专利名称：一种提高量子点编码微球的编码稳定性的方法
技术领域：
本发明属于药物筛选和纳米技术领域，具体涉及一种提高量子点(QDs)编码微球的编码稳定性的方法，这种微球可在多元化检测和分析领域有很广阔的用途，尤其有利于新型自编码光谱识别高通量药物筛选系统的实现。
背景技术：
基于编码微球的多元化分析检测是目前药物开发研究中的热点，其中，利用纳米量子点(QDs)的发光特性对微球进行编码是近年才提的新思路，该方法在药物筛选和纳米技术领域具有广阔的应用前景，尤其适用于新型自编码光谱识别高通量药物筛选系统的构建。
在量子点编码微球的制备过程中，将不同发射波长的量子点按照一定比例吸附在微球表面或者渗入到微球内部，从而对微球进行特定编码。微球的编码信号主要是由两个因素组成的发射波长和荧光强度。发射波长是QDs本身固有特性，与浓度无关；而荧光强度则与微球中所负载的量子点的数量有关。因此，虽然QDs有窄的半峰宽(20～30nm)，但是在可见光400～700nm范围内，考虑到波长重叠问题，能够用来编码的QDs的种类也是有限的。要产生尽量多的编码，必须对荧光强度进行重点考虑，即严格控制负载在微球上的QDs的数量。然而，在已报道的编码技术中，作为编码信号的量子点都存在不同程度的泄漏，这导致了微球中量子点数量的改变从而影响到编码的稳定性，严重阻碍了利用不同波长、多个荧光强度的QDs对微球进行密集编码的实现。见Shuming Nie et al.，NatureBiotech.2001.19.631-635.
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高量子点编码微球的编码稳定性的方法，该方法可以很好地抑制微球中量子点的泄漏，提高量子点编码的稳定性和编码信号的精确性。
本发明提供的一种提高量子点编码微球的编码稳定性的方法，其步骤为(1)对待编码的微球表面进行功能化修饰和多孔化处理；(2)将处理后的微球放入量子点溶液中，吸附到编码溶液中的荧光强度不再变化后，取出微球进行充分洗涤；(3)将上述量子点编码微球加入到环己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的体积百分比为1～10％，氨水的体积百分比为0.04-4％，通过硅酸酯水解反应形成硅颗粒沉积在编码微球表面，形成一层外壳；(4)将上述被包埋的量子点编码微球与生物探针连接。
步骤(1)采用采用氯磺酸的二氯甲烷溶液对待编码的微球表面进行多孔化处理，其中，氯磺酸的体积百分比为0.3-1％。
本发明将量子点的荧光光谱特性转换为微球的编码信号，进而对微球进行包被处理以获得稳定的编码特征。本发明以提高多孔性微颗粒的荧光编码特别是量子点编码精确性及其稳定性为研究对象；本发明通过对微颗粒进行处理，使其表面既有功能化接枝的“手臂”分子，又产生多孔性；本发明还通过对掺入多孔性微球的量子点进行固定化包被处理，保护掺入的量子点不被氧化和保护微球不受化学试剂或者生物试剂的破坏。本发明操作简单，可以推广到各种微球的编码应用上，同时还有助于实现快速准确识别，尤其可以促进新型自编码光谱识别高通量药物筛选系统的实现。
图1(a)为量子点的紫外吸收图，图1(b为量子点的荧光发射光谱图；
图2为微球的红外光谱图其中(a)原始微球；(b)-COOH功能化的微球；(c)硅包被微球；图3为SEM扫描电镜下微球表面的形貌图(A)磺化接枝前的微球表面形貌；(B)磺化接枝后的微球表面形貌；图4为硅包被4小时微球表面的SEM形貌图；图5为硅包被对微球上-COOH含量的影响；图6为不同包被时间对量子点泄漏的影响；图7为不同包被时间对量子点荧光半衰期(t1/2)的影响，半衰期是通过指数曲线拟合试验数据得到的，0小时是指没有包被的微球；图8为不同处理条件下微球的荧光光谱图其中(A)PS+DNA；(B)PS+EDC+DNA-FITC；(C)PS-COOH+DNA-FITC；(D)PS-COOH+EDC+DNA-FITC；硅包被条件均为4小时。
具体实施例方式
本发明的具体步骤为(1)对待编码的微球表面进行功能化修饰和多孔化处理；对各种纳米或微米级的微球(如聚合物微球、硅颗粒)，通过物理吸附或化学反应使该微球具备功能化表面，即微球的表面修饰有氨基、羧基、巯基、羟基、卤素基(包括氟、氯、溴、碘)的分子。
功能化修饰和多孔化处理可同步或分步进行，不受操作顺序限制。
采用氯磺酸的二氯甲烷溶液对待编码的微球表面进行多孔化处理，其中，氯磺酸的体积百分比为0.3-1％。
多孔化处理也可以采用含有甲基丙烯酸酯或苯乙烯同系物的化学试剂。
(2)对上述微球进行量子点编码将处理后的微球放入QDs溶液中，吸附到编码溶液中的荧光强度不再变化后，取出微球进行充分洗涤。
其中QDs溶液的配制为根据编码信号的波长和相对强度，分别将其转化成量子点的发射波长和摩尔浓度，再根据发射波长确定溶液中量子点的种类，根据摩尔浓度确定这些量子点的浓度比例。
(3)对量子点编码微球进行稳定化处理将上述量子点编码微球加入到包被液中，通过包被液中的硅酸酯在碱性条件下水解形成硅颗粒沉积在编码微球表面从而形成一层外壳，其厚度通过包被时间米控制，该外壳对其负载的量子点进行包埋处理。
其中包被液为环己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的体积百分比为1～10％，氨水的体积百分比为0.04-4％。
(4)连接量子点编码微球与生物探针。
生物探针包括蛋白质、核酸、糖类、肽等生物分子或醇和羧酸。针对不同的生物探针，采用相应的物理吸附或发生共价化学反应连接量子点编码微球与生物探针。
包被后表面修饰的功能化分子在与生物探针连接后通过光谱仪能实现对探针信号的检测。
实施例1下面以量子点编码聚苯乙烯树脂微球(PS)的制备为例，对本发明的实施做详细说明。
(1)称取0.5g微球，加入含0.8％(vol)氯磺酸的二氯甲烷溶液，搅拌反应0.5小时，吸出残液，再加入10ml含有4g 6-氨基正己酸的环己烷/蒸馏水(1∶1，体积比)溶液，搅拌反应24小时，过滤取出微球，用0.1M HCl和0.1M的NaOH溶液交替洗涤3次后用蒸馏水洗涤3次，干燥。图2是通过磺化接枝处理后微球的红外光谱图，图3(B)是通过磺化处理后的微球。
(2)将步骤(1)所得微球0.45g放入5ml QDs溶液中，振荡吸附1小时，离心，用乙醇洗涤微球至乙醇残液中无荧光，干燥得到量子点编码微球。
上述QDs溶液为氯仿/正丁醇(9∶1，体积比)混合液稀释发射波长在571nm的QDs，使最终的浓度为10-7M。量子点的紫外及其发射光谱见图1。
(3)将0.40g量子点编码微球加入到含有7.5ml环己烷、0.2ml氨水(26％，w％)混合液中，再加入0.5ml正硅酸乙酯(TEOS)，振荡反应2小时，过滤取出微球，用乙醇洗涤3次，干燥；改变反应时间为4、6、8、12、24小时，分别重复此步操作。图2(c)是硅包被后的红外光谱图。图4为包被时间为4小时的表面形貌图。
称取0.1g步骤(3)处理后的微球用3ml的KOH的甲醇溶液(含KOH为2.771mmol)浸泡24h，过滤后保留残液用蒸馏水洗涤3次，定容至6ml，取2ml稀释成5ml，用0.01M的HCl标准溶液滴定，作3次平行试验，计算在不同的硅包被时间下，微球表面的-COOH的含量。结果见图5，包被4小时剩余-COOH的含量在2.1mmol/g左右。
包被后的微球0.05g用5ml氯仿浸泡，振荡，每隔一段时间测氯仿中的荧光强度，结果见图6。
不同包被时间的单个编码微球在倒置Olympus(IX71)显微镜下用汞灯(λ＝400~440nm)连续激发，通过光纤与显微镜相连的光谱仪测量其荧光强度的变化，数据经过指数拟合。见图7，包被时间4小时的值是530秒左右。
(4)经过步骤(3)处理后的微球0.01g室温下于2ml PBS缓冲液中与3μmol的FITC标记DNA在偶联剂EDC存在下反应24小时，过滤取出微球，用PBS缓冲液洗涤至残液中没有荧光，干燥后用光谱仪测单个微球表面的荧光，结果见图8。
权利要求
1.一种提高量子点编码微球的编码稳定性的方法，其步骤为(1)对待编码的微球表面进行功能化修饰和多孔化处理；(2)将处理后的微球放入量子点溶液中，吸附到编码溶液中的荧光强度不再变化后，取出微球进行充分洗涤；(3)将上述量子点编码微球加入到环己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的体积百分比为1～10％，氨水的体积百分比为0.04-4％，通过硅酸酯水解反应形成硅颗粒沉积在编码微球表面，形成一层外壳；(4)将上述被包埋的量子点编码微球与生物探针连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)采用采用氯磺酸的二氯甲烷溶液对待编码的微球表面进行多孔化处理，其中，氯磺酸的体积百分比为0.3-1％。
全文摘要
本发明属于药物化学和分析技术领域，具体为一种提高量子点编码微球的编码稳定性的方法。其步骤为对待编码的微球表面进行功能化修饰和多孔化处理；将处理后的微球放入量子点溶液中，吸附均匀后取出微球洗涤；再将量子点编码微球加入到环己烷、氨水(0.04－4％vol)和硅酸酯(1～10％vol)的混合液，通过水解反应形成硅颗粒沉积在微球表面，形成外壳；最后将被包埋的微球与生物探针连接。本发明通过微颗粒表面处理，使其表面既有功能化接枝的“手臂”分子，又产生多孔性；并通过包被处理保护掺入的量子点不被氧化和保护微球不受化学或生物试剂的破坏。本发明方法简单，易行，能利用预提取的编码特征对微球进行准确识别，有助于高通量药物筛选系统的实现。
文档编号B82B3/00GK1775654SQ20051001962
公开日2006年5月24日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者曹元成, 黄振立, 赵元弟, 王海桥 申请人:华中科技大学