生产蛋白质。可以通过已知方法培养和发酵重组微生物。例如细菌可以在20-40。C，pH6-9条件下，在TB培养基或LB培养基中繁殖。合适的培养条件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆:实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中详细描述。如果蛋白质并非分泌至培养基中，那么就要破坏细胞，通过已知的蛋白质分离方法从溶菌产物中获得产品。正如所预期的，可以通过高频超声、高压(例如在弗氏压碎器中)、渗透、使用去污剂、水解酶或有机溶剂、匀浆等手段，或通过多种所列出方法的组合来破坏细胞。可以用已知的层析方法纯化蛋白质，例如分子筛层析(凝胶过滤法)，例如Q琼脂糖层冲斤，离子交换层析和疏水层析，以及使用其它常用方法，例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper,F.G"BiochemischeArbdtsmethoden,VerlagWalterdeGruyter，Berlin,NewYork,或在Scopes,R.，蛋白质纯化，SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。最好通过使用载体系统或寡核苷酸分离重组蛋白质，所述寡核苷酸以某些核苷^列延伸了cDNA，从而编码改变的多肽或融合蛋白质，其可用于例如简化纯化。此类合适的修饰包含作为锚起作用的"标签，，，例如六个组氨酸锚的修饰、或能够作为抗原被抗体识别的表位(例如在Harlow，E.和Lane,D.，1988，抗体:实验室操作手册，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合适的标签是例如HA、钙调节蛋白-BD、GST、MBD;几丁质-BD、链霉亲和素-BD-Avi-标签、Flag-标签、T7等等。这些锚可以用于例如将蛋白质附着在固体载体，例如聚合体基质上，例如可将其填充到层析柱中，或用于孩t孔滴定板或其它载体。可以从商品化的亲和标签供应商那里获得相应的纯化方法。如所述制备的蛋白质可以作为融合蛋白质直接使用或切割和移去融合配偶体后以"纯化的"疏水蛋白使用。当需要移除融合配偶体时，推荐在融合蛋白中疏7K蛋白部分和融合配偶体部分之间掺入潜在的切割位点(蛋白酶的特定识别位点)。合适的切割位点具体包括通过生物信息学工具能够确定的那些否则将既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶体部分中的肽序列。尤其合适的是例如在曱硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介导的Xa因子切割、肠激酶切割、凝血酶切割、或TEV(烟草蚀紋病毒蛋白酶)切割。在本发明中，燃料既指狭义燃料(即内燃机操作中使用的燃料)，也指一般燃料。合适的燃料是中间馏出液和汽油燃料。然而，优选使用中间馏出液。合适的中间馏出液的沸程在120-500。C范围，并选自例如柴油机燃料、煤油或取暖用油。优选的中间馏出液是柴油机燃料。柴油机燃料是例如沸程通常在100-400。C范围的原油萃余液。它们1695%的馏出点通常高达360。C或更高。然而，它们也可以是"超低硫磺柴油"或"城市柴油"，其特征在于例如95。/。的馏出点不超过345。C和硫磺含量以重量计不超过0.005%,或者95%的馏出点不超过285'C和硫磺含量以重量计不超过0.001%。除通过精炼获得的柴油机燃料以外，通过煤的气化或气体液化("气体到液体"(GTL)燃料)获得的柴油机燃料也是合适的。合适的还有上述柴油机燃料与可更新燃料(例如生物燃料或生物乙醇)的混合物。柴油机燃料优选具有低硫磺含量，即硫磺含量以重量计少于0.05%、优选少于0.02%、尤其少于0.005%和特别优选少于0.001%。燃料油也更优选具有低石克磺含量的，例如硫磺含量以重量计至多为0.1%、优选至多为0.05%、更优选至多为0.005%和尤其至多为0.001%。在另一个实施方案中，本发明因此涉及上述至少一种疏水蛋白或其衍生物作为消泡剂的用途，其中燃料是柴油机燃料。根据本发明，至少一种疏水蛋白或其衍生物优选基于燃料以O.Ol-lOOppm，优选0.15-50ppm，更优选0.2-30ppm或0.3-10ppm的量使用。在本申请中，单位ppm指mg/kg。在另一个实施方案中，本发明因此涉及上述至少一种疏水蛋白或其衍生物用于消泡剂的用途，其中至少一种疏水蛋白或其衍生物基于燃料以O.l-lOOppm的量4吏用。根据本发明，燃料、尤其是柴油机燃料可以通过加入至少一种疏水蛋白或其衍生物来消泡。本发明因此也涉及燃料消泡的方法，包括向燃料中添加至少一种疏水蛋白或其衍生物。在另一个实施方案中，本发明涉及上述给燃料消泡的方法，其中燃料是柴油机燃料。在更优选的实施方案中，本发明涉及上述给燃料消泡的方法，其中至17少一种疏水蛋白或其衍生物基于燃料计以0.1-100ppm的量使用。在本发明中，可能将至少一种疏水蛋白或其^f汙生物直接加入到燃料或燃料组合物中，或以添加剂组合物的形式加入。本发明还涉及添加剂组合物，其中除至少一种另外的燃料添加剂以外，包含至少一种疏水蛋白或其衍生物。本发明可能涉及包含至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂的燃料组合物。在另一实施方案中，本发明因此涉及包含至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂的添加剂组合物。在另一实施方案中，本发明可能涉及除至少一种燃料作为主要成分以外、包含至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂的燃料组合物。除至少一种疏水蛋白或其衍生物以外，添加剂组合物或燃料包含至少一种另外的燃料添加剂，尤其是至少一种去垢剂和/或反乳化剂。合适的去垢添加剂和反乳化剂在下面列出。除多种燃料添加剂(例如载体油)，添加剂组合物和燃料也可以包含防腐剂、抗氧化剂、抗静电剂、染料标记等等。然而，添加剂组合物或燃料优选包含至少一种去垢剂和/或反乳化剂，和合适情况下的另外不同的燃料添加剂。在更优选的实施方案中，本发明因此涉及上述添加剂组合物或燃料组合物，其中该组合物包含至少一种去垢剂。在更优选的实施方案中，本发明可能涉及上述添加剂组合物或燃料组合物，其中组合物包含至少一种反乳化剂。在下文中举例列出合适的去垢添加剂。去垢添加剂优选两亲的物质，其具有至少一种平均分子量(Mn)为从85至20000的疏水烃基基团和至少一种极性部分，该极性部分选自(a)具有高达6个氮原子的单氨基或多氨基，其中至少一个氮原子为碱性性质；(b)硝基，合适情况下与羟基结合；(c)与单氨基或多氨基结合的羟基，其中至少一个氮原子为碱性性质;(d)羧基或其碱金属或其碱土金属盐；(e)硫酸基团或其碱金属或其碱土金属盐；(f)聚氧-CV到-C4-亚烷基，其末端为羟基、单氨基或多氨基(其中至少一个氮原子为碱性性质)、或氨基曱酸酯基团；(g)羧酸酯基团；Oi)从琥珀酐衍生的部分，其具有羟基和/或氨基和/或酰氨基和/或亚氨基；和/或(i)通过被取代的酚类与醛和单胺或多胺的曼尼西反应获得的部分。上述去垢添加剂中的疏水羟基基团的平均分子量(Mn)为从85到20000、特别是从113到10000、尤其从300到5000，其确保燃料足够的可溶性。通常的疏水羟基基团，尤其是与极性部分(a)、(c)、(h)和(i)相连接的疏水羟基基团，包括聚丙烯基团、聚丁烯基团和聚异丁烯基团，其各自的Mn为从300到5000、特别是从500到2500、尤其从700到2300。上述去垢添加剂基团的实例包括以下包含单氨基或多氨基(a)的添加剂优选聚烯烃单胺或聚烯烃多胺，基于Mn为从300到5000的聚丙烯或常规(即主要具有内部双键)的聚丁烯或聚异丁烯。当主要使用具有内部双键(通常在p和y位点)的聚丁烯或聚异丁烯作为在制备添加剂中的起始材料时，可能的制备途径是通过氯化和随后的氨基化、或通过用空气或臭氧氧化双键，从而形成羰基或羧基化合物，然后在还原(氩化)条件下进行氨基化。此处氨基化所用的胺可以是例如氨、单胺或多胺，例如二甲胺基丙胺(dimethylaminopropylamine)、乙二胺(ethylenediamine)、二亚乙基三胺(diethylenetriamine)、三亚乙基四胺(triethylenetetramine)或四亚乙基五胺(tetraethylenepentamine)。相应的基于聚丙烯的添加剂具体在WO94/24231中描述。更优选的包含单氨基(a)的添加剂是聚异丁烯的氢化反应产物，其具有与氧化氮或氧化氮和氧的混合物的聚合P平均程度为从5到100，具体在WO97/03946中描述。更优选的包含单氨基(a)的添加剂是从聚异丁烯环氧化物通过与胺反应和随后的氨基乙醇的脱水和还原从而获得的化合物，具体在DE-A19620262中描述。包含硝基(b)的添加剂(合适情况下与羟基组合)，优选聚异丁烯的反应产物，其含有与氧化氮或氧化氮和氧的混合物的聚合P平均程度为从5到100或从10到100，具体在WO96/03367和WO96/03479中描述。这些反应产物通常为纯化的硝基聚异丁烯(例如a，p-二硝基聚异丁烯)和混合的羟基硝基聚异丁烯(例如a-硝基-P-羟基聚异丁烯)的混合物。包含与单氨基或多氨基结合的羟基(c)的添加剂尤其是聚异丁烯环氧化物的反应产物，其能够从具有优选的主要末端双键的聚异丁烯获得，且Mn从300到5000，具有氨或单胺或多胺，具体在EP-A476485中描述。包含羧基或其碱金属或其碱土金属盐(d)的添加剂优选为Q-C4(r烯烃与顺丁烯二酸酐的共聚物，其总摩尔质量为从500到20000，其某些或所有羧基转变为碱金属或碱土金属盐，而且任意剩余的羧基与乙醇或胺反应。此类添加剂具体由EP-A307815公开。此类添加剂主要用于防止阀门磨损，并且如WO87/01126中所述最好与常用燃料去垢剂(例如聚(异)丁胺或聚醚胺)组合4吏用。包含硫酸基团或其碱金属或其碱土金属盐(e)的添加剂优选为烷基磺基琥珀酸的碱金属或碱土金属盐，具体在EP-A639632中描述。此类添加剂主要用于防止阀门磨损，并且最好与常用燃料去垢剂(例如聚(异)丁胺或聚醚胺)组合4吏用。包含聚氧-C2-C4-亚烷基部分(f)的添加剂优选为聚醚或聚醚胺，其通过CrC6。-链烷醇、CVC3。-链烷二醇、单-或二-C2-C3。-垸基胺、d-C3Q-烷基环己醇或d-C3。-烷基酚与每个羟基或氨基1-30摩尔的环氧乙烷和/或环氧丙烷和/或环氧丁烷反应获得，并且在聚醚胺的情况通过随后的与氨、单胺或多胺的还原氨基化而获得。此类产物具体在EP-A310875、EP-A356725、EP-A700985和US4877416中描述。对于聚醚的情况，此类产物也具有载体油的性质。常用实例是丁氧基十三垸醇、丁氧基异十三烷醇、丁氧基异壬基酚、和丁氧基聚异丁醇和丙氧基化物、以及与氨的相应反应产物。包含羧酸酯基团(g)的添加剂优选是单-、二-、或三羧酸与长链烷基醇或多元醇形成的酯，尤其是在10(TC具有最小粘度2mm2/s的酯，具体在DE-A3838918中描述。所用的单-、二-或三羧酸可以是脂肪族或芳香族酸，尤其合适的乙醇酯或多元醇酯是代表性的例如含有6-24个碳原子的长链。通常代表性的酯类是异辛醇、异壬醇、异癸醇和异十三醇的己二酸酯、邻苯二曱酸酯、间苯二酸酯、对苯二酸酯和偏苯三酸酯。此类产物也具有载体油的特性。包含从琥珀酐衍生的具有羟基和/或氨基和/或酰氨基和/或亚氨基的部分(h)的添加刑优选为聚异丁烯琥珀酐的相应衍生物，其通过具有Mn=300-5000的聚异丁烯与顺丁烯二酸酐以热途径或含氯的聚异丁烯进行常规反应或强反应而获得。尤其感兴趣的是向衍生物附加脂肪族聚胺，例如乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺或四亚乙基五胺。具有羟基和/或氨基和/或酰氨基和/或亚氨基的部分是例如羧酸基团、酰胺、二-或聚胺的酰胺(除酰胺功能以外，其还具有游离胺基团)、具有酸和酰胺功能的琥珀酸衍生物、单胺的羧二酰亚胺(carboximide)、二胺或多胺的羧二酰亚胺(除亚胺功能外，还具有游离胺基团)、和二酰亚胺(通过二-或多胺与两个琥珀酸衍生物反应形成)。此类燃料添加剂具体在US4849572中描述。包含通过取代的酚类与醛和单胺或多胺的曼尼西反应获得的部分(i)的添加剂优选为聚异丁烯-取代的酚与甲醛和单胺或多胺(例如乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺或二甲胺基丙胺)的反应产物。聚异丁烯-取代的酚可以通过具有Mn=300-5000的聚异丁烯的常规反应或强反应而获得。此类"聚异丁烯-曼尼西碱"具体在EP-A831141中描述。为了更精确地分别详细定义燃料添加剂，此处明确地参考上述现有技术的公开文件。尤其优选来自(h)组的去垢添加剂。这些具体为聚异丁烯-取代的琥珀酰亚胺，尤其是带有脂肪族多胺的亚胺。适合本发明的反乳化剂的实例包括如下。乳化剂是^1起乳剂分层的物质。它们可以是在相界面有效的离子型或非离子型物质。相应地，所有表面活性物质原则上是合适的反乳化剂。尤其合适的是选自阴离子活性化合物，例如烷基-取代酚和萘磺酸盐的碱金属或碱土金属盐、和脂肪酸的碱金属或碱土金属盐，还有不带电荷的化合物，例如烷氧乙醇例如乙氧基乙醇、烷氧基酚例如乙氧基叔丁酚或乙氧基叔戊酚、脂肪酸、垸基酚、环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的缩合物(例如也以EO/PO的嵌段共聚物)、聚乙烯亚胺或聚硅氧烷的形式。添加剂组合物和燃料又可以与另外的常用成分和添加剂组合。此处应提到，例如没有标记的去垢剂作用的载体油，它们尤其在使用汽油燃料的情况下使用。然而，它们有时也在中间馏出液中使用。在下述实施例中列出合适的载体油。合适的矿物载体油是在原油加工过程中获得的部分，例如具有例如SN500-2000级粘度的光亮油或基础油；还有芳香族烃、石蜡族烃和烷氧基链烷醇。同样有用的是在矿物油精制的过程中获得的部分，已知为"加氢裂化油"(具有沸程在约360-500。C范围的真空馏分，获自在高压下催化氢化反应和异构化和去石蜡化的天然矿物油)。同样合适的是上述矿物载体油的混合物。用于本发明的合成载体油的实例选自聚烯烃(聚-a-烯烃或聚内烯烃)、(聚)酯、(聚)烷氧基酯、聚醚、脂肪族聚醚胺、烷基酚-起始的聚醚、烷基酚-起始的聚醚胺和长链烷基醇的羧酸酯。合适的聚烯烃的实例是Mi^400-1800的烯烃聚合物，尤其是基于聚丁烯或聚异丁烯(氢化或非氢化的)。合适的聚醚或聚醚胺优选为包含聚氧-C2-C4亚烷基部分的化合物，通过CVC6。-链烷醇、OC3。-链烷二醇、单-或二-CrC3。-烷基胺、Q-C3。-烷基环己醇或CrC3。-烷基酚与每个羟基或氨基1-30摩尔的环氧乙烷和/或环氧丙烷和/或环氧丁烷反应获得，并且在聚醚胺的情况通过随后的与氨、单胺或多胺的还原氨基化而获得。此类产物具体在EP-A310875、EP-A356725、EP-A700985和US4,877,416中描述。例如，所用的聚醚胺可以是聚-CrCV环氧烷胺或其功能性衍生物。其常用实例是丁氧基十三烷醇、丁22氧基异十三烷醇、丁氧基异壬基酚、和丁氧基聚异丁醇和丙氧基化物、以及与氨的相应反应产物。长链烷基醇的羧酸酯的实例具体是单-、二-、或三羧酸与长链烷基醇或多元醇形成的酯，具体在DE-A3838918中描述。所用的单-、二-或三羧酸可以是脂肪族酸或芳香族酸；合适的乙醇酯或多元醇酯特别是代表性长链，例如具有6-24个碳原子。通常代表性的酯类是异辛醇、异壬醇、异癸醇和异十三醇的己二酸酯、邻苯二曱酸酯、间苯二酸酯、对苯二酸酯和偏苯三酸酯。更合适的载体油系统在例如DE-A3826608、DE-A4142241、DE-A4309074、EP-A0452328和EP-A0548617中描述，它们明确地在此引用作为参考。尤其合适的合成载体油的实例是乙醇一起始的聚醚，其具有约5-35、例如约5-30个C3-CV环氧烷单位，例如选自环氧丙烷、环氧丁烷和l，l-二甲基环氧乙烷单位、或其混合物。合适的起始乙醇的非限制性实例是长链烷基醇或以长链烷基取代的酚，其中长链烷基基团具体为直链或分支的CVd8-烷基基团。优选的实例包括十三烷醇和壬烷基酚。更合适的合成载体油是如DE-A10102913.6中所述的烷氧基烷基酚。合适的情况下，本发明的组合物可以包含其它共添加剂。更常用的添加剂是改良燃料寒冷性质的添加剂，例如成核剂、流动改良剂、石蜡介軟剂和其混合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；防腐剂，例如基于有机羧酸的铵盐，所述盐易形成薄片，或在有色金属防腐的情况下基于杂环芳香族；去浊剂(dehazers);消泡剂，例如某些硅氧烷化合物；十六烷改良剂(点火改良剂)；助燃剂；抗氧化剂或稳定剂，例如基于胺例如(对)-苯二胺、二环己基胺或其衍生物，或基于酚例如2，4-二叔丁基酚或3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸；抗静电剂；茂金属例如二茂络铁；三羰基甲基环戊二烯锰；润滑性改良剂，例如特定脂肪酸、烯基琥珀酸酯、双(羟烷基)脂肪胺、羟基乙酰胺或蓖麻油；和染料(标记)。合适情况也加入胺从而降低燃料的pH。当使用去垢添加剂(例如具有极性部分(a)到(i))时，其通常以重量计10-5000ppm，尤其是以重量计50-1000ppm，更优选以重量计25-500ppm的量加入燃料中。当使用反乳化剂时，通常以以重量计0.1-100ppm，尤其是以重量计0.2-10ppm的量加入到燃料中。如果需要，其它所述成分和添加剂以所用目的的常用量加入。当本发明的添加剂组合物包含去垢添加剂时，其优选以基于组合物总重计1-60%，优选以重量计1-50%，更优选以重量计1-40%,尤其是以重量计1-15%的量存在。当本发明的添加剂组合物包含反乳化剂时，其优选以基于组合物总重量计0.01-5%,更优选以重量计0.01-2.5%和尤其是以重量计0.01-1%的量存在。合适的情况，本发明的组合物也可以包含溶剂或稀释剂。合适的溶剂或稀释剂是例如芳香族烃和脂肪族烃，例如Cs-d。-烃，例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、它们的结构异构体和混合物；石油醚，芳香族例如苯、曱苯、二甲苯和溶剂石脑油；具有3-8个碳原子的烷基醇，例如丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇等等，与烃溶剂组合；和烷氧基烷基醇。合适的稀释剂还有例如原油加工过程中获得的组分，例如煤油、石脑油或光亮油。在中间馏出液、特别是在柴油机燃料和燃料油的情况优选使用的稀释剂是石脑油、煤油、柴油机燃料、芳香族烃例如重溶剂石脑油、Solvesso或Shellsof，还有这些溶剂和稀释剂的混合可以将各成分分别加入燃料、或加入常规燃料组合物中、或作为预先制备的浓缩剂(添加剂包；添加剂组合物)。本发明还涉及生产至少一种燃料组合物的方法，其中燃料或燃料组合物是(a)与至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种其它燃料添加剂混合，或24(b)与上述添加剂组合物混合。疏水蛋白或其衍生物在燃料消泡方面有很好的特性。本发明在下文以实施例说明。实施例实施例1克隆vaad-His^/vaaE-His^的准备工作用寡核普酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是枯草芽孢杆菌基因组DNA。获得的PCR片段包含枯草芽孢杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列，和分别在其末端的Ncol和BglII限制性切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到来自Qiagen的载体pQE60中，该载体预先用限制性内切酶Ncol和BglII线性化。这样获得的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可以用于表达含有YAAD::HIS6或YAAE::HIS6的蛋白质。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc实施例2vaad疏水蛋白DewA-His^的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是构巢曲霉基因组DNA。获得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位点。纯4匕PCR片段，并用限制性内切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到载体pQE60YAAD#2中，该载体预先用限制性内切酶BglII线性化。这样获得的载体#508用于表达含有YAAD::Xa::dewA::HIS6的融合蛋白质。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC实施例3vaad疏7jc蛋白RodA-His^的克隆质粒#513的克隆类似于质粒#508，4吏用寡核苷酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG实施例4vaad疏水蛋白BASF1-His6的克隆质粒#507的克隆类似于质粒#508,使用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列(疏水蛋白BASF1)(见附录SEQIDNO.11和12)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例5vaad疏水蛋白BASF2-His6的克隆质粒#506的克隆类似于质粒#508，^f吏用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列(疏水蛋白BASF2)(见附录SEQIDNO.13和14)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例6vaad疏水蛋白SC3-His^的克隆质粒#526的克隆类似于质粒#508，使用寡核苷酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是裂褶菌(Schyzophyllumcommune)的cDNA(见附录SEQIDNO.9和10)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT实施例7vaad疏水蛋白DewA-His[重组大肠杆菌菌株的发酵将含有表达yaad疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌菌林的3mlLB液体培养基接种于15mlGreiner管中。于37。C在振荡器上以200rpm培养8小时。将1ml此预培养液各自接种于2个1升的有塞子锥形瓶中的250mlLB培养基中(+100ng/ml氨苄青霉素)，在37。C以180rpm振荡培养9小时。将0.5升的预培养液(相对于水测量OD6。一1:10)接种于13.5升的LB培养基(+100ng/ml氨苄青霉素)中，置于20升的发酵罐。在OD6()。nm约3.5时添加140ml的100mMIPTG。3小时以后，将发酵罐冷却到10。C，并通过离心除去发酵液。将细胞沉淀用于进一步的纯化。实施例8重组疏水蛋白融合蛋白的纯化(带有C-末端His6标签的疏水蛋白融合蛋白的纯化)100g的细胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸钠緩沖液补足到总体积为200ml，并将沉淀重悬。悬浮液用T25型高速分散器Ultraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)处理10分钟，随后为了降解核酸，再与500单位Benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室温培育1小时。在破坏细胞之前使用玻璃萃取柱(P1)进行过滤。为了破坏细胞和剪断剩余的基因组DNA，用匀浆器在1500巴进行2个匀浆循环(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。将匀浆液离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4。C，12000rpm，23000g)，上清置于冰上，用100mlpH7.5的磷酸钠緩沖液重悬沉淀。重复3次离心和重悬，在第3次重复时磷酸钠緩沖液中包含1%SDS。重悬以后，将混合物搅拌l小时，然后进行最终离心(SorvallRC-5B,GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4。C，12000rpm，23000g)。根据SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最终离心后的上清液部分(图1)。实验显示疏水蛋白可能以包涵体的形式存在于相应大肠杆菌中。将50ml含疏水蛋白的上清液应用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液平衡的50ml镍-琼脂糖高性能17-5268-02柱(安玛西亚公司(Amersham))。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗柱，随后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗脱疏水蛋白。为了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液透析。图1描述所制备的疏水蛋白的纯化A泳道应用于镍-琼脂糖柱的溶液(l:10稀释)B泳道流出液=清洗步骤的洗脱液C-E泳道洗脱级分的OD280峰(WP1、WP2、WP3)F泳道显示所用的标记。图1的疏水蛋白分子量约为53kD。一些较小条带代表疏水蛋白的降解产物。实施例9性能测试疏水蛋白改变水滴在玻璃上接触角的特性基质玻璃(窗玻璃，SiiddeutscheGlas，Mannheim):-疏水蛋白浓度100pg/ml醋酸钠+0.1%吐温20中培育过夜(温度80。C)-随后在蒸馏水中清洗包被-然后于80'C在1。/。十二烷基石克酸钠(SDS)的蒸馏水溶液中培育10分钟-在蒸馏水中清洗样品在空气中干燥，且测定5pl水滴的接触角(以度为单位)。用Dataphysics接触角系统OCA15+仪器，软件为SCA20.2.0.(2002年11月)测量接触角。根据制造商的说明书进行测量。未处理的玻璃接触角为30±5°，以根据实施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA國his6)包被的玻璃接触角为75±5。。实施例10疏水蛋白浓缩物(KmfZ-i/gM^-及^)作为消泡剂的用途通过如下的手摇泡沫测试来对消泡进行改良-将100ml燃料或添加剂燃料引入到250ml密封的有盖玻璃瓶中；-将样品振荡2分钟；-然后立即放下样品，测定泡沫体积(ml)和泡沫分解时间(秒)。为实验的目的，使用疏水蛋白浓缩物(1^/-^^^-丑&({,作为溶解于NaH2PO4緩沖液(50mmol/L，pH7.5)的溶液)。起始样品疏水蛋白浓度为6.1mg/ml。将2mL起始样品补至100ml(Hyd.sol.1)，将3mL得到的溶液加入97mL燃料(EN590燃料)中。在下面的表中给出重复过的实验结果。用量DK根据R印sol的泡沫体积破坏时间无添加剂9761018Hyd.sol23mL97600在添加疏水蛋白浓缩物的情况下，泡沫的量和泡沫分解时间比不包含任何疏水蛋白的柴油机燃料低。在序列表中DNA和多肽序列的序列命名<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>权利要求1.至少一种疏水蛋白或其衍生物在添加剂组合物或燃料中用作消泡剂的用途。2.根据权利要求l的用途，其中该燃料是柴油机燃料。3.根据权利要求1和2的任一项的用途，其中至少一种疏水蛋白或其衍生物以基于燃料从0.1到100ppm的量使用。4.燃料消泡的方法，其包括向燃料中添加至少一种疏水蛋白或其衍生物。5.根据权利要求4的用途，其中该燃料是柴油机燃料。6.根据权利要求4和5的任一项的方法，其中至少一种疏水蛋白或其衍生物以基于燃料从0.1到100ppm的量使用。7.添加剂组合物，其包含至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂。8.燃料组合物，其在包含除至少一种燃料作为主要成分之外，还包含至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂。9.根据权利要求7和8的任一项的添加剂组合物或燃料组合物，其中该组合物包含至少一种去垢剂。10.根据权利要求7到9的任一项的添加剂组合物或燃料组合物，其中该组合物包含至少一种反乳化剂。11.产生至少一种燃料组合物的方法，其中燃料或燃料组合物是与以下混合(a)至少一种疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂，或(b)根据权利要求7、9或10的添加剂组合物。全文摘要本发明涉及疏水蛋白或其衍生物在添加剂组合物或燃料中作为消泡剂的用途、燃料消泡的方法、含有疏水蛋白或其衍生物和至少一种另外的燃料添加剂的添加剂和燃料组合物，和制备燃料组合物的方法。文档编号C10L1/24GK101326271SQ200680046091公开日2008年12月17日申请日期2006年10月9日优先权日2005年10月12日发明者D·波塞尔特,H-G·勒迈尔,J·卡尔,M·考罗什,S·哈默,T·萨布科夫斯基申请人:巴斯福股份公司