用光合生物生产有机产物的方法及其产物和组合物的制作方法

专利名称：用光合生物生产有机产物的方法及其产物和组合物的制作方法
用光合生物生产有机产物的方法及其产物和组合物交叉参考本申请要求美国临时申请号60/971，418、60/971，412(两者于2007年9月11提 交)、60/973，924(2007年9月20日提交)和61/130，892 (2008年6月2日提交)的权益， 这些申请通过引用并入本文。
背景技术：
燃料产品，如油料、石油化学产品及对石化产品生产有用的其它物质，对它们的需 求不断增长。当今大多数燃料产品是从化石燃料中生产的，所述化石燃料被认为是不可再 生的能量来源，因为它们是有机物质在上百万年的过程中被连续的沉积层覆盖的结果。也 存在增长的减少对进口原油依赖的期望。关于污染和环境危害的公共意识也已经提高。因 此，对生产燃料产品的替代方法，已经存在增长的兴趣和需要。所以，对开发燃料产品的替 代方法存在紧迫的需要，所述燃料产品是可再生的，可持续的，并且对环境危害较小。通过引用并入本说明书中提到的所有出版物和专利申请在此通过引用被并入，其程度如同每一 份单独的出版物或专利申请被特定且单独地指明通过引用而并入。发明概述本文公开的是一种组合物，其包括包含氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳原子 为所述组合物重量的至少80%，并且其中组合物的δ 13C分布为小于-32%。。在一些情况 下，组合物进一步包括异戊二烯单元。对于本文描述的一些组合物来说，氢和碳原子为组合 物重量的至少90%。仍在另外的组合物中，氢和碳原子为组合物重量的至少95%或99%。 而在另外的组合物中，氢和碳原子为组合物重量的100%。在一些情况下，组合物为液体。 在另外的情况下，组合物是燃料添加剂或燃料产品。在一些实施方式中，组合物是萜。在其 他实施方式中，组合物不是脂肪酸或脂肪酸酯。在一些实施方式中，组合物的δ 13C分布小 于-35%。或小于-40%。。在其他情况下，组合物的辛烷值为85-120。仍在其他情况下，组合 物的辛烷值大于90。本文还描述的是包括组合物和燃料成分的燃料产品，所述组合物包括含有氢和碳 原子的分子，其中所述氢和碳原子为所述组合物重量的至少80%，并且其中所述组合物的 δ 13C分布小于-32%。。在一些情况下，燃料成分是调合燃料，其可以是矿物燃料、燃料调合 的混合物、汽油、柴油、乙醇、喷气式发动机燃料或其任何组合。仍在另外的情况下，调合燃 料具有大于-32%。的δ 13C分布。对于本文描述的一些燃料产品来说，燃料成分是燃料添加 剂，其可以是ΜΤΒΕ、抗氧化剂、抗静电剂、缓蚀剂和它们的任何组合。在一些情况下，组合物 成分进一步包括异戊二烯单元。在另一情况下，氢和碳原子为组合物成分重量的至少90%。 仍在另外的情况下，氢和碳原子为组合物成分重量的至少95%或99%。而在另外的情况 下，氢和碳原子为组合物成分重量的100%。对于一些燃料产品来说，组合物成分是萜。在 一些实施方式中，组合物成分为液体。在另外的情况下，组合物不是脂肪酸或脂肪酸酯。在 另一情况下，组合物不是甲烷。本公开进一步提供了产生二氧化碳的方法，其包括燃烧组合物因而产生二氧
5化碳，其中所述二氧化碳具有小于_32%。的δ 13C分布。在一些情况下，二氧化碳具有小 于-35%。的δ 13C分布。在另外的情况下，二氧化碳具有小于_40%。的δ 13C分布。燃烧步 骤可以在汽油发动机、在柴油发动机或在喷气式发动机中进行。在一些实施方式中，方法进 一步包括从无维管光合生物中提取组合物。公开的方法可以进一步包括上调生物中酶的步 骤，其中所述酶的产物为所述组合物。在一些情况下，所述酶不是自然存在于生物中。本文提供的另外的方法是标记组合物的方法，其包括获得组合物的δ 13C分布的 测量；并且利用该测量标记组合物。在一些实施方式中，标记包括指示组合物的S13C分布 以及组合物的S 13C分布的测量小于-32%。。在一种情况下，组合物为可以包括燃料成分的 燃料产品。在一些方面，本文描述的方法可以进一步包括跟踪组合物的步骤。在一些情况下， 跟踪包括1)将未知组合物的碳同位素分布与测量进行比较；2)确定组合物的位置，和/ 或3)用计算机系统检测所述组合物。本公开也提供了从无维管光合生物产生燃料产品的方法，其包括培养无维管光 合生物，其中所述生物产生第一燃料产品；使所述生物与无机碳源接触；以及使来自无机 碳源的碳掺入第一燃料产品中，其中所述第一燃料产品具有小于-32%。的δ 13C分布。在一 些情况下，无机碳源包括含有13C的二氧化碳和含有12C的二氧化碳。在一些情况下，使生 物与无机碳源接触包括使生物与过量的无机碳源接触。在一些实施方式中，生物包括一个 或多个核酸，所述一个或多个核酸编码终产物为第一燃料产品的一种或多种酶。在另外的 实施方式中，核酸是异源的。第一燃料产品可以不是由生物天然产生的。在一些情况下，第 一燃料产品具有小于-32%。的δ 13C分布。在另外的情况下，第一燃料产品包括萜。矿物燃 料无机碳可以具有大于-32%。的δ 13C分布。在一些实施方式中，第一燃料产品从生物中提 取。第一燃料产品可以经历裂化。在一些情况下，本文的方法进一步包括向第一燃料产品 添加燃料成分。在一些情况下，这些方法进一步包括燃烧第一燃料产品和产生富S 13C的无 机碳。在一些情况下，该富S 13C的无机碳具有小于-32%。的δ 13C分布。本文还提供了出售碳信用额(carbon credit)的商业方法，其包括获得组合物 的S13C分布的测量；和将组合物的δ 13C分布与参照δ 13C分布进行比较；如果组合物的 δ 13C分布小于参照δ 13C分布，那么出售碳信用额给实体，其中所述实体是组合物的所有者 或使用者。在一些情况下，参照δ 13C分布为大约-32%。。该方法可以进一步包括利用测量 标记组合物。该方法可以进一步包括跟踪组合物。如本文公开的产生燃料产品的方法包括培养无维管光合生物；使所述生物与烟 道气接触；将来自所述烟道气的碳掺入燃料产品中；和从所述无维管光合生物中提取所述 燃料产品。在一些情况下，该方法进一步包括基因修饰生物的步骤。在另外的情况下，燃料 产品不是自然存在于生物中。燃料产品可以包括含有氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳 原子为该产物重量的至少90%，并且其中组合物的δ 13C分布为小于-32%。。在一些情况 下，方法包括精炼燃料产品的步骤。在一种情况下，精炼包括选自下述的至少一种方法加 氢裂解、催化裂化、蒸汽裂解、裂化、分馏、蒸馏、加氢处理和其任何组合。附图简述本发明的许多新特征在所附的权利要求中具体阐明。参考下面提出说明性实施方 式——其中使用了许多本发明的原理——的详细描述，和附图，将使本发明的示例性特征和益处得到更好的理解，在附图中

图1是核酸构建物的图示。图2示出了用苧烯合酶转化的莱茵衣藻(C. reinhardtii)的蛋白质印迹分析。图3示出了用苧烯合酶转化的莱茵衣藻的气相色谱_质谱分析。图4示出了用FPP合酶和倍半萜合酶转化的莱茵衣藻的蛋白质印迹分析。图5总结了测量各种样品化合物——包括农作物植物、气体样品、原油以及藻类样 品的S 13C分布的实验结果。发明详述I.产品本文公开的是涉及利用光合生物制造产品的组合物和方法。产品的实例包括但不 限于，燃料产品、香料产品以及杀虫剂产品。产品可以是释放分子储存能量的任何物质。在 一个实施方式中，产品是有机分子。在另一实施方式中，产品是烃。在一些情况下，产品不 包括氢。在一些情况下，产品不包括氧。在一些情况下，产品不包括抗体或蛋白质。在一些 情况下，产品不包括脂肪酸。燃料产品的实例包括石化产品和它们的前体以及可能石化工业中有用的所有其 它物质。燃料产品包括，例如，石油产品和石油产品的前体，以及它们的石化产品和前体。燃 料产品可以用于产生用于石化工业的物质或材料，包括石油产品和石化产品。燃料或燃料 产品可以用于燃烧器如锅炉、窑炉、干燥机或熔炉。燃烧器的其它实例是内燃机如汽车引擎 或发电机，包括汽油发动机、柴油发动机、喷气式发动机及其它。燃料产品也可以被用于生 产塑料、树脂、纤维、高弹体、润滑剂和凝胶。本文考虑的产品的实例包括烃产品和烃衍生物产品。烃产品是只由氢分子和碳分 子组成的产品。烃衍生物产品是具有一个或多个杂原子的烃产品，其中杂原子为不是氢或 碳的任何原子。杂原子的实例包括但不限于，氮、氧、硫和磷。一些产品是富烃的，其中按重 量计，产品的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%由碳和氢组成。在一个实施方式 中，产品是按重量计100%的碳和氢原子。在一些实施方式中，产品包括萜。在其它的实施 方式中，产品包括脂肪酸或脂肪酸甲酯。燃料产品如烃，可以是通常源自原油或石油的前体或产品，例如，但不限于，液态 石油气、石脑油(naptha)(轻石油)、汽油、煤油、柴油、润滑油、重瓦斯(heavy gas)、焦炭、 浙青、焦油和蜡。例如，燃料产品可以包括小的烷类(例如，1至大约4个碳)如甲烷、乙烷、 丙烷或丁烷，其可以用于加热(如在烹饪中)或制造塑料。燃料产品也可以包括具有大约 5至大约9个碳原子的碳主链的分子，如石脑油或轻石油，或它们的前体。其它的燃料产品 可以是用作汽油或发动机燃料的大约5至大约12个碳原子或环烷。大约10至大约18个 碳的分子或芳香族如煤油或其前体，也可以是燃料产品。燃料产品也可以包括具有大于12 个碳的分子或它们的前体，如用于润滑油。其它的燃料产品包括中重瓦斯或燃料油，或它们 的前体，典型地包括烷、环烷和大约20至大约70个碳原子的芳香族化合物。燃料产品也包 括来自原油的其它残余物，如焦炭、浙青、焦油和蜡，其一般包含具有大约70或更多个碳的 多个环，和它们的前体。多种燃料产品可以通过多步加工进一步精炼成用于终端用户的终产品。精炼可以 通过分馏发生。例如，燃料产品的混合物，如具有不同的多种链长度的不同烃的混合物可以通过分馏被分离成多种成分。精炼也可以包括下列步骤的一个或多个裂化、整合(unifying)或改变燃料产 品。大的燃料产品，如大的烃类(例如，3C10)，可以通过裂化分解成更小的片段。裂化可 以通过加热或高压，如蒸汽、减粘裂化或焦化进行。燃料产品也可以通过减粘裂化，例如，降 低重油的粘度进行精炼。精炼也可以包括焦化，其中产生重的、几乎纯的碳残余。裂化也可 以通过催化方法进行，以通过使用催化剂，例如但不限于沸石、水合硅酸铝、矾土或二氧化 硅-氧化铝来提高裂化反应的速度。催化可以是流化催化裂化，由此，热催化剂如沸石被用 于催化裂化反应。催化也可以通过加氢裂解进行，其中与流体催化裂化比较，一般使用更低 的温度。加氢裂解典型地在升高的氢分压的存在下发生。燃料产品可以通过催化裂化进行 精炼以产生柴油、汽油和/或煤油。精炼也可以包括加氢处理。燃料产品也可以通过在整合步骤中将它们结合进行精炼，例如，通过使用催化剂， 如钼或钼-铼混合物。整合过程典型地产生氢气，其是可以用于裂化的副产品。燃料产品也可以通过将烃类改变或重排或重建成更小的分子来进行精炼。存在许 多化学反应，其发生在本领域技术人员已知的催化重整过程中。一般而言，催化重整在催化 剂和高的氢分压的存在下进行。一种普通的方法是烷基化。例如，丙烯和丁烯与催化剂如 氢氟酸或硫酸混合。燃料产品也可以被混合或组合成混合物以获得终产物。例如，燃料产品可以被混 合以形成不同等级的汽油、含有或不含添加剂的汽油、不同重量和等级的润滑油、不同等级 的煤油、喷气式发动机燃料、柴油燃料、加热油(heating oil)和制造塑料和其它聚合物的 化学品。本文描述的燃料产品的组合物可以与通过其它方法产生的燃料产品进行组合或混
I=I ο本文公开的是包含下列的组合物包含氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳原子 为组合物重量的至少80%，并且其中所述组合物的δ 13C分布为小于-32%。。在一些情况 下，组合物进一步包括异戊二烯单元。在一些情况下，组合物包括萜。在一些情况下，组合 物进一步包括三酸甘油酯或脂肪酸。对于本文描述的一些组合物来说，氢和碳原子为组合 物重量的至少90%。例如，生物柴油或脂肪酸甲酯(其具有按重量计小于90%的氢和碳原 子)可以不是组合物的部分。仍在其它的组合物中，氢和碳原子为组合物重量的至少95% 或99%。而在其它组合物中，氢和碳原子为组合物重量的100%。在一些情况下，组合物为 液体。在其它情况下，组合物为燃料添加剂或燃料产品。在一些实施方式中，组合物是萜。 在其它实施方式中，组合物不是脂肪酸或脂肪酸酯。在另一实施方式中，组合物不是甲烷。 在一些实施方式中，组合物的S 13C分布为小于-35%。，或小于-40%。、-45%。、-50%。、-55% 或-60%。。在其它情况下，组合物的辛烷值为大约85-120。仍在其它的情况下，组合物的辛 烷值为大于90。碳固定是自养生物，例如，由光合作用驱动的生物的过程，由此无机碳被转化为有 机物质。卡尔文循环(Calvin Cycle)是最常见的碳固定方法。高等植物中的碳固定包括光 合作用过程中一些类型的碳固定。C3固定是来自植物的这样的过程，其利用卡尔文循环作 为将无机碳掺入有机物中的初始步骤，形成3-碳化合物作为第一稳定的中间体。大多数阔 叶植物和处于温带的植物都是C3。C4固定包括这样的植物，其以无机碳掺入4-碳化合物 的反应作为卡尔文循环的开端。C4植物可以具有不同的叶解剖学。C4途径可以在具有强阳光的热带区域发现。热带的草，如甘蔗和玉米，是C4植物，但是有许多C4阔叶植物。一 些植物利用景天酸代谢(CAM)作为对干旱条件的适应。夜间进入气孔的二氧化碳被转化成 有机酸，其当气孔关闭时释放二氧化碳，用于在白天的卡尔文循环。绿色植物和一些仙人掌 种类是CAM植物的实例。除了卡尔文循环，目前已知一些自养微生物利用一些其它的替代途径来固定碳。 反向三羧酸循环(Krebs cycle)可以被描述为反向进行的柠檬酸循环，并且例如，被一些无 机光能自养真细菌和一些化能无机自养硫酸盐还原菌利用。还原乙酰辅酶A (CoA)途径在 产甲烷古细菌和产乙酸菌以及一些硫酸盐还原真细菌中被发现作为固定碳的途径。3-羟基 丙酸盐途径在绿弯菌(Chloroflexus)属的无机光能自养生长真细菌中和在一些化能无机 自养生长古细菌的改良形式中被发现作为固定碳的途径。在一些情况下，本文考虑的产物(如燃料产品)包括一个或多个源自无机碳源的 碳。在一个实施方式中，如本文描述的，产物的碳的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70 %、80 %、90 %、95 %或99 %源自无机碳源。无机碳源的实例包括但不限于，二氧化碳、碳 酸盐、碳酸氢盐和碳酸。产物可以是这样的有机分子，其具有来自在光合作用期间固定的无 机碳源的碳。本文的产物可以通过其碳同位素分布(Carbon Isotope Distribution(CID))进 行描述。在分子水平，CID是分子内的单个碳原子为天然存在的碳同位素(例如，12C、13C 或14C)之一的统计学可能性。在产物的批量水平，CID可以是含有至少一个碳原子的化合 物中天然存在的碳同位素(例如，12C、13C或14C)的相对多度。虽然注意到每一种矿物燃料 的CID可以根据其来源而不同，但是CID(fos)(例如，矿物燃料如石油、天然气和煤中碳的 CID)可与CID(atm)(例如，当前大气二氧化碳中碳的CID)相区别。另外，CID(photo-atm) 是指近期历史中光合作用产生的碳基化合物的CID，其中无机碳源是大气压中的二氧化碳。 CID(photo-fos)是指近期历史中光合作用产生的碳基化合物的CID，其中基本上所有无机 碳的来源都是由矿物燃料(例如煤、天然气和/或石油)的燃烧产生的二氧化碳。精确分布也是下述的特征1)产生分子的光合生物的类型和2)无机碳的来源。这 些同位素分布可以用于限定光合作用来源的燃料产品的组成。碳同位素在不同的化合物之间和之中不均勻分布并且同位素分布可以揭示碳转 化所涉及的物理、化学和代谢过程的信息。光合生物组织中13C相对于12C的总多度一般小 于大气二氧化碳的碳的多度，这表示碳同位素区别(carbon isotope discrimination)发 生在二氧化碳掺入光合作用生物质时。大气二氧化碳包含大约1. 的非放射性同位素13C和98. 9%的12C。在光合作用 期间，植物由于质量不同所赋予的化学和物理特性的微小不同而排斥13C。在一些情况下， 这种排斥可以被用于将植物分成不同的光合作用组。在本文的一个实施方式中，该排斥被 用于确定提取自光合作用生物的烃源。二氧化碳的13C含量可以用专门设计用于高精度测量比率R的质谱仪测定，通过下 式定义比率R
13CR=—
12C在一些情况下，在分析之前，可以例如通过燃烧将产物、光合生物或其它材料转化
9为二氧化碳。在另一实例中，提取自光合生物的各个化合物通过化学或酶降解转化成二氧 化碳。在许多天然材料(例如植物、动物和矿物)中，R为大约0.0112，具有小的方差或偏差。Rtis值可以被转化成δ 13C的值，其中
S13C=[R样品/R标准]-1x1000其中是获自石灰石的二氧化碳的标准，该石灰石被称为PDB，其来自南卡罗莱 纳州的Pee Dee地层，其中R = 0.01124。如本文公开的，所有指示δ的组合物都是相对于 PDB。δ 13C的单位是每千分之一(本文也称为％。)。δ 13C的负值越大，表示组合物具有 越多的12C (例如，质量越轻)，而δ 13C正值越大，表示组合物具有越多的13C (例如，质量越 重)。大多数天然材料具有负的S 13C值，因为它们含有比PDB标准更少的13C。在水生光合生物中测量的碳同位素组合可以在-11%。and-39%。之间的范围，这可 能导致错误的印象——C3和C4光合作用途径都存在于水生植物。已经开发了测定水生光 合生物中碳固定的量的模型。在一个实施方式中，从水生光合生物中提取组合物并且纯化。 在一个实施方式中，从水生光合生物中产生组合物，其中所述组合物从所述生物中提取并 纯化，并且燃料产品具有小于-32%。的S13C。光合生物含有的13C少于大气中的13C,原因是与二氧化碳摄取有关的物理和化学 过程排斥13c。这种排斥的发生是由于13C重于12c，并且可以形成略微更强的化学键。此外， 由于质量上的差异，13CO2的扩散可以比12CO2的扩散更慢。由于水生光合生物光合作用中扩散的重要性，水生光合生物的δ 13C值比陆生植 物的S13C值更难以获知。溶于水中的无机碳的分散比空气中无机碳的扩散慢数个数量级。 例如，在水生光合生物中，无机碳扩散可能成为生物的同位素分馏的限制。虽然空气中二氧 化碳的S13C值相对恒定，但溶解的二氧化碳的δ 13C值是可变的，并且溶解的二氧化碳与溶 解碳酸氢盐有大约9%。的不同。研究已经显示，在具有混合和容易获得的无机碳源的快速流 动的流中，混合和扩散都不是水生光合生物的同位素分馏的速度限制。然而，在缓慢流动的 水中，已经显示同位素分馏是小的，表明无机碳扩散是限制的同位素分馏。游离大气的同位素组成也发生变化，缓慢地耗尽13C。逐步减少δ 13C由人为的燃 烧矿物燃料引起。从1956至1982，大气中二氧化碳的δ 13C已经从-6. 7%0 (在314ppm)降 低到-7. 9%0 (在 342ppm)。在正常的陆地光合作用中，由碳固定制造的碳化合物具有这样的CID，其相对于无 机碳源富集12C。而且，CID(photo-fos)将具有比CID(ph0t0-atm)高的12C百分比。利用 矿物燃料源(其已经通过远古的光合作用循环富集12C)从光合作用制备的化合物中的碳， 甚至会通过另外的光合作用循环进一步富集12c。14C是地球大气中产生的碳的放射性同位素。14C的半衰期为大约5，730年。结 果，由于矿物燃料中无机碳已经被隔离了数百万年并且实质上所有的14C已经衰变，所 以CID(atm)具有比CID(fos)高得多的14C百分比。相似地，CID(photo-atm)具有比 CID(photo-fos)高得多的14C百分比，这反映了无机碳源中14C的差异。因此，CID(atm)具有比CID(fos)更高的14C百分比。此外，由于矿物燃料中天然存在的烃分子一般不是烯烃，所以石油源烃分子中的 碳立构中心的分布接近外消旋混合物。因而，产物(例如燃料产品)可以是基本上纯的或纯的物质，其具有至少两个碳原 子、至少一个碳-碳键和以光合作用产生的物质的CID特征，其中无机碳源是矿物燃料。在 一些情况下，该物质可以具有至少一个双键和/或具有独特的立体化学/为非外消旋混合 物。产物可以为不是由光合生物如无维管的、真核光合生物自然产生的。产物也可以 是由重组生物如重组无维管的、真核光合生物产生的。在一些情况下，产物也包括氢原子，和任选地一个或多个杂原子如氧、氮和/或硫 原子。物质中的碳原子可以具有这样的同位素分布(例如％12C、%13c, %14c的)，其富 集12c，例如，水平与当来自无机源的碳原子(例如，来自二氧化碳、碳酸盐或碳酸)在光合 作用(例如无维管生物的)期间被固定时发生的碳同位素分馏过程一致。因此，产物如燃料产品可以直接从无机碳源(例如，从二氧化碳、碳酸盐或碳酸)、 水和电磁辐射合成。该合成通过基因修饰的无维管光合生物执行。修饰的生物包含一个或 多个对该生物异源的核酸。该异源核酸编码一种或多种酶，所述酶的终产物是诸如燃料产 品的产物。燃料产品不是由生物自然产生的。终产物中的碳原子可以至少50%、90%、99% 或全部源自进入细胞的无机碳源(例如，二氧化碳、碳酸盐或碳酸)。燃料产品的合成通过 光合作用(例如，光驱动的碳固定)实现。在光合作用期间，来自无机源的碳原子被固定到有机碳分子中。进行固定的化学 过程，如卡尔文-本森循环(Calvin-Benson Cycle)中RuBisCO酶的作用，有利于某些同位 素的掺入。例如，12C相对于13C优先固定。因此，光合作用产生的有机碳分子富集12C。由这 种分馏过程引起的同位素的分布是光合作用来源的分子的特征。RuBisC0(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)是在加尔文循环中催化碳固定的 酶。碳固定是这样的过程，通过该过程，使得大气二氧化碳的原子可用于生物，形式为富能 量的分子如蔗糖。RuBisCO催化核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)与二氧化碳或氧的羧化作用或
氧合作用。RuBisCO可能是世界上最丰富的蛋白质。RuBisCO催化无机碳进入生物圈的化学 反应。RuBisCO也是高等植物的叶中最丰富的蛋白质。在一个实施方式中，如本文描述的生 物可以被基因修饰以调节生物中RuBisCO的产生。在植物、藻类、蓝细菌以及向光性和化能自养变形菌中，RuBisCo通常由两种类型 的蛋白亚基——称为大链(大小大约为55kDa)和小链(大小大约为13kDa)组成。酶促活 性底物RuBP结合位点位于形成二聚体的大链中，其中来自每一个大链的氨基酸促成结合 位点。全部8个大链二聚体和8个小链装配成大约540kDa的较大复合物。在一些变形菌 和沟鞭藻类(dinoflagellates)中，只由大的亚基组成的酶可以存在。镁离子对于酶促活 性是必需的。镁离子在酶活性位点中的正确定位涉及将活化二氧化碳分子添加到活性位点 中的赖氨酸，从而形成氨基甲酸酯。氨基甲酸酯的形成受益于碱性PH。流体区室(例如，叶 绿体基质)中的PH和镁离子浓度在光下增加。在一个实施方式中，镁离子可以在光合生物 的生长过程中添加。
在碳固定期间，RuBisCO的底物分子是RuBP、底物二氧化碳(例如，不同于活化的 二氧化碳)和水。RuBisCO也可以使反应与分子氧而不是与底物二氧化碳发生。在一些情 况下，底物二氧化碳是来自烟道气的二氧化碳。当二氧化碳是底物时，羧化酶反应的产物是高度不稳定的六碳磷酸化的中间产 物，称为3-酮基-2-羧基阿拉伯糖醇(carboxyarabinitol) 1,5- 二磷酸，其实际上瞬间分 解成两个3-磷酸甘油酸分子。3-磷酸甘油酸可以被用于产生较大的分子如葡萄糖。当分子 氧是底物时，加氧酶反应的产物是磷酸羟乙酸和3-磷酸甘油酸。磷酸羟乙酸开始一系列称 为光呼吸的反应，其涉及位于线粒体和过氧化物酶体中的酶和细胞色素。在该过程中，两个 磷酸羟乙酸分子被转化成一个二氧化碳分子和一个3-磷酸甘油酸分子——其可以重新进 入卡尔文循环。进入该途径的一些磷酸羟乙酸可以被植物保留以产生其它分子如甘氨酸。 在二氧化碳和氧的空气水平，反应物的比例为大约4 1，这导致仅仅3. 5的净二氧化碳固 定。因而，酶没有能力防止与氧反应大大减小了许多植物的光合作用潜能。通过设计增加 酶周围二氧化碳浓度的方法——包括C4碳固定、景天酸代谢，和使用淀粉核，一些植物、许 多藻类和光合细菌已经克服了这种局限性。在一个实施方式中，光合生物被基因修饰以产生或上调RuBisCO途径中的酶或 RuBisCO本身的产生。例如，生物可以随后产生具有较低δ 13C分布的有机产物，例如本文 中描述的燃料产品。一些酶每秒钟可以进行数百万次化学反应。但是，RuBisCO是缓慢的，每秒钟仅能 够固定大约3个无机碳分子。然而，由于在光合生物中高浓度的RuBisCO，在大多数情况下， 以及在光不是另外限制光合作用时，RuBisCO反应对不断增加的二氧化碳浓度积极响应，因 此，无机碳的浓度是限制性的。卡尔文循环的最终速度限制因子是RuBisCO，其不能由任何 其它因子在短时间内改善。在一个实施方式中，以浓度不是限制性的并且由RuBisCO进行 的碳固定可以继续的足够高的浓度将无机碳提供给光合生物。在一些情况下，由于卡尔文循环中几种其它的酶的调节，在白天，RuBisCO通常具 有活性，因为RuBP不是在黑暗中产生的。此外，RuBisCO的活性以几种方式与卡尔文循环 中其它酶的活性相配合。一旦照明叶绿体，由于跨类囊体膜产生的质子梯度，基质的PH从 7.0升至8.0。同时，镁离子流出类囊体，增加了叶绿体基质中的镁浓度。RuBisCO具有高的 最佳pH(可以是>9.0，取决于镁离子浓度)并且因此由于二氧化碳和镁加入到活性位点而 变得活化，如本文描述的。在一个实施方式中，燃料产品可以由仅在光条件下生长的生物产 生。在本文方法的另一实施方式中，生物的生长培养基的PH可以调节。在一些情况下，需要另一种酶，RuBisCO活化酶(activase)，以使氨基甲酸酯在 RuBisCO的活性位点快速形成。需要活化酶是因为RuBP底物能够更强烈地结合到缺乏氨基 甲酸酯的活性位点并且可以使活化过程慢下来。在光下，RuBisCO活化酶促进抑制性RuBP 或一些观点认为是储存RuBP从催化位点释放。在一些植物(例如，烟草和许多豆类)中，也 需要活化酶，因为在黑暗中，RuBisCO被由这些植物合成的竞争性抑制剂——一种底物类似 物2-羧基-D-阿拉伯糖醇1-磷酸(CAlP)所抑制。CAlP紧紧地与氨基甲酰化的RuBisCO 的活性位点结合并且抑制催化活性。在光下，RuBisCO活化酶也促进CAlP从催化位点释放。 在CAlP从RuBisCO释放之后，其迅速地被光激活的CAlP-磷酸酶转化成非抑制性的形式。 最后，一旦每隔几百次反应，则与二氧化碳或氧的正常反应不被完成，而其它的抑制性底物类似物在活性位点形成。再一次，RuBisCO活化酶可以促进这些类似物从催化位点释放并 且保持该酶处于催化活性形式。活化酶的特性能够限制高温下植物的光合潜能。也已经显 示CAlP保持RuBisCO处于免于蛋白酶解的构象。在一些实施方式中，RuBisCO活化酶可以 由光合生物上调。例如，生物可以被基因修饰以产生更多的RuBisCO活化酶。由于二氧化碳和氧在RuBisCO的活性位点竞争，所以可以通过增加含RuBisCO的 区室(例如，叶绿体基质)中二氧化碳水平来增强由RuBisCO进行的碳固定。在一个实施 方式中，对生产燃料产品的光合生物进行修饰可以增加基质中的二氧化碳水平。当RuBisCO 用氧作为底物时，这种过程可以是用于防止高光通量时段期间过载的机制。例如，当氧与二 氧化碳的比达到这样的阈值一一在该阈值，氧而不是碳被固定——时，处于亮光中的光合 生物可以具有零净碳固定。在一个实施方式中，过多的无机碳可以被提供给光合生物，以便 光和温度对于生物内的碳固定是非限制性的。由于RuBisCO通常是植物中光合作用的速率限制，在本文的实例中，光合作用效 率可以通过修饰光合生物中的RuBisCO基因以增加其催化活性和/或减少氧化活性的比率 得到提高。在一个实施方式中，来自一种编码RuBisCO的生物的异源核酸被转化到另一光 合生物中。例如，修饰生物以产生具有小于-32%。的δ 13C的燃料产品可以包括增加RuBisCO 亚基的表达水平。在另一情况下，RuBisCO小链可以从叶绿体DNA表达。在另一实施方式 中，例如，编码RuBisCO的核酸可以被修饰或改变，例如，以增加对二氧化碳的特异性或另 外增加碳固定的速率。在一个实施方式中，具有天然高特异性值——例如没有来自红藻Galdieria partita的限制的RuBisCO变体可以被转化到光合生物中，用于生产具有一定量碳固定的 燃料产品。例如，通过提高生物中RuBisCO的特异性或碳固定，可能提高光合生物的光合效 率或生长。在一个实施方式中，水生光合生物与无机化合物源接触，其中所述生物产生燃料 产品。无机碳源可以来自矿物燃料。例如，燃烧矿物燃料可以产生无机碳，其可以被提供该 水生光合生物。矿物燃料的燃烧可以产生烟道气。烟道气是经由用于输送来自壁炉、烤炉、 火炉、锅炉或蒸汽发生器的废气的烟道例如管道或通道而排放到大气中的气体。在一个实 施方式中，烟道气是指在发电厂产生的燃烧废气。烟道气的组成取决于所燃烧的物质，但是 主要可以由源自燃烧空气的氮(一般大于三分之二)、二氧化碳和水蒸气以及过量氧(也源 自燃烧空气)组成。例如，对于在发电厂燃烧每吨油或煤燃料来说，烟道气包含3至3. 5顿 二氧化碳。烟道气可以是空气污染物。在一个实施方式中，烟道气包括二氧化碳，其δ 13C大于大气二氧化碳的S13C。当 水生光合生物与烟道气接触时(例如，通过使烟道气鼓泡穿过生物反应器或池)，水生光合 生物产生的有机碳可以具有接近烟道气体二氧化碳的W。然而，如本文所述，无机碳源 进入有机分子的生物碳固定可能受到无机碳源到生物中的扩散限制。生物中碳固定的扩散 限制在水生物种中是显著的。例如，如果无机源仅仅被限制或不能以足够快的速率扩散到 生物中，那么生物不可能在碳固定过程中充分地优选12C超过13C。藻类，其通过RuBisCO摄 取二氧化碳，显示出随环境二氧化碳浓度而改变的同位素分馏(例如，Kerby和Raven 1985 Adv. Bot. Res. 11 :71_123)。在实验室实验中，当二氧化碳有限时，观察到小的同位素分馏， 其也称为Δ (有时接近0%。)，当二氧化碳浓度高时，观察到20%。或更高的分馏。在一些研
13究中，同位素分馏可以在该整个范围内变化，其中大多数的变化推测是由于二氧化碳利用 率的改变引起。在一种情况，藻类与烟道气无机碳源接触而生长并且产生δ 13C为大约_13%。的燃 料产品。在另一情况，藻类与烟道气无机碳源接触生长并且产生S 13C为大约_22%。的燃料 产品。而在另一情况，藻类与过多的烟道气无机碳源接触生长，以便扩散不限制无机碳的碳 固定，并且该藻类产生S 13C为大约-52%。的燃料产品。在一个实施方式中，任何与过多的 矿物燃料无机碳源接触生长的藻类都产生S 13C小于大约-32%。的燃料产品。在一些实施 方式中，过多的无机碳源是这样的源，其没有光合生物内碳固定的扩散限制。本文也描述的是包含组合物和燃料成分的燃料产品，所述组合物包括含 有氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳原子为组合物重量的至少80%，并且其中 组合物的S13C分布小于-32%。。在一些实施方式中，组合物的S13C分布小于大 约-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或-60%。。在一些情况，燃料成分是调合燃料，其可以 是矿物燃料、汽油、柴油、乙醇、喷气式发动机燃料或其任何组合。仍在另外的情况下，调合 燃料具有大于-32%。的δ 13C分布。对于本文描述的一些燃料产品来说，燃料成分是燃料添 加剂，其可以是ΜΤΒΕ、抗氧化剂、抗静电剂、缓蚀剂和它们的任何组合。在一些情况下，组合 物成分进一步包括异戊二烯单元。在另一情况下，组合物包括萜。在一些情况下，组合物包 括三酸甘油酯或脂肪酸。在另外的情况下，氢和碳原子为组合物成分重量的至少90%。例 如，脂肪酸甲酯燃料或生物柴油典型地具有按重量计小于大约89. 5%的氢和碳含量。在一 些情况下，组合物不是脂肪酸或脂肪酸酯或甲烷。仍在另外的情况下，氢和碳原子为组合物 成分重量的至少95%或99%。而在另外的情况下，氢和碳原子为组合物成分重量的100%。 对于一些燃料产品来说，组合物成分是萜。在一些情况下，组合物成分为液体。如本文描述的燃料产品可以是通过混合组合物和燃料成分产生的产物。在一些情 况下，燃料产品具有大于-32%。的δ 13C分布。在其他的情况下，燃料产品具有小于_32%。 的S13C分布。例如，为了产生如本文所述的燃料产品，提取自生物的组合物在精练(例如 裂化)之前与燃料成分混合。所述组合物可以是如本文描述的组合物。所述组合物可以是 提取自生物的组合物，其包括这样的组合物，其中氢和碳原子为组合物重量的至少80%，并 且其中组合物的δ 13C分布小于-32%。。如所述的，燃料成分可以是矿物燃料或用于产生燃 料产品的混合掺合物。例如用于燃料混合的混合物可以是烃混合物，其适合于与另一烃混 合物混合以产生燃料产品。例如轻烷烃的混合物可能不具有适合于一燃料类型的特定辛烷 值，但是其可以与高辛烷混合物混合以产生燃料产品。在一个实例中，具有小于_32%。的δ 13C分布的组合物与用于燃料混合的烃混合物 混合，以产生燃料产品。在一些情况下，单独的组合物或燃料成分不适合作为燃料产品，然 而，当组合时，它们组成燃料产品。在其他的情况下，单独的组合物或燃料成分或两者适合 作为燃料产品。而在另外的情况下，燃料成分是现有的石油产品，如汽油或喷气式发动机燃 料。而在另外的情况下，燃料成分来源于可再生来源，如生物乙醇、生物柴油、生物汽油等。本公开进一步提供了产生二氧化碳的方法，其包括燃烧组合物从而产生二氧化 碳，其中所述二氧化碳具有小于_32%。的δ 13C分布。在一些情况下，二氧化碳具有小于大 约-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或_60%。的δ 13C分布。燃烧步骤可以在汽油发动机、 在柴油发动机或在喷气式发动机中进行。在一些实施方式中，该方法进一步包括从无维管光合生物中提取组合物。无维管光合生物的实例包括但不限于，藻类、蓝细菌和苔藓植物。 在一个实施方式中，提取组合物包括从水生光合生物中提取组合物。公开的方法可以进一 步包括上调生物中酶的步骤，其中所述酶的产物为所述组合物。在一些情况下，所述酶不是 自然存在于生物中。示例性酶在本文中进一步讨论。在另一实施方式中，示例性核酸序列 在本文中进一步讨论。公开了产生燃料产品的方法，其包括培养无维管光合生物；使所述生物与烟道 气接触；将来自所述烟道气的13C掺入燃料产品；以及从无维管光合生物提取所述燃料产 品。例如，无维管光合生物可以生长在生物反应器中。在示例性实施方式中，生物可以通过 与烟道气一起输入生物反应器(例如，将烟道气鼓泡进入包含生长无维管光合生物的液体 的生物反应器中)而与烟道气接触。在一些情况下，无维管光合生物是藻类。在另外的情 况下，生物反应器是敞开的池。在另外的情况下，生物反应器是封闭的光生物反应器。在一 些情况下，该方法进一步包括基因修饰生物的步骤。基因修饰生物的示例性方法在本文中 描述。在一些情况下，基因修饰生物可以在生物体内上调或产生生成燃料产品的酶。在其 他情况下，基因修饰生物可以改善生物的生长。而在另一情况下，基因修饰生物影响生物内 的碳固定，例如，改变碳固定的速率或数量。在一些情况下，燃料产品不是自然存在于生物 中。燃料产品可以包括含有氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳原子为组合物重量的至少 90%，并且其中组合物的δ 13C分布小于-32%。。在一些情况下，方法包括精炼燃料产品的 步骤。示例性精炼方法在本文中描述。本公开也提供了从无维管光合生物产生燃料产品的方法，其包括培养无维管光 合生物，其中该生物产生第一燃料产品；使所述生物与无机碳源接触；将来自所述无机碳 源的碳掺入第一燃料产品，其中所述第一燃料产品具有小于-32%。的δ 13C分布。在一些情 况下，无机碳源包括含13C的二氧化碳和含12C的二氧化碳。在一些情况下，无机碳源是矿 物燃料无机碳。在另外的情况下，无机碳具有大于-32%。的δ 13C分布。在一些情况下，使 生物与无机碳源接触包括使生物与过量的无机碳源接触。例如，过量无机碳可以描述一定 量无机碳，以便生物内的碳固定不被无机碳源限制。在另一实例中，过量无机碳可以描述 一定量无机碳，以便由与过量无机碳接触的生物产生的燃料产品的S 13C分布小于矿物燃 料的S 13C分布。例如，具有从过量无机碳源掺入的无机碳的燃料产品的δ 13C分布可以小 于-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%> _55%。或 _60%0。在一些实施方式中，生物包括一个或多个核酸，所述核酸编码一种或多种终产物 为第一燃料产品的酶。在另外的实施方式中，核酸是异源的。第一燃料产品可以不由生物自 然产生。在一些情况下，第一燃料产品具有小于_32%。的δ 13C分布。在另外的实施方式中， 第一燃料产品包括萜。矿物燃料无机碳可以具有大于_32%。的δ 13C分布。在一些实施方式 中，从生物中提取第一燃料产品。第一燃料产品可以经历裂化。在一些情况下，本文的方法 进一步包括将燃料成分添加至第一燃料产品。在一些情况下，这些方法进一步包括燃烧第 一燃料产品并且产生富S 13C的无机碳。在一些情况下，富δ 13C的无机碳具有小于-32%。 的δ 13C分布。本文公开的方法可以进一步包括下述步骤培养第二无维管光合生物，其中 所述生物产生第二燃料产品；使所述生物与无机碳源接触，以便第二燃料产品中的碳源自 这种来源，其中无机碳是富S 13C的无机碳。例如，第二燃料产品中的碳是从无机碳源掺入 的碳。该方法可以包括将来自无机碳源的碳掺入第二燃料产品。在一些情况下，除了第一和第二燃料产品的碳同位素分布以外，第一燃料产品和第二燃料产品基本上是相同的。第 二燃料产品可以具有小于-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或_60%。的δ 13C分布。可以利用本文的组合物和方法产生的烃和烃衍生物产物的实例包括萜以及它们 的衍生物类萜。如本文使用的，萜可以与类异戊二烯或类萜交替使用。萜是由异戊二烯(C5) 单元组成的分子。萜未必是纯的烃。类萜(也称为类异戊二烯)源自萜，但是被修饰，如通 过添加杂原子如氧、碳骨架重排和烷基化进行。如所述的，类萜可以被如本文使用的术语萜 包括。类胡萝卜素，如胡萝卜素和叶黄素，是作为有用产物的类萜的实例。类固醇是类萜的 另一实例。萜类的实例包括但不限于，半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜。如本文使 用的，术语半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜也可以指类似结构的类异戊二烯(例 如，倍半类异戊二烯)。萜类的其它实例包括但不限于，苧烯、1，8_桉树脑、α-菔烯、 莰烯、(+)_桧烯、月桂烯、角鲨烯、花侧柏烯、叶绿醇、法尼烯、松香二烯(abietadiene), 紫杉二烯(taxadiene)、法尼焦磷酸、紫穗槐二烯(amorphadiene)、(Ε)-α-红没药烯或 diapophytoene,以及它们的衍生物。所产生的产物可以通过转化的宿主细胞或生物(一种或多种)自然地或非自然地 产生(作为转化的结果)。产物也可以是不存在于自然界的新的分子。例如藻类中自然产 生的产物可以是萜类如类胡萝卜素(例如，胡萝卜素)。由藻类非自然产生的产物的实 例包括非天然萜如苧烯。一些从宿主细胞产生的燃料产品——有时在精炼之后——将与现有的石化产 品相同，例如，具有相同的结构。一些燃料产品可以不与现有的石化产品相同。在一个 实施方式中，除了碳同位素分布外，燃料产品或组合物与现有的石化产品相同。例如，据 认为，任何矿物燃料石化产品不具有小于-32%。的δ 13C分布，而如本文所述的燃料产品 可以具有小于-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或 _60%。的 δ 13C 分布。在另一 实施方式中，燃料产品或组合物与现有的矿物燃料石化产品相似但不相同，并且具有小 于-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或 _60%。的 δ 13C 分布。然而，虽然分子不存在 于常规的石化产品或精炼品中，但是其在这些工业中可能仍然是有用的。例如，可以产生这 样的烃，其在汽油的沸点范围内并且可以用作汽油或添加剂，即使该烃不是自然存在于汽 油中。II.生产本文描述的任何产物可以都可以通过转化生物以使这种生物产生该产物来制备。 在转化之前或之后，生物可以是光合生物。可使用本文所述组合物和方法转化的生物的实例包括维管和无维管生物。所述生 物可以是原核生物或真核生物。所述生物可以是单细胞生物或多细胞生物。无维管光合生物的实例包括苔藓植物(bryophtyes)，如叶苔门 (marchantiophytes)或角苔门(anthocerotophytes)。在一些实施方式中，所述生物是蓝 细菌。在一些实施方式中，所述生物是藻类(如大型藻(macroalgae)或微藻)。所述藻类 可以是单细胞或多细胞藻类。在一些实施方式中，所述生物是红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、 tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、眼虫藻、定鞭藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫或浮游植物。例如，所述微藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可用编码苧烯合酶的 载体或其被线性化的部分转化，以生产苧烯。例如，所述微藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可用编码苧烯合酶的载 体转化，以生产苧烯。在另一实施方式中，微藻类可以用编码苧烯合酶和蛋白质的一个或多 个载体转化以提供苧烯的生产。在一些情况下，方法使用微藻，莱茵衣藻示例。使用微藻表达多肽或蛋白复合 体提供了这样的优势——可以培养大量的微藻，包括商业地培养(Cyanotech Corp.； Kailua-Kona HI)，因此允许期望产品的大量生产，以及分离——如果希望的话。然而，在任 何植物的叶绿体中表达例如功能哺乳动物多肽包括蛋白复合体的能力允许这些植物的作 物生产，并因此能够方便地生产大量多肽。因此，本文所述的方法可以使用任何具有叶绿体 的植物实施，包括，例如大型藻，如海洋藻类和海草，以及在土壤中生长的植物。术语“植物”在本文被宽泛地使用，以指代含有质体(plastids)，特别是叶绿体的 真核生物，并且其包括在任何发育阶段的任何这样的生物；或指代植物的部分，包括植物剪 枝(plant cutting)、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子和胚芽(plantlet)。 植物细胞是植物的结构和生理单位，其包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单 个细胞或培养的细胞的形式，或可以是更高组成单元，如植物组织、植物器官或植物。因 此，植物细胞可以是原生质体，生成配子的细胞，或一个细胞，或可以再生为整个植物的细 胞集合。同样地，种子，其包含多个植物细胞并能够再生为整个植物，出于本公开的目的， 被认为是植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、胼胝体，或被归类进结构 或功能单元的任何其它类别的植物细胞。植物特别有用的部分包括可收获部分和用于繁 殖后代植物的部分。植物的可收获部分可以是植物任何有用的部分，例如花朵、花粉、幼苗 (seedling)、块茎、叶、茎、果实、种子、根等。用于繁殖的植物部分包括，例如，种子、果实、剪 枝(cutting)、幼苗、块茎、根茎(rootstock)等。本文提供的方法可以产生含有原生质体的植物，所述原生质体被基因修饰以包含 稳定整合的多核苷酸(Hager 和 Bock，Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :302_310，2000)。因 此，如本文所述，方法可以进一步提供转基因(叶绿体转基因(transplastomic))植物，如 莱茵衣藻，其包括一个或多个含有多核苷酸的原生质体，所述多核苷酸编码一个或多个异 源多肽，包括与形成功能蛋白复合体特异相关的多肽。光合生物包含至少一个被修饰以生 成产物的宿主细胞。表达载体和宿主细胞转化这里的生物/宿主细胞可以用表达载体转化，以改变产物的生产，例如，提高产物 的生产。产物可以是由生物天然地或非天然地产生的。表达载体可以编码一个或多个同源或异源核苷酸序列(由宿主细胞或由不同的 生物产生)和/或一个或多个自体同源的核苷酸序列(由相同的生物产生)和/或编码同 源或异源多肽的那些。可被转化进藻类宿主细胞的异源核苷酸序列的实例包括来自细菌、 真菌、植物、光合细菌或其它藻类的基因。可被转化进藻类宿主细胞的自体同源核苷酸序列 的实例包括类异戊二烯合成基因、内源启动子和来自psbA、atpA或rbcL基因的5’ UTRs0 在一些实施方式中，异源序列在两个自体同源序列或同源序列的一侧。同源序列是那些具 有与宿主细胞中的序列至少50 %、60 %、70 %、80 %或90 %同源性的序列。在一些实施方式中，同源序列在两个自体同源序列的一侧。第一和第二同源序列使异源序列能够重组进入 宿主生物的基因组。第一和第二同源序列每一个的长度都可以至少是100、200、300、400或 500个核苷酸。表达载体可含有为在被转化生物中表达而改变了密码子的核苷酸序列。普通技 术人员在使用核苷酸密码子来具体指明给定氨基酸中已经熟知由特定宿主细胞显示的“密 码子偏倚性”。并非被理论限制，但通过使用宿主细胞优选的密码子，翻译的比率可以更高。 因此，当合成用于提高在宿主细胞中表达的基因时，可期望设计这样的基因，以便其密码子 使用的频率接近宿主细胞优选的密码子使用的频率。密码子一般地富A/T，如，在密码子第 三核苷酸的位置上富A/T。典型地，富A/T的密码子偏倚被用于藻类。在一些实施方式中， 密码子的至少50%的第三核苷酸位置是A或T。在其它实施方式中，密码子的至少60%、 70%、80%、90%或99%的第三核苷酸位置是々或11。构建藻类的基因改造株(genetically manipulated strain)的一个方法涉及用 编码目的基因的核酸转化，所述核酸典型地是能够将前体转化为燃料产品或燃料产品前体 的酶。在一些实施方式中，转化可将核酸引入宿主藻类细胞的任何质体(如叶绿体)。转 化的细胞通常在引入外源核酸后被铺于选择性培养基中。该方法也可以包括若干筛选的步 骤。开始，通常进行主转化体(primary transformant)的筛选，以确定哪些克隆带有合适 的外源核酸插入体。显示恰当插入的克隆可被形成膜片(patched)并重新筛选，以确保遗 传稳定性。这样的方法保证转化体含有目的基因。在多种实施方式中，这样的筛选通过聚 合酶链反应(PCR)进行，但是，本领域已知的任何其它合适的技术也可被使用。多种不同的 PCR方法在本领域内公知(如嵌套PCR、实时PCR)。虽然在本文所述的实例中使用了具体的 例子；但是，本领域普通技术人员能认识到其它PCR技术可替代所述的具体方法。筛选带有 合适的外源核酸插入体的克隆之后，通常克隆被筛选存在的编码蛋白。蛋白表达筛选通常 通过蛋白质印迹分析和/或酶活性测试进行。用在本文方法中的重组核酸分子可以包含在载体中。而且，在使用第二(或更 多)重组核酸分子进行该方法的情况下，第二重组核酸分子也可以包含在载体内，其可以， 但不必与含有第一重组核酸分子的载体相同。所述载体可以是用于将多核苷酸引入叶绿 体的任何载体，并且优选地，包含足以与叶绿体基因组DNA进行同源重组的叶绿体基因组 DNA的核苷酸序列，例如，含有约400到1500或更多基本上连续的叶绿体基因组DNA核苷酸 的核苷酸序列。叶绿体载体和选择叶绿体基因组区域用作载体的方法已经公知(参见，例 如，Bock，J. Mol.Biol. 312 :425_438，2001 ；也参见 Staub 和 Maliga，Plant Cell 4 39-45, 1992 ；Kavanagh等，Genetics 152 :1111_1122，1999，它们中的每一个都在此通过引用并 入)。在一些实施方式中，这样的载体包括启动子。用于本文的启动子可来自任何来源 (如病毒、细菌、真菌、原生生物、动物)。本文考虑的启动子可以对光合生物、无维管光合 生物和维管光合生物(如藻类、开花植物)是特异性的。在这里所用，术语“无维管光合 生物”是指任何宏观或微观生物，包括但不限于，藻类、蓝细菌和光合细菌，其不具有如在 高等植物中发现的维管系统。在一些实施方式中，上述核酸被插入含有光合生物如藻类的 启动子的载体中。所述启动子可以是在叶绿体和/或其它质体中表达的启动子。在一些 实施方式中，所述核酸是基于叶绿体的。考虑用于插入本文所述任何核酸到叶绿体中的启动子的实例包括美国申请2004/0014174中公开的那些。所述启动子可以是组成型启动子 (constitutive promoter)或诱导型启动子。启动子通常包括接近转录起始点的必需核酸 序列(如TATA元件)。莱茵衣藻的整个叶绿体基因组在互联网上通过URL" biology, duke, edu/ chlamy_genome/-chloro. html “对公众可用(参见"view complete genome astext file，， 链接和“maps of the chloroplast genome”链接)，它们每一个都在此通过引用被并入 (J. Maul, J. W. Lilly 和 D. B. Stern，未公开的结果；2002 年 1 月 28 日修改；将以 GenBank 帐号AF396929公开)。通常，叶绿体基因组DNA的核苷酸序列被这样选择，以致其不是基 因的一部分，包括调控序列或编码序列，特别是如果由于同源重组事件被打断，将产生对叶 绿体有害作用的基因，例如，用于叶绿体基因组复制，或对含有叶绿体的植物细胞产生有害 作用的基因。在这一方面，包含莱茵衣藻叶绿体基因组序列的网站也提供了显示叶绿体基 因组编码区和非编码区的图谱，由此帮助用于构建载体的序列的选择。例如，叶绿体载体， p322，是从约143. Ikb位置的Eco (EcoRI)位点延伸到约148. 5kb位置的Xho (Xho I)位点 的克隆(参见，互联网，在 URL" biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html"，并点 击"maps of thechloroplast genome"链接和〃 140_150kb"链接；也可直接通过互联网 上 URL" biology.duke.edu/chlam-y/chloro/chlorol40.html"获取)。在本文使用的载体也可以含有一个或多个给予该载体期望性质的额外的核苷酸 序列，包括，例如，这样的序列，诸如辅助载体操控的克隆位点，指导该载体复制或其包含的 核苷酸序列转录的调控元件，编码选择性标记的序列等。因此，所述载体可以包含，例如，一 个或多个克隆位点，如多克隆位点，其可以但不必放置为使异源多核苷酸可以被插入该载 体并且可操控地链接到期望的元件。所述载体也可以包含原核生物的复制起点(ori)，例 如，大肠杆菌ori或粘粒ori，由此如期望，允许该载体在原核宿主细胞，以及在植物的叶绿 体中传递。调控元件，作为本文所用的术语，广义地指调控多核苷酸转录或翻译，或其被可操 控地链接到的多肽的定位的核苷酸序列。实例包括，但不限于RBS、启动子、增强子、转录终 止子、起始(启动)密码子、用于内含子剪切和正确读码框保持的剪接信号、终止密码子、琥 珀密码子或赭石密码子——一种IRES。此外，细胞区室化信号(即，将多肽靶向到细胞液、 核、叶绿体膜或细胞膜的序列)。这样的信号在本领域内公知并已经被广泛地报告(见例 如，美国专利号5，776,689)。本文所述的任何表达载体可进一步包含调控序列。调控序列可包括例如，启动子、 操纵子、抑制子、增强子、转录终止序列、调控翻译的序列，或与宿主细胞相容的和控制核酸 分子表达的其它调控序列。在一些情况下，调控序列包括能够控制、调节或影响转录起始、 延伸和/或终止的转录控制序列。例如，调控序列可以提高生物中基因或基因产物的转录 和翻译速率和/或效率，其中所述基因或基因产物的表达被上调，(直接或间接地)引起本 文所述的产物的生产的提高。调控序列也可通过提高基因或基因产物的稳定性，导致生产 的提高。调控序列可以是自体同源或异源的，并且如果是异源的，可以是同源的。调控序列 可编码促进产物表达和生产的酶的一个或多个多肽。例如，异源的调控序列可由所述生物 相同属的另一种(如，另一藻类种)产生，并在藻类中编码合酶。在另一实施方式中，自体同源的调控序列可以由表达载体将在其中表达的生物中产生。取决于应用，调控序列可以被用以影响诱导型或组成型表达。藻类调控序列可以 被使用，并且可以是核、病毒、染色体外、线粒体或叶绿体源的。合适的调控序列包括与待表达核苷酸序列天然相关的那些(例如，藻类启动子天 然地与藻类衍生的核苷酸序列可操作地连接)。合适的调控序列包括与待表达的核酸分子 非天然相关的调控序列(例如，一个种的藻类启动子与另一生物或藻类种的核苷酸序列可 操作连接)。后一种调控序列可以是在相同种内控制另一基因表达的序列(即，自体同源)， 或可以从不同生物或种中衍生(即，异源的)。为了确定推定的调控序列是否合适，该推定的调控序列被连接到核酸分子，其通 常编码产生容易检测的信号的蛋白。该构建体可随后通过标准技术插入藻类或其它生物， 并且其表达被监控。例如，如果核酸分子编码显性的选择性标记，待使用的藻类或生物被测 试在所述标记为其提供抗性的化合物存在的环境中生长的能力。在一些情况下，调控序列是启动子，如适合核苷酸序列在无维管光合生物中表达 的启动子。例如，所述启动子可以是藻类启动子，例如美国公开申请号2006/0234368和 2004/0014174，以及 Hallmann 的 Transgenic Plant J. 1 :81_98 (2007)中所述。该启动子 可以是叶绿体特异性启动子或核启动子。启动子可以是EFl-α基因启动子或D启动子。在 一些实施方式中，所述合酶被可操作地连接到EFl-α基因启动子。在一些实施方式中，所 述合酶被可操作地连接到D启动子。本文的调控序列可以在多种位置发现，包括例如，编码区域和非编码区域、 5'-未翻译区域(如，编码区域上游的区域)和3'-未翻译区域(如，编码区域下游的区 域)。因此，在一些实施方式中，自体同源或异源的核苷酸序列可以包含一个或多个3'或 5' _未翻译区域、一个或多个内含子或一个或多个外显子。例如，在一些实施方式中，调控序列可以包含隐秘小环藻(Cyclotellacryptica) 乙酰辅酶A羧化酶5'-未翻译调控序列或隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶3'-未翻译调 控序列(美国专利号5，661，017)。调控序列也可编码嵌合或融合多肽，如蛋白AB或SAA，其促进异源核苷酸序列和 蛋白的表达。其它调控序列包括自体同源的内含子序列，其可促进异源序列的翻译。在本文的任何表达载体中使用的调控序列可被诱导。可诱导的调控序列，如启动 子，可以通过例如光被诱导。调控序列也可以是可自体调控的。可自体调控的调控序列的 实例包括通过，例如，内源ATP水平或通过由生物产生的产物自体调控的那些。在一些实施 方式中，所述调控序列可通过外源试剂被诱导。其它可诱导的元件在本领域内被公知，并且 可适合于如本文所述使用。本文所述的各种调控序列的各种组合可具体化并与本文所述的其它特征组合。在 一些情况下，表达载体包含一个或多个调控序列，其被可操作地连接到编码多肽的核苷酸 序列上，所述多肽影响，例如，上调本文所述产物的生产。在一些情况下，表达载体包括一个 或多个调控序列，所述调控序列可操作地连接到编码影响例如上调产物生产的多肽的核苷 酸序列。载体或其他重组核酸分子可包括编码报告多肽或其它选择性标记的核苷酸序列。 术语“报告基因(reporter)”或“选择性标记”指的是给予可检测表型的多核苷酸(或编码
20的多肽)。报告基因通常编码可检测的多肽，例如，绿色荧光蛋白，或一种酶，如荧光素酶，当 与合适的试剂(分别是特定波长的光或荧光素)接触时，其产生可被肉眼或使用适当的仪 器检测到的信号(Giacomin, Plant Sci. 116 :59_72，1996 ；Scikantha, J. Bacteriol. 178 121，1996 ；Gerdes, FEBS Lett. 389 44-47,1996 ；也参见 Jefferson, EMB0J. 6 :3901_3907， 1997,fl-glucuronidase)。选择性标记通常是这样的分子，当在细胞中存在或表达时，其为 含有该标记的细胞提供了选择性优势(或劣势)，例如，在否则会杀死细胞的试剂存在的情 况下生长的能力。选择性标记可以提供一种获得表达该标记的原核细胞或植物细胞或两者的方 法，并因此可以被用作所述载体的一个部分(参见，例如，Bock，上文，2001)。选择性标 记的实例包括，但不限于，给予抗代谢物抗性的那些，如，二氢叶酸还原酶，其给予对甲 氨喋呤的抗性(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 143-149，1994)；新霉素磷 酸转移酶，其给予对氨基糖苷新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性(Herrera-Estrella， EMBO J. 2 987-995,1983) ；hygro，其给予对潮霉素的抗性(Marsh，Gene 32:481-485， 1984) ；trpB，其允许细胞使用吲哚替代色氨酸；hisD，其允许细胞使用组氨醇(histinol) 替代组氨酸(Hartman，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 85 :8047，1988)；甘露糖 _6_ 磷酸异 构酶，其允许细胞使用甘露糖(W0 94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其给予对鸟氨酸脱羧酶 抑制剂——2-( 二氟甲基)-DL-鸟氨酸的抗性(DFM0 ;McConlogue，1987，In Current Communications inMolecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；禾口自 土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶，其给予对杀稻瘟素S的抗性(Tamura，Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 =2336-2338,1995)。其它选择性标记包括给予除草剂抗性的那 些，例如，草胺膦乙酰转移酶基因，其给予对草胺膦的抗性(White等，Nucl. Acids Res. 18 1062，1990 ；Spencer 等，Theor. Appl. Genet. 79 :625_631，1990)；变异 EPSPV 合酶，其给予 草甘膦抗性(Hinchee等，Bi0TeChn0l0gy91 =915-922,1998)；变异的乙酰乳酸合酶，其给予 咪唑啉酮或磺酰脲抗性(Lee等，EMBO J. 7 1241-1248，1988)；变异的psbA，其给予对阿特 拉津(atrazine)的抗性(Smeda 等，Plant Physiol. 103 :911_917，1993)；或变异的前卟啉 原(protoporphyrinogen)氧化酶(参见美国专利号5，767，373)；或给予对除草剂如草丁 膦(glufosinate)的抗性的其它标记。选择性标记包括给予真核细胞二氢叶酸(DHFR)或 新霉素抗性，或给予原核生物，如大肠杆菌四环素、氨苄青霉素抗性；和植物中争光霉素、庆 大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素、草胺膦(phosphinotricin)、壮观 霉素、链霉素、磺酰胺和磺酰脲抗性的多核苷酸(参见，例如，Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995，第 39 页)。报告基因已经被成功地用在高等植物的叶绿体中，并且已经报道了高水平重组蛋 白的表达。此外，报告基因已经被用在莱茵衣藻的叶绿体中，但是，在大多数情况下，产生 非常少量的蛋白。报告基因极大地增强了监控多种生物中基因表达的能力。在高等植物 的叶绿体中，β-葡萄糖醛酸酶(uidA, Staub 和 Maliga，EMBO J. 12 :601_606，1993)、新 霉素磷酸转移酶(nptll, Carrer 等，Mol. Gen. Genet. 241 =49-56,1993)、腺苷基-3-腺嘌 呤转移酶(adenosyl-3-adenyltransf-erase) (aadA, Svab 禾口 Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 90:913-917,1993)和维多利亚发光水母(Aequorea victoria)GFP(Sidorov 等，Plant J. 19 :209_216，1999)已经被用作报告基因(Heifetz, Biochemie 82 -.655-666,2000)。这些基因中的每一个都具有使它们成为有用的叶绿体基因表达的报告基因的性 质，如易于分析、敏感性或原位检查表达的能力。基于这些研究，其它异源蛋白已经在高 等植物的叶绿体中表达，如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensisKry毒素，其将 抗性给予草食昆虫(Kota 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 96 1840-1845，1999)或人生长 激素(Staub等，Nat. Biotechnol. 18 :333_338，2000)，一种可能的生物药物。若干报告基 因已经在真核绿藻莱茵衣藻的叶绿体中表达，包括aadA (Go 1 dschmidt-Clermont，Nuc 1. Acids Res. 19 :4083-4089 1991 ；Zerges 和 Rochaix, Mol. Cell Biol. 14 :5268_5277， 1994)、uidA(Sakamoto 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 90 :477_501，19933，Ishikura 等，J. Biosci. Bioeng. 87 :307-3141999)、海肾(Renilla)荧光素酶(Minko 等，Mol. Gen-Genet. 262 :421_425， 1999) 和来自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)的氨基糖苷 憐酸转移酶(amino glycoside phosphotransferase) aphA6 (Bateman 禾口 Purton, Mol. Gen. Genet 263 =404-410,2000)。在一些实施方式中，载体含有诸如大肠杆菌或酿酒酵母(S. cerevisiae)复制起 点的元件。这些特征，与适当的选择性标记结合，允许所述载体在目标宿主细胞和细菌和/ 或酵母细胞之间“穿梭(shuttled)”。在第二宿主(secondary host)中传递穿梭载体的能 力可允许对该载体特征更方便地操控。例如，含有载体和推定插入的目标多肽的反应混合 物可以被转化进原核宿主细胞如大肠杆菌，被扩增并用常规方法收集，并且被检验，以分辨 含有目标插入体或构建体的载体。如果期望，该载体可以进一步被操作，例如，通过进行定 点突变插入的多核苷酸，随后再次扩增并选择具有变异的目标多核苷酸的载体。穿梭载体 随后可以被引入植物细胞叶绿体，其中目标多肽可以被表达，并且如果期望，根据本文公开 的方法进行分离。多核苷酸或重组核酸分子可以使用本领域已知的任何方法被引入植物叶绿体。多 核苷酸可以通过多种本领域熟知的方法被引入细胞，并且部分地基于特定的宿主细胞进行 选择。例如，多核苷酸可以使用直接基因转移的方法被引入植物细胞，所述方法例如电穿孔 或使用粒子枪的微粒介导(基因枪)转化或“玻璃珠法(glass bead method) ”，或通过花 粉介导的转化、脂质体介导的转化、使用损伤或酶降解的未成熟胚胎或损伤或酶降解的胚 胎胼胝体转化(Potrykus, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 42 -.205-225,1991)。质体转化是用于将多核苷酸引入植物细胞叶绿体的一种常规和熟知的方法(参 见美国专利号 5，451，513,5, 545，817 和 5，545，818 ；WO 95/16783 ；McBride 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 91 :7301_7305，1994)。在一些实施方式中，叶绿体转化涉及引入一侧带有 期望核苷酸序列的叶绿体DNA的区域，允许外源DNA同源重组进入目标叶绿体基因组。在 一些实施方式中，叶绿体基因组DNA—侧的1到1.5kb的核苷酸序列可以被使用。使用这 种方法，在叶绿体16S rRNA和给予对奇霉素和链霉素的抗性的rpsl2基因中的点突变可以 被用作转化的选择性标记(Svab 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA87 :8526_8530，1990)，并且 可以约每100次目标叶片轰击一个的频率，产生稳定的同型(homoplasmic)转化体。微粒介导的转化也可以被用于将多核苷酸引入植物细胞叶绿体(Klein等， Nature 327:70-73,1987).该方法是用了诸如金或钨的微粒，其被期望的多核苷酸通过 与氯化钙、亚精胺或聚乙二醇沉淀而包衣。微粒粒子使用诸如BI0LISTIC PD-1000粒子枪 (BioRad ；Hercules Calif.)的设备被高速加速进入植物组织。使用基因枪方法进行转化的方法在本领域内被公知(参见，例如，Christou，Trends in Plant Science 1 =423-431, 1996)。微粒介导的转化已经被使用，例如，用以产生多种转基因植物种类，包括棉花、烟草、 玉米、杂交白杨和木瓜。重要的谷类作物，诸如小麦、燕麦、大麦、高粱和水稻也已经使用微 粒介导输送被转化(Duan 等，Nature Biotech. 14 :494_498，1996 ；Shimamoto, Curr. Opin. Biotech. 5 :158-162，1994)。大多数双子叶植物的转化用上述方法是可能的。单子叶植物 的转化也可以使用，例如，上述基因枪方法、原生质体转化、部分渗透细胞的点穿孔、使用玻 璃纤维引入DNA、玻璃珠振荡(agitation)法等进行转化。转化频率可通过隐性rRNA或蛋白抗生素抗性基因被显性选择性标记替代而提 高，所述显性选择性标记包括但不限于细菌aadA基因(Svab和Maliga，Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 90:913-917,1993)。转化后通常需要约15到20个细胞分裂周期以达到同质 (homoplastidic)状态。叶绿体可包含其基因组的多个拷贝对本领域普通技术人员是显而 易见的，并且因此，术语“同质的(homoplasmic) ”或“同型异源性(homoplasmy) ”指的是这 样的状态——特定目标基因座的所有拷贝都基本相同。质体表达，其中基因通过同源重组 插入每个植物细胞中存在的环状质体基因组的所有几千个拷贝中，利用了相对于核表达基 因的大量拷贝数优势，以允许表达水平轻易地超过总可溶植物蛋白的10%。在一些情况下，方法可以通过向叶绿体中引入重组核酸分子实施，其中所述重组 核酸分子包括第一多核苷酸，其编码至少一个多肽(即，1个、2个、3个、4个或更多)。在一 些实施方式中，多肽被可操作地链接到第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十 和/或后续多肽。例如，在烃生产途径中的若干酶可以被直接或间接地链接，以便由途径中 的一种酶产生的产物一旦产生，即与该途径中下一种酶非常靠近。对于叶绿体的转化，主要优势可能是包含选择性标记和一个或多个目的基因的重 组核酸构建体的使用。典型地，叶绿体的转化通过用以下两种构建体共转化叶绿体实施一 种包含选择性标记且第二种包含目的基因。这些转化体的筛选由于多种原因是费力且费时 的。首先，培养一些转化的生物需要的时间是漫长的。其次，转化体必须被筛选出选择性标 记和目的基因两者都存在。典型地，对目的基因的第二次筛选通过DNA印记法进行(参见， 例如 PCT/US2007/072465)。在叶绿体中，基因表达的调控一般地在转录后并且通常在翻译起始时发 生。这种调控取决于叶绿体翻译装置，以及核编码的调控因子(参见Barkan和 Goldschmidt-Clermont, Biochemie 82 :559_572，2000 ；Zerges, Biochemie 82 :583_601， 2000)。叶绿体翻译装置通常与细菌中的类似；叶绿体包含70S核糖体；具有缺少5’加盖的 mRNA并通常不含有3，多腺苷尾部(Harris等，Microbiol. Rev. 58 :700_754，1994)；而且翻 译在叶绿体和在细菌中被诸如氯霉素的选择性试剂抑制。本文所述的一些方法利用了核糖体结合序列(RBS)相对于编码序列的恰当置 放。以前就已经注意到RBS这样的置放引起植物叶绿体中稳健的翻译(参见美国申请 2004/0014174，在此被引入作为参考)，以及利用叶绿体中表达多肽的多肽是该多肽不穿过 通常被由核基因表达的多肽穿过的细胞区室，并因此，不经过某些翻译后修饰，如糖基化。 同样地，通过本文的一些方法产生的多肽和蛋白复合体可以被预期在没有这样的翻译后修 饰的情况下产生。编码多核苷酸的一个或多个密码子可以被偏倚，以反映叶绿体和/或核密码子的使用。大多数氨基酸由两个或多个不同的(简并的)密码子编码，并且各种生物使用某 些密码子优先于其它密码子是公知的。这样优选的密码子使用，其也在叶绿体中使用，在 这里指的是“叶绿体密码子使用”。莱茵衣藻的密码子偏倚性已经被报道。参见美国申请 2004/0014174。编码类异戊二烯生物合酶——其被偏倚用于在莱茵衣藻中表达——的核酸 的实例在表5-8中提供。与原生序列同一性百分比(在该序列被分离的生物中)可以是约 50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更高。一些载体包含表5提供的一种或多种核酸 和/或具有与其约70%同一性的核酸。术语“偏倚的”当用于指密码子时，表示多核苷酸中密码子的序列已经被改变，以 至于该密码子在该偏倚(bias)用于的目标中，如藻细胞、叶绿体，是被优选地使用的一个。 为叶绿体密码子使用而偏倚的多核苷酸可以重新合成，或可以使用常规的重组DNA技术， 例如，通过位点定向诱变法，进行基因修饰，以改变一个或多个密码子，以便它们针对叶绿 体密码子使用是偏倚的。叶绿体密码子偏倚可以在不同植物中多种地变化，包括，例如，在 藻类叶绿体中与在烟草中比较。通常，选择的叶绿体密码子偏倚性反映了用核酸转化的植 物的叶绿体密码子使用。例如，在莱茵衣藻为宿主的情况下，叶绿体密码子使用被偏倚，以 反映藻类叶绿体密码子使用(约74. 6%的AT偏倚在第三个密码子位置)。本文描述的任何产物可以通过转化生物以使该产物的这种生物进行生产来制备。 即使转化事件破坏或降低了转化生物的光合能力(例如，外源核酸被插入到编码光合作用 需要的蛋白质的基因中)，该生物也被认为是光合生物。修饰的涂径本文的表达载体可以编码这样的多肽(一种或多种)，所述多肽促进中间体、产 物、前体以及本文描述的产物的衍生物的产生。例如，表达载体可以编码在类异戊二烯途径 中促进中间体、产物、前体和衍生物的产生的多肽。类异戊二烯或类萜是一组与萜类有关的有机化学品。萜类一般源自异戊二烯单 元。异戊二烯单元是五碳单位(C5)。根据异戊二烯单元的数目对萜类进行分类，如半萜 (C5)、单萜(ClO)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)、四萜(C40)和多萜(Cn，其中“η” 等于或大于45)。萜类是这样的烃，其可以被改性(例如，氧化、除去甲基基团等)或其碳骨 架被重排以形成萜的衍生物，如类异戊二烯。类异戊二烯也包括其他的类固醇以及脂类。萜前体被认为通过两种途径产生。甲羟戊酸途径，或HMG-CoA还原酶途径，产生二 甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和异戊基焦磷酸(IPP)，萜常见的C5前体。非甲羟戊酸途径是 形成DMAPP和IPP的可选途径。DMAPP和IPP可被缩合以形成栊牛儿基二磷酸(GPP)或其 它前体，如法尼二磷酸(FPP)、忙牛儿基忙牛儿基二磷酸(GGPP)，由它们形成更高级的类异 戊二烯。本文的表达载体可以编码在甲羟戊酸途径中具有作用的多肽(一种多多种)， 诸如，例如，硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶 (phosphemevalonate kinase)和甲羟戊酸_5_焦磷酸脱羧酶。在其他实施方式中，多肽 是非甲羟戊酸途径中的酶，如DOXP合酶、DOXP还原酶、4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤 藓糖醇合酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase)、4_ 二磷酸胞 苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4，-环二磷酸合酶、HMB-PP合 酶、HMB-PP还原酶或DOXP还原异构酶。
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在其他情况下，表达载体可以包括编码类异戊二烯途径中的多肽的核苷酸序列， 诸如，例如，合酶编码序列。合酶可以是CIO、C15、C20、C30或C40合酶。在一些实施方 式中，合酶是葡萄烃(botryococcene)合酶、苧烯合酶、1，8桉叶油素(1，8 cineole)合 酶、α-菔烯合酶、莰烯合酶、(+)_桧烯合酶、月桂烯合酶、松香二烯(abietadiene)合酶、 紫杉二烯(taxadiene)合酶、法尼焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶、(E) - α -红没药烯合酶、 diapophytoene合酶或diapophytoene去饱和酶。在表1中描述了合酶的实例以及它们的 序列。表1.合酶的实例 所述合酶也可以是β -石竹烯合酶、大根香叶烯A合酶、8-表雪松醇 (8-epicedrol)合酶、朱栾倍半萜(valencene)合酶、(+)-δ-杜松烯((+)- δ-cadinene) 合酶、大根香叶烯C合酶、(Ε)-β-法尼烯合酶、蓖麻烯(casbene)合酶、vetispiradiene 合酶、5-表-马兜铃烯(5-印i-aristolochene)合酶、马兜铃烯合酶、α-潷草烯、(Ε， E)-α-法尼烯合酶、(-)-β-菔烯合酶、Y-松油烯合酶、苧烯环化酶、沉香醇合酶、(+)_冰 片二磷酸合酶、左旋海松二烯合酶、异海松二烯合酶、(E)-Y-红没药烯合酶、柯巴基焦磷酸 (copalylpyrophosphate)合酶、贝壳衫烯(kaurene)合酶、长叶烯合酶、Y-潷草烯合酶、 δ _蛇床烯合酶、β -水芹烯合酶、异松油烯合酶、(+)-3_蒈烯合酶、顺-柯巴基焦磷酸合酶、 α -松油醇合酶、顺-海松-7，15- 二烯合酶、反-山达海松二烯(sandaaracopimaradiene) 合酶、sterner-13-ene合酶、E- β -罗勒烯、S-沉香醇合酶、栊牛儿醇合酶、γ -松油烯合酶、 沉香醇合酶、E-β -罗勒烯合酶、表_雪松醇合酶、α -姜烯合酶、愈创木二烯(guaiadiene) 合酶、卡藜二烯(cascarilladiene)合酶、顺-穆罗拉二烯(muuroladiene)合酶、阿菲迪柯 林-16b-醇(aphidicolan-16b-ol)合酶、伊丽莎白三烯(elizabethatriene)合酶、檀香醇 合酶、广藿香醇(patchoulol)合酶、zinzanol合酶、雪松醇合酶、香紫苏醇(scareol)合酶、 柯巴醇(copalol)合酶或泪柏醇(manool)合酶。本文中使用的途径可以包含细胞液中、质体中(如，叶绿体)或两者中存在的酶。 编码本文所述实施方式中酶的外源核酸可被引入宿主细胞，以便编码的酶在细胞液中或在 质体中或在两者中都有活性。在一些实施方式中，在宿主细胞转化后，在一个细胞内区室(如，在细胞液中)中存在的天然生成的酶可在不同的细胞内区域内(如在叶绿体中)，或 在天然生成和非天然生成的区域内表达。为了阐释这一概念，并且只是通过实例的方式，无维管光合微藻可以被基因工程 化，以产生类异戊二烯，如苧烯(一种在特用化学和石化工业中有很高价值的分子)。苧烯 是纯烃单萜，仅含有氢和碳原子。苧烯不是莱茵衣藻中天然产生的。苧烯在这些微藻中的 产生可以通过工程化该微藻以在叶绿体中表达异源酶苧烯合酶而完成。苧烯合酶可以将萜 烯前体栊牛儿基焦磷酸(geranyl pyrophosphate)转化成苧烯。不像苧烯，栊牛儿基焦磷 酸天然存在于微藻的叶绿体中。苧烯合酶的表达可以通过插入编码苧烯合酶的异源基因到 微藻的叶绿体基因组中完成。随后使微藻的修饰株成为同质的，以确保苧烯基因在所有后 代的叶绿体基因组中稳定保持。当被插入的基因存在于叶绿体基因组的所有拷贝中时，微 藻对于基因是同质的。叶绿体可能包含其基因组的多个拷贝对本领域普通技术人员是显而 易见的，并且因此，术语“同质的(homoplasmic) ”或“同型异源性(homoplasmy) ”指的是这 样的状态——特定目标基因座的所有拷贝都基本相同。质体表达，其中基因通过同源重组 插入每个植物细胞中存在的环状质体基因组的所有几千个拷贝中，利用了相对于核表达基 因的大量拷贝数优势，以允许表达水平轻易地超过总可溶植物蛋白的10%。表汰叶绿体是光合生物中生产性的细胞器和大量蛋白合成的位置。本文所述的任何 表达载体可选择性地适合叶绿体表达。许多来自高等植物的叶绿体启动子已经在Kimg和 Lin, Nucleic Acids Res. 13 :7543_7549 (1985)中描述。基因产物可在叶绿体中由表达载 体表达。由表达载体编码的基因产物也可由叶绿体靶向基因被靶向到叶绿体。例如，靶向 表达载体或由表达载体编码的基因产物到叶绿体可进一步增强由调控序列和编码允许或 提高燃料分子生产的蛋白或多肽的序列提供的效果。本文所述的靶向叶绿体的各种组合可具体体现并与本文所述的其它特征组合。例 如，编码萜烯合酶的核苷酸序列可被可操作地连接到编码叶绿体靶向基因的核苷酸序列。 宿主细胞可用编码靶向叶绿体的苧烯合酶的表达载体转化，并且因此，可产生比用编码苧 烯合酶但没有叶绿体靶向基因的表达载体转化的宿主细胞更多的苧烯合酶。提高的苧烯合 酶的表达可产生比产生较少的宿主细胞更多的苧烯。而在另一实例中，包含编码酶的核苷酸序列的表达载体被靶向叶绿体，所述酶通 过利用由生物自然产生的前体作为底物，产生该生物非自然产生的产物(例如，燃料产品、 香料产品、杀虫剂产品)。与其中酶被表达但是没有靶向叶绿体的宿主细胞相比，通过将酶 靶向叶绿体，产物的生产可以增加。不被理论所束缚，这可能是由于增加了在叶绿体中产生 的前体并且因此更多的产物可以通过由引入的核苷酸序列所编码的酶产生。产物(例如燃料产品、香料产品、杀虫剂产品)可以通过包括下述步骤的方法生 产生长/培养由本文的一个或多个核酸转化的无维管生物。本文的方法可以进一步包括 转化生物的步骤。转化可以使用本领域内已知的或本文描述的任何方法进行。本文的方法 可以进一步包括收集由生物生产的产物的步骤。本文的方法可以进一步包括给生物提供无机碳源如烟道气的步骤。在一些情况 下，无机碳源提供制造产物(例如燃料产品)必需的全部碳。生长/培养步骤优选地发生
28在合适的培养基如具有矿物质和/或维生素的培养基中。而在相关的不同方面，提供了生产产物(例如燃料产品、香料产品、杀虫剂产品) 的方法，其包括用表达载体转化光合生物，生长生物；以及从该生物收集产物。表达载体 一般是本文描述的表达载体，并且特别地被用于向生物增加额外的生物合成能力或改变该 生物中已经存在的生物合成途径，意图在于提高或允许由该光合生物产生分子。本文的方法包括选择用于生产产物的基因，产物例如燃料、香料和杀虫剂，用该基 因转化光合生物的细胞，和在允许生产产物的合适条件下培养该生物。生物可以在传统的 发酵生物反应器中培养，其包括，但不限于，分批式(batch)、补料分批式(fed-batch)、细 胞再循环和连续式发酵器。而且，它们可在光生物反应器中生长(参见，例如，美国专利公 开号20050260553 ；美国专利号5，958，761 ；美国专利号6，083，740)。培养也可以在摇瓶、 试管、微量滴定盘(microtiter dish)和培养皿中进行。培养在适合重组细胞的温度、pH和 氧含量的条件下进行。这些培养条件在本领域普通技术人员中被公知。宿主生物也可在陆地上生长，例如，垃圾填埋场。在一些实例中，宿主生物在乙醇 生产工厂或在产生CO2的其它设施或区域(如，城市、高速公路等)附近生长。因此，本文 所述的方法考虑了向乙醇工厂或产生CO2的其它设施或区域出售碳信用额，并同时通过在 乙醇生产工厂附近培养一种或多种本文所述的修饰的生物来生产燃料的商业方法。而且，所述生物可在户外开放水域生长，如池塘、大洋、海、河流、水床(waterbed)、 沼泽水(marsh water)、浅池、湖泊、水库等。当在水中生长时，所述生物可以被包含在由乐 高积木状(lego-like)颗粒组成的光环状(halo like)物体中。所述光环状物体围绕藻类， 并允许其从下方水中保持营养同时保持其在无遮挡的阳光中。在一些实例中，生物可以在容器中生长，其中每个容器包含1个或2个或多个生 物。所述容器可以被构建为漂浮在水上。例如，容器可以由空气和水的组合填充，使得容器 和在其中的宿主生物漂浮。因此，适应在淡水中生长的宿主生物可以在咸水(即，海水)中 生长，并且反之亦然。如果容器有任何损坏，这种机制允许生物自动死亡。在一些实例中，若干容器可以包含在上述光环状结构中。例如，多达100、1，000、 10，000、100，000或1，000, 000个容器可以被安排在光环状结构的一平米中。在一些实施方式中，通过收获生物来收集产物(例如燃料产品、香料产品、杀虫剂 产品)。然后，可以从所述生物中提取产物。在一些实施方式中，所述产物(如，燃料产品、香料产品、杀虫剂产品)的表达是可 诱导的。所述产物可被诱导以表达。表达可以通过光诱导。而在其它实施方式中，所述产 物的生产是自体调控的。所述产物可形成反馈回路，其中当产物(如，燃料产品、香料产品、 杀虫剂产品)达到某个水平时，产物的表达被抑制。在其它实施方式中，所述生物的代谢产 物的水平抑制产物的表达。例如，作为能量产生提高以表达产物的结果，所述生物产生的内 源ATP可形成反馈回路，以抑制该产物的表达。而在另一实施方式中，产物的生产可被例如 通过光或外源试剂诱导。例如，用于引起宿主生物中产物生产的表达载体可包含可诱导的 调控序列，其被外源试剂激活或钝化。本文描述的方法或过程也可以涉及筛选新基因/表达载体以产生本文描述的任 何燃料产品的方法。这样的方法包括下述步骤(1)将核酸的候选表达载体插入光合生物， (2)收集从其产生的推定的燃料产品，(3)将推定的燃料产品施加到质谱仪以确定所述推
29定燃料产品的性质以及其是否可以用作燃料产品。在一些实施方式中，步骤(2)可以包括 收集已知的燃料产品以及相对于不含候选表达载体的光合生物，候选表达载体是否增加了 燃料产品的生产。III.商业方法本文还提供了出售碳信用额的商业方法，其包括获得组合物的δ 13C分布 的测量；和将组合物的S13C分布与参照S13C分布进行比较；如果该组合物的S13C 分布小于参照S 13C分布，则将碳信用额出售给实体，其中所述实体是组合物的所 有者或使用者。在一些情况下，参照δ 13C分布为大约-32%。。在另一实施方式中， 参照W分布是石油的最大S13C分布。而在另一情况下，参照S13C分布式是大 约-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或-60%。。该方法可以进一步包括利用所述测 量标记组合物。该方法可以进一步包括跟踪组合物。本文也可以提供商业方法，其包括将碳信用额提供给生长适合产生燃料产品的无 维管光合生物的一方。在一些情况下，光合生物被基因修饰。相对于目前的方法，该产生燃 料产品的方法提供了可能更环境友好的产生燃料产品的方法。因此，本文描述的方法和组 合物可以在交换碳信用额的商业方法中使用。碳信用额可以是补贴(allowance)、许可、信用或类似物，其已经被一些相关主权 实体(例如但不限于市(包括所有规模和类型的城市，包括立市(incorporated)和未立市 的(unincorporated)城市)、县、州或省、或国家，以及相关政府实体，如区域的、多国的或 其它国际实体，如联合国或欧盟)允许、授权或承认。碳信用额基本上可从规章制定机构或管理实体直接取得。在其它实例中，它们可 间接地获得，例如，使用本文所述方法或组合物的实体可以从规章制定机构直接获得碳信 用额，并可随后将该碳信用额转移到另一实体。碳信用额的转移可与给定的使用基因修饰 的无维管光合生物的过程、产品相联系，所述生物适合产生燃料产品。例如，第一个实体可被认定为是提供可消耗产品，该产品被分配到最终用户的机 动货车(mobile platform)用于消耗，其中所述消耗和/或可消耗产品的生产包括相应的 所产生的尾气。例如，柴油燃料的燃烧通常导致相应氮氧化物的环境释放，而汽油的燃烧通 常导致相应的硫氧化物的释放。第一方可采用使用上述无维管光合生物生产其产物的方法，或在它们的组合物中 使用由上文所述的无维管光合生物产生的产物，产生与生产例如柴油燃料、汽油、喷气式发 动机燃料等的传统方法相比对环境危害较小的影响。因此，方法抵消了终产物对环境的影 响。第一方可随后收到碳信用额或尾气信用额，作为减少总排放的结果。所述碳信用额可 从调控或管理机构取得，或可从第二方被转移到第一方，其中所述第二方可已经向第一方 卖出了无维管光合生物或无维管光合生物的产物。碳信用额可被交换为很容易变现的金融票据。例如，碳信用额可被交换为现金等 价物，如现金、支票等。碳信用额也可被交换为关于知识产权的法律授权，例如，但不限于， 转让(assignment)或许可(license)。碳信用额也可被交换为政府税务补贴，或许可给定 市场的购买者。碳信用额也可被交换为使用另一碳释放过程，如不包含培养所述生物的过 程。例如，一方可拥有在一个时间段内如一个月或一年可释放的有限量的排放，而且如果超 过该限度可能产生罚款或处罚。然而，用碳信用额，超过限度的一方可交换碳信用额以抵消罚款或处罚，或在确定由该方产生的排放量时碳信用额可被考虑进去。商业方法也可以包括在出售碳信用额的同时，生产产物如燃料产品、香料等。本文的商业方法也考虑出售不是燃料产品的产物，如香料和杀虫剂。与燃料产品 有关的商业方法——包括涉及碳信用额使用的那些，也与其他类型的有用产品和材料的生 产相关。本文提供的另外的方法是标记组合物的方法，其包括获得组合物的δ 13C分布的 测量；和利用该测量标记组合物。在一些实施方式中，标记包括指示组合物的S13C分布。 在一些实施方式中，标记包括指示组合物的S13C分布并且组合物的δ 13C分布的测量为小 于-32%。。在一种情况下，组合物是可以包含燃料成分的燃料产品。标记可以包括添加物理 标记到组合物或者添加物理标记至包含组合物的包装中。标记步骤可以包括计算机可读标 记和/或指示可再生来源的标记。在一些方面，本文描述的方法可以进一步包括跟踪组合 物的步骤。在一些方面，跟踪包括1)将未知组合物的碳同位素分布与所述测量进行比较； 2)确定组合物的位置；和/或3)用计算机系统监测组合物。尽管本文示出并描述了本发明的示例性实施方式，但是这些实施方式仅仅通过实 例来提供对于本领域技术人员来说是明显的。现在本领域技术人员将想到许多改变、变化 以及替代而不背离本发明。应该理解，本文描述的本发明实施方式的各种替代方式可以在 本发明的实践中使用。实施例1在莱因衣藻中牛产单萜合酶在本实施例中，编码来自绿薄荷(Mspicata)的苧烯合酶的核酸被引入莱因衣 藻。转化DNA被图解示于图IA中。在这种情况下，标记“转基因”的片段是编码苧烯合酶的 基因，其由来自莱茵衣藻的PsbA基因的5’ UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基 因的3’ UTR调节，而标记“选择标记”的片段是来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其由来 自莱茵衣藻的atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的rbcL基因的3’UTR调 节。转基因盒通过标记“同源物A”和“同源物B”的片段——其分别与5’侧和3’侧上psbA 基因座侧翼的DNA序列相同——靴向莱茵衣藻的psbA基因座。在这种转化DNA的构建中进 行的所有 DNA操作基本上如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989)禾口 Cohen 等 Meth. Enzymol. 297，192—208，1998 中 所描述。对于这些实验，所有的转化在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。在23°C，在设置为 IOOrpm的摇床上，在450Lux的恒定照明下，细胞在0. 5mM 5-氟脱氧尿嘧啶的存在下在TAP 培养基(Gorman 和 Levine，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 54 1665-1669，1965，其通过引用并 入本文)中生长至对数后期(大约7天)。在23°C，通过以4，000 Xg离心5min收获50ml 的细胞。倒出上清液并将细胞重悬于4ml TAP培养基中，用于随后通过粒子轰击进行叶绿 体转化(Cohen等人，同上，1998)。所有转化都在卡那霉素(100 μ g/ml)选择下进行，其中 抗性由图IA中标记“选择标记”的片段所编码的基因赋予(Chlamydomonas Stock Center, Duke University)。PCR被用于鉴定转化株。为了进行PCR分析，IO6个藻类细胞(来自琼脂板或液体 培养基)悬浮在IOmM EDTA中并且加热至95°C 10分钟，然后冷却至接近23°C。制备由反
31应缓冲液、MgC12、dNTPs、PCR引物对(一对或多对)、DNA聚合酶和水组成的PCR混合物。 EDTA中的藻类裂解物被加入以提供反应模板。改变镁浓度以补偿所加入的EDTA中藻类裂 解物的量和浓度。使用退火温度梯度以确定具体引物对的最佳退火温度。为了鉴别包含苧烯合酶基因的株，使用其中一个引物退火定位在psbA5’ UTR内而 另外的引物退火定位在苧烯合酶编码片段内部的引物对。期望的克隆是产生预期大小的 PCR产物的那些克隆。为了确定内源基因座位被置换(异质对同质)的程度，使用由两组引 物对组成的PCR反应(在相同的反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座 并且由在psbA5’ UTR内退火的引物和在psbA编码区内退火的引物组成。第二对引物扩增 不被表达载体靶向的恒定(常规)区或对照区，因此在所有的情况下应该产生预期大小的 产物。这种反应证实了来自内源基因座的PCR产物的缺乏不是由抑制PCR反应的细胞和/ 或其它污染物引起的。改变引物对的浓度以便两个反应都在相同的管中进行；然而，内源基 因座的引物对是常规对的浓度的5倍。使用的循环数是>30，以增加灵敏度。最期望的克 隆是产生恒定区产物但是不产生内源基因基因座产物的那些。期望的克隆也是相对于对照 反应产生弱强度内源基因座产物的那些。除非另外指明，表达苧烯合酶的莱茵衣藻转化体的培养是在23°C，在设置为 lOOrpm的摇床上，在黑暗中在液体TAP培养基上进行的。在收获之前，以每ml 1X107个细 胞的密度保持培养至少48小时。为了确定苧烯合酶基因是否导致在转化的藻类细胞中表达苧烯合酶，通过免疫印 迹免疫沉淀并显示两种可溶性蛋白质。简而言之，通过在4°C以4000X g离心15分钟，收 获500ml藻类细胞培养物。轻轻地倒出上清液并将细胞重悬于10ml的裂解缓冲液(100mM Tris-HCl,pH = 8. 0,300mM NaCl, 2% Tween-20)中。通过超声处理裂解细胞(以 35%功率， 10 X 30sec)。通过在4°C以14，000 X g离心1小时，使裂解物变清。除去上清液并且在4°C与 抗FLAG抗体-结合的琼脂糖树脂温育10小时。通过重力过滤(gravityfiltration)从裂 解物分离树脂并且用洗涤缓冲液(100mM Tris-HCl，pH = 8. 0,300mM NaCl, 2% Tween-20) 洗涤3次。来自多个样品的免疫印迹分析结果(图2)显示确实产生了苧烯合酶。为了确定藻类叶绿体中产生的苧烯合酶是否是功能性酶，检测了苧烯从GPP的产 生。简单地，50uL苧烯合酶-结合的琼脂糖(上面制备的相同样品)悬浮在300uL具有 0. 33mg/mL GPP 的反应缓冲液(25mM HEPES，pH = 7. 2，100mM KC1, lOmM MnC12,10%甘油和 5mM DTT)中，并且转移到玻璃管中。用庚烷覆盖反应并在23°C温育12小时。通过涡旋混 合物淬灭反应并且萃取。除去0. lmL的庚烷并且通过GC-MS分析样品。结果示于图3中。也检测了来自粗制的细胞裂解物的苧烯合酶活性。简而言之，通过在4°C以 4000Xg离心15分钟，收获50ml藻类细胞培养物。轻轻地倒出上清液并将细胞重悬于 0. 5ml 的反应缓冲液(25mM HEPES，pH= 7. 2，100mM KC1, lOmM MnC12,10%甘油和 5mM DTT) 中。通过超声处理裂解细胞(以35%功率，10X30sec)。向裂解物加入0. 33mg/mL的GPP， 并将混合物转至玻璃管中。用庚烷覆盖反应并在23°C温育12小时。通过涡旋混合物淬灭 反应并且萃取。除去0. lmL的庚烷并且通过GC-MS分析样品。结果示于图3中。实施例2在莱因衣藻中生产FPP合酶和倍半萜合酶在本实施例中，将编码来自原鸡(G. gallus)的FPP合酶和来自罗勒
32(0. basilicum)的姜烯合酶(zingiberene synthase)的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA被 图解示于图1C中。在这种情况下，标记“转基因1”的片段是编码FPP合酶的基因，其由来 自莱茵衣藻的psbD基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调 节，标记“转基因2”的片段是编码姜烯合酶的基因，其由来自莱茵衣藻的psbD基因的5’UTR 和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’ UTR调节，而标记“选择标记”的片段是 来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其由来自莱茵衣藻的atpA基因的5’ UTR和启动子序 列以及来自莱茵衣藻的rbcL基因的3’ UTR调节。转基因盒通过标记“同源物C”和“同源 物D”的片段——其分别与5’侧和3’侧上3HB基因座侧翼的DNA序列相同——靴向莱茵 衣藻的3HB基因座。在这种转化DNA的构建中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等， Molecular Cloning :ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) 和 Cohen 等 Meth. Enzymol. 297，192-208，1998 中所描述。对于这些实验，所有的转化在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。在23°C，在设置为 lOOrprn的摇床上，在450Lux的恒定照明下，细胞在0. 5mM 5-氟脱氧尿嘧啶的存在下在TAP 培养基(Gorman 和 Levine，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 54 :1665_1669，1965，其通过引用并 入本文)中生长至对数后期(大约7天)。在23°C，通过以4，000Xg离心5min收获50ml 细胞。轻轻倒出上清液并将细胞重悬于4ml TAP培养基中，用于随后通过粒子轰击进行的 叶绿体转化(Cohen等人，见上文，1998)。所有转化都在卡那霉素(lOOyg/ml)选择下进 行，其中抗性由图1C中标记“选择标记”的片段所编码的基因赋予(Chlamydomonas Stock Center, Duke University)。PCR被用于鉴定转化株。为了进行PCR分析，106个藻类细胞(来自琼脂板或液体 培养)悬浮在10mM EDTA中并且加热至95°C 10分钟，然后冷却至接近23°C。制备由反应 缓冲液、MgC12、dNTPs、PCR引物对(一对或多对)、DNA聚合酶和水组成的PCR混合物。加 入EDTA中的藻类裂解物以提供反应模板。改变镁浓度以补偿所加入的EDTA中藻类裂解物 的量和浓度。使用退火温度梯度以确定具体引物对的最佳退火温度。为了鉴别包含FPP合 酶基因的株，使用其中一个引物退火定位在psbD 5’UTR内而另外的引物退火定位在FPP合 酶编码片段内部的引物对。为了鉴别包含姜烯合酶基因的株，使用其中一个引物退火定位 在psbD 5’ UTR内而另外的引物退火定位在姜烯合酶编码片段内部的引物对。期望的克隆 是在两个反应中产生预期大小的PCR产物的那些克隆。为了确定内源基因座被置换(异质 对同质)的程度，使用由两组引物对组成的PCR反应(在相同的反应中)。第一对引物扩增 由表达载体靶向的内源基因座。第二对引物扩增不被表达载体靶向的恒定(常规)区或对 照区，因此在所有的情况下应该产生预期大小的产物。这种反应证实了来自内源基因座的 PCR产物的缺乏不是由抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物引起。改变引物对的浓度以 便两个反应在相同的管中进行；然而，内源基因座的引物对是常规对的浓度的5倍。使用的 循环数是> 30，以增加灵敏度。最期望的克隆是产生恒定区产物但是不产生内源基因基因 座产物的那些。期望的克隆也是相对于对照反应产生弱强度内源基因座产物的那些。为了保证FPP合酶基因和姜烯合酶基因的存在导致FPP合酶和姜烯合酶酶的表 达，进行了免疫印迹。从TAP琼脂培养基收集大约1x10s个藻类细胞并且悬浮在0. 05ml裂 解缓冲液(Bugbuster ；Novagen)中。溶液被加热至95°C 5分钟，然后冷却至23°C。裂解物 与加样缓冲液(XT样品缓冲液；Bio-Rad)以3 1混合，样品加热至95°C 1分钟，冷却至
3323°C，并且通过离心除去不溶性蛋白质。可溶性蛋白质通过SDS-PAGE分离之后转移至PVDF 膜。在23°C，用TBST+5%干脱脂奶粉封闭膜30分钟，在4°C，与抗FLAG抗体(在TBST+5% 干脱脂牛奶中1 2，500稀释)温育10小时，用TBST洗涤三次，在23°C，与辣根连接的抗 小鼠抗体(在TBST+5%干脱脂奶粉中1 5，000稀释)温育1小时，并用TBST洗涤三次。 用化学发光检测显示蛋白质。来自多个克隆的结果(图4)显示GPP合酶基因在导致蛋白 质产生的莱茵衣藻细胞中表达。除非另外指明，表达FPP合酶和姜烯合酶的莱茵衣藻转化体的培养是在23°C，在 设置为lOOrpm的摇床上，在5，OOOLux的恒定照明下在液体TAP培养基上进行的。在收获 之前，以每ml IX 107个细胞的密度保持培养至少48小时。为了确定藻类叶绿体中产生的FPP合酶和姜烯合酶是否是功能性的，检测了来自 DMAPP和IPP的倍半萜的产生。简而言之，通过在4°C以4000 Xg离心15分钟，收获50ml 藻类细胞培养物。轻轻地倒出上清液并将细胞重悬于0.5ml的反应缓冲液(25mM HEPES， pH = 7. 2,100mM KC1, lOmM MnC12，10%甘油和5mM DTT)中。通过超声处理裂解细胞(以 35%功率，10X30sec)。向裂解物加入0. 33mg/mL的FPP，并将混合物转至玻璃管中。用庚 烷覆盖反应并在23°C温育12小时。通过涡旋混合物淬灭反应并且萃取。除去0. lmL的庚 烷并且通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析样品。实施例3句,括与烟道气梓触牛长的藻类的样品的5 ^C分布测量用于液体样品分析的技术是EA_IRMS(元素分析仪同位素比质谱法)。在该方法 中，称量样品和参照放入锡胶囊中、密封并加载到Europa Scientific元素分析仪上的自 动取样器中。然后，样品顺序放到保持在1000°C的炉中并且在氧的存在下燃烧。该锡胶 囊迅速燃烧，在样品区域升温至 1700°C。在氦流中将燃烧气体扫过燃烧催化剂(Cr203)、 氧化铜丝(用于氧化烃)和银绒线(silver wool)，以除去硫和卤化物。得到的气体N2、 N0X、H20、02和C02通过保持在600°C的纯铜丝的还原台。这除去了任何氧并且将N0X种类 转化为N2。高氯酸镁化学阱(chemical trap)被用于除去水。禾U用保持在100°C的恒定温 度下的填充柱气相层析，分离氮和二氧化碳。得到的二氧化碳峰进入Europa Scientific 20-20IRMS的离子源，在其中被离子化并被加速。在磁场中分离不同质量的气体种类，然后 同时利用法拉第筒集电器阵列(Faraday cup collector array)测量，以测量C02在m/z 44、45和46的同位素。分批进行分析，通过该分析，在分析参照之后，分析许多样品，然后 分析另一参照。用于分析的参照材料包括IA-R001 (Iso-Analytical工作标准粉，S 13CVPDB =-26. 43% )。在样品分析期间，测量了 IAEA-CH-6 (IAEA 蔗糖标准，8 13CVPDB = -10. 43% ) 和IA-R005 (Iso-Analytical工作标准甜菜糖标准，S 13CVPDB = -26. 03% )，用于质量控 制。IAEA-CH-6是国际能源机构(IAEA)发布的实验室间比较标准。IA-R001和IA-R006 相对校准并且起源于IAEA-CH-6。用于碳-13分析的参照材料包括相对PDB具有S 13C值 为-28. 06%。的 Iso-Analytical 矿物油标准(IA-R002)。IA-R002 起源于 NBS-22 (矿物油)， 由 IAEA 发布，具有相对 PDB 为-29. 81 %。的接受 S 13C 值。IA-R002、IA-R024 (Iso-Analytical 橄榄油标准，-29. 27%。的 8 13C,起源于 NBS-22)和 IA-R044 (Iso-Analytical 玉米油标 准，-16. 27%。的5 13C，起源于NBS-22)被用作每一批样品分析中的质量控制检查样品。用于分析二氧化碳样品的技术是GC-IRMS(气相色谱同位素比质谱)。在这种技术中，利用注射器和针，从气体包(装配有隔片)取等份的样品气体。气体样品被注入填充 柱气相色谱仪(柱类型:Porapak Q,80/100目，6，x 74”SS)，以分辨二氧化碳，并且其被保 持在40°C的等温GC温度下。使用20psi的柱压，通过柱的流速大约为60ml/min。得到的 C02色谱峰进入Europa Scientific 20-20IRMS的离子源，在其中被离子化并被加速。在磁 场中分离不同质量的气体种类，然后同时利用法拉第筒集电器阵列测量，以测量C02在m/ z 44、45和46的同位素，用于13C分析。使用与样品相同的流动路径，参照气体(C02)样品 被注入GC-IRMS。用于确定样品气体的S13C值的参照气体是IA-R060(对于V-PDB，6 13C =-35. 63% )。IA-R060 起源于 NBS-19 (对于 V-PDB，8 13C 值为 +1. 95% )，其被位于维也 纳的国际能源机构公布为同位素参照标准。分析IA-R060的样品，作为检查样品以及用于 质量控制的样品。测量许多样品化合物包括作物植物(如甜菜糖、蔗糖、橄榄油、玉米油、小麦面粉 和甘蔗糖)、气体样品(如环境空气和烟道气)以及原油的S13C分布的实验结果。作为比 较，测量藻类样品(生长在环境空气中的藻类、生长在有限二氧化碳烟道气中的藻类以及 生长在过量二氧化碳烟道气中的藻类)的S13C分布，以显示来自无机碳源的碳到有机分子 的碳固定掺入，所述有机分子如本文所述的燃料产品或组合物。结果总结在图5中。作物植物，一般生长在环境空气中，显示出-20. 02%。的平均S13C分布。作物植物 的S 13c分布值的范围是-10. 43%。(对于蔗糖)至-29. 28%。(对于橄榄油)。作物植物的 其它5 13C值包括对甘蔗糖为-11. 66%。，对玉米油为-16. 22%。，对于甜菜糖为-26. 03%。以 及对于小麦面粉为-26. 47%。。所有这些S13C值都大于-32%。。石油原油样品取自9个不同的来源。原油样品的平均813(为_27.76%。，并且 在-26. 77%。至-30. 18%。的范围。这些值与矿物燃料的5 13C的文献值一致。所有这些S 13C 值都大于-32%。，并且因此，没有显示出从最近生长(在50年之内)光合生物提取的产物 或组合物的5 13C分布，所述光合生物与烟道气或来自矿物燃料的无机碳源接触，如本文所 述。如图5所示，烟道气显示出-35. 92%。的S13C分布。烟道气可以来自石油或矿物 燃料产品的燃烧。作为比较，环境空气S13C分布被认为是大约-8%。至-8. 5%。。藻类利用将气体鼓泡通过光生物反应器而生长。生长了三种不同类型的藻类一 种与环境空气接触生长，一种与有限的烟道气接触生长而一种则与过量烟道气接触生长。 例如，生长在有限烟道气中的藻类用来自烟道气的二氧化碳气体鼓泡，其中气体中二氧化 碳的量与环境空气中二氧化碳的量类似(或小于大约1%)。例如，生长在过量烟道气中的 藻类由包括来自烟道气的二氧化碳的气体鼓泡，其中所提供气体中二氧化碳的量为气体总 量的大约3-7% (或大约5%)。同样地，分析了两种另外的藻类样品，生长在露天池塘中单 独设施处有限烟道气中的藻类，和生长在单独设施处主要过量烟道气中的藻类。然后干燥 并燃烧藻类样品以测量这些样品的S13C分布，如在这里本实施例中所描述的。在图5中图解了生长在环境空气、有限烟道气和过量烟道气中的藻类样品的S 13C 分布的测量结果。生长在环境空气中的一个藻类样品具有-12. 90%。的S13C分布，这个结 果是预期的，原因是，如所讨论的，例如由于如本文所述的RuBisCO酶，光合生物在光合作 用过程中可以对12C而不是13C具有偏爱性。因此，其中的光合生物和有机分子应该具有小 于无机碳源的S13C分布的S13C分布。
6个生长在有限烟道气中的藻类样品被分析并且具有-22. 57%。的平均5 13C分布 以及-14. 87%。至-32. 03%。的范围。变化可能是由于所提供的烟道气的量、烟道气的速率、 藻类种类的差异——其可能具有更有效的碳固定或RuBisCO，或者在生长期间提供给生物 的光量所引起。作为实例，两个藻类样品提供了在-14. 87%。和-16. 28%。的最高W，这些 样品的两个与另外四个样品相比，与更高量的碳酸氢盐接触生长。碳酸氢盐具有比烟道气 更大的S13C值，并且也是藻类的无机碳源，因此，这些值最有可能由于碳酸氢盐和烟道气 在这些生物中的碳固定而更低。5个生长在过量烟道气中的藻类样品被分析并且具有-52. 06%。的平均5 13C分 布以及-40. 65%。至-55. 34%。的范围。过量烟道气是由矿物燃料的燃烧提供的烟道气。生 长在过量烟道气中的藻类的S13C值都小于-32%。。藻类中的有机分子已经用烟道气的无 机碳进行了碳固定，以便这些分子具有低的S 13C分布——比在石油或其它矿物燃料中发 现的更低的S13C分布。组合物和/或燃料产品可以从包含小于_32%。(例如-40. 65%。 至-55. 34%。)的S13C分布的藻类中提取并纯化。除了 S13C分布小于已知的石油S13C分 布和本实施例中测量的石油S13C分布之外，组合物可以与用于燃料产品的石油组合物相 同或相似。
3权利要求
组合物，其包括包含氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少80％，并且其中所述组合物的δ13C分布为小于-32‰。
2.权利要求1所述的组合物，其包括异戊二烯单元。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少90%。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少95%。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少99%。
6.权利要求3所述的组合物，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的100%。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为液体。
8.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为燃料添加剂。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为燃料产品。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为萜或类萜。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不是脂肪酸。
12.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不是脂肪酸酯。
13.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的δ13C分布为小于-35%。。
14.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的δ13C分布为小于-40%。。
15.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有85-120的辛烷值。
16.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有大于90的辛烷值。
17.燃料产品，其包括a.组合物，其包括包含氢和碳原子的分子，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重 量的至少80%，并且其中所述组合物的δ 13C分布为小于-32%。；和b.燃料成分。
18.权利要求17所述的燃料产品，其中所述燃料成分为选自下述的调合燃料矿物燃 料、用于燃料调合的混合物、汽油、柴油、乙醇、喷气式发动机燃料和其任何组合。
19.权利要求18所述的燃料产品，其中所述调合燃料具有大于-32%。的δ13C分布。
20.权利要求17所述的燃料产品，其中所述燃料成分是选自下述的燃料添加剂ΜΤΒΕ、 抗氧化剂、抗静电剂、缓蚀剂和它们的任何组合。
21.权利要求17所述的燃料产品，其中所述组合物包括异戊二烯单元。
22.权利要求17所述的组合物，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少 90%。
23.权利要求17所述的燃料产品，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少 95%。
24.权利要求17所述的燃料产品，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的至少 99%。
25.权利要求22所述的燃料产品，其中所述氢和碳原子为所述组合物的重量的100%。
26.权利要求17所述的燃料产品，其中所述组合物为萜或类萜。
27.权利要求17所述的燃料产品，其中所述组合物为液体。
28.权利要求17所述的燃料产品，其中所述组合物不是脂肪酸。
29.权利要求17所述的燃料产品，其中所述组合物不是脂肪酸酯。
30.产生二氧化碳的方法，其包括燃烧组合物从而产生二氧化碳，其中所述二氧化碳具有小于-32%。的δ 13C分布。
31.权利要求30所述的方法，其中所述二氧化碳具有小于-35%。的δ13C分布。
32.权利要求30所述的方法，其中所述二氧化碳具有小于-40%。的δ13C分布。
33.权利要求30所述的方法，其中所述燃烧在汽油发动机中进行。
34.权利要求30所述的方法，其中所述燃烧在柴油发动机中进行。
35.权利要求30所述的方法，其中所述燃烧在喷气式发动机中进行。
36.权利要求30所述的方法，进一步包括从无维管光合生物提取所述组合物。
37.权利要求36所述的方法，进一步包括上调所述生物中的酶，其中所述酶的产物是 所述组合物。
38.权利要求37所述的方法，其中所述酶不自然存在于所述生物中。
39.标记组合物的方法，其包括a.获得所述组合物的δ13C分布的测量；和b.利用所述测量标记所述组合物。
40.权利要求39所述的方法，其中所述标记包括指示所述组合物的δ13C分布的测量。
41.权利要求39所述的方法，其中所述组合物的δ13C分布的测量为小于-32%。。
42.权利要求39所述的方法，其中所述组合物是燃料产品。
43.权利要求42所述的方法，其中所述组合物包括燃料成分。
44.权利要求39所述的方法，其中所述标记包括指示可再生来源。
45.权利要求39所述的方法，进一步包括跟踪所述组合物。
46.权利要求45所述的方法，其中所述跟踪包括将未知组合物的碳同位素分布与所述 测量进行比较。
47.权利要求45所述的方法，其中所述跟踪包括确定所述组合物的位置。
48.权利要求45所述的方法，其中所述跟踪包括用计算机系统监测所述组合物。
49.从无维管光合生物产生燃料产品的方法，其包括a.培养无维管光合生物，其中所述生物产生第一燃料产品；b.使所述生物与无机碳源接触；和c.将来自所述无机碳源的碳掺入所述第一燃料产品， 其中所述第一燃料产品具有小于_32%。的δ 13C分布。
50.权利要求49所述的方法，其中所述无机碳源包括含有13C的二氧化碳和含有12C的二氧化碳。
51.权利要求49所述的方法，其中使所述生物与无机碳源接触包括使所述生物与过量 无机碳源接触。
52.权利要求49所述的方法，其中所述生物包括一个或多个核酸，所述一个或多个核 酸编码其终产物是所述第一燃料产品的一种或多种酶。
53.权利要求52所述的方法，其中所述核酸是异源的。
54.权利要求49所述的方法，其中所述第一燃料产品不是由所述生物自然产生的。
55.权利要求49所述的方法，其中所述第一燃料产品包括萜或类萜。
56.权利要求49所述的方法，其中所述无机碳是矿物燃料无机碳。
57.权利要求56所述的方法，其中所述矿物燃料无机碳具有大于-32%。的δ13C分布。
58.权利要求49所述的方法，进一步包括提取所述第一燃料产品。
59.权利要求58所述的方法，进一步包括精炼所述第一燃料产品。
60.权利要求59所述的方法，其中所述精炼包括选自下述方法的至少一种加氢裂解、 催化裂化、蒸汽裂解、裂化、分馏、蒸馏、加氢处理和其任何组合。
61.权利要求58所述的方法，进一步包括产生包含所述第一燃料产品和燃料成分的燃 料广品。
62.权利要求49所述的方法，进一步包括燃烧所述第一燃料产品以及因此产生富S13C 的无机碳。
63.权利要求62所述的方法，其中所述富δ13C的无机碳具有小于-32%。的δ 13C分布。
64.出售碳信用额的商业方法，其包括a.获得组合物的δ13C分布的测量；和b.将所述组合物的δ13C分布与参照δ 13C分布进行比较；c.如果所述组合物的S13C分布小于参照δ13C分布，则出售碳信用额给实体，其中所 述实体是所述组合物的所有者或使用者。
65.权利要求64所述的方法，其中所述参照313(分布为大约-32%0。
66.权利要求64所述的方法，进一步包括利用所述测量标记所述组合物
67.权利要求64所述的方法，进一步包括跟踪所述组合物。
68.产生燃料产品的方法，其包括；a.培养无维管光合生物；b.使所述生物与烟道气接触；和c.从所述无维管光合生物中提取燃料产品。
69.权利要求68所述的方法，进一步包括基因修饰所述生物。
70.权利要求69所述的方法，其中所述燃料产品不是自然存在于所述生物中。
71.权利要求68所述的方法，其中所述燃料产品包括氢和碳原子，其中所述氢和碳原 子为所述组合物的重量的至少90%，并且其中所述组合物的δ 13C分布为小于_32%0。
72.权利要求68所述的方法，进一步包括精炼所述燃料产品。
全文摘要
本文提供的是通过光合生物生产产物的组合物和方法。光合生物可以被基因修饰以影响产物的产生、表达或两者。所述方法和组合物在石化工业中特别有用。
文档编号C10L1/00GK101889068SQ200880115332
公开日2010年11月17日 申请日期2008年9月10日 优先权日2007年9月11日
发明者A·阿拉瓦尼斯, J·派尔 申请人:蓝宝石能源公司