专利名称：微流控芯片毛细管电泳负压进样方法
技术领域：
本发明涉及微流控芯片毛细管电泳分析技术，特别是涉及在微流控芯片毛细管电泳上负压进样和分离技术。
背景技术：
自从1990年提出微全分析系统概念以来，微流控芯片技术在医学和生命科学等领域开辟了广阔的发展空间。微流控芯片毛细管电泳技术已用于DNA测序，DNA片段的分离和鉴定，氨基酸、多肽、蛋白质的分离测定以及单细胞内组分的分析等。
对于上述应用，准确控制皮升级的样品进样量是分离测定的关键。目前普遍采用基于电渗流驱动的电动进样方式进样，如电夹流进样，悬浮进样和门式进样等。但是由于电动进样时有“歧视效应”，即正负离子在电场中迁移速度不一致，导致样品塞的组成与样品溶液的组成不一致。通过延长进样时间可以减小样品塞与样品溶液组成上的差异，但又削弱了微流控芯片快速分析的特点。同时，芯片毛细管表面性质的变化会导致电渗流大小的改变，使进样量的精密度大大降低；毛细管表面性质变化严重时，电渗流方向也会改变，使样品无法进入进样和分离通道。
为了解决上述问题，在微流控芯片毛细管电泳的进样技术方面，也有压力进样的报道。即在注样阶段，用注射泵或其他驱动器，施加压力驱动样品池中样品进入进样通道，并通过进样通道和分离通道的交叉处流入废液池。由于微流控芯片的网络结构，为了防止样品溶液在进样时进入分离通道而导致分离效率降低，需要使用双注射泵或三个注射泵，或者使用计算机通过软件和压力传感器控制多个电控阀，使样品溶液在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞，从而增加了进样系统的成本和进样操作的难度；在分离阶段，在微流控芯片交叉处已形成皮克级的样品塞被加在分离通道上的电场所产生的电渗流带入分离通道分离测定。如果导电的样品或电泳缓冲液泄漏出输液设备，会导致输液设备带高压电而影响安全操作。
发明内容
本发明目的是提供一种操作方便、安全、进样量重现性好、无“歧视效应”和使用设备简单的微流控芯片毛细管电泳负压进样技术。克服目前微流控芯片毛细管电泳电动进样时进样速度慢，进样量随微通道表面性质的改变而改变，进样需用多路电源和控制系统等的不足。与现有的压力进样技术相比，本发明具有操作简单，安全，微流控芯片中带电的液体通过空气或真空与产生负压和释放负压的泵和阀等装置相绝缘等特点。
本发明提供的微流控芯片毛细管电泳进样的方法，其特征是采用专用负压进样和分离的装置，由注样和分离二个阶段组成在注样阶段，负压进样和分离的装置中三通阀的b端和c端连通，柱塞泵通过三通阀和接口抽取样品废液池中的空气，在样品废液池内造成负压，微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液在大气压的作用下向样品废液池流动，在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞；在分离阶段，切换负压进样和分离的装置中的三通阀b端和a端连通。由于三通阀的a端直接与大气相通，从而使使样品废液池与大气相通，样品废液池上的负压释放，在微流控芯片交叉处已形成的样品塞被加在分离通道上高电场所产生电渗流带入分离通道，开始电泳分离检测；分离结束前，三通阀a端和c端连通，柱塞泵压出空气而复位。
本发明专用负压进样和分离的装置，由微流控芯片、柱塞泵、三通阀、接口，高压电源组成，其特征是三通阀a端口直接与大气相通，柱塞泵与三通阀c端口相接，三通阀b端口通过联接管道与接口相通，微流控芯片上有缓冲液储液池B、缓冲液废液储液池BW、样品储液池S、样品废液池SW，接口安装在微流控芯片样品废液池SW上面。微流控芯片进样通道为S-SW，分离通道为B-BW，分离通道B-BW二端与高压电源相连接。
本发明微流控芯片中带电的液体通过空气或真空与产生负压和释放负压的泵和阀等装置相绝缘。
本发明柱塞泵和三通阀由计算机或单片机控制，自动实现抽气，切换阀位操作。
本发明柱塞泵抽气的时间为1-10秒，抽气的体积为50-500μL。
本发明负压维持时间为1-10秒。
在本发明中，由于样品溶液在压力差的作用下流动，避免了电动进样的歧视效应和进样对电渗流的依赖；同时，溶液在压力差作用下的流速要远大于电渗流的流速，使进样速度大大提高，从而提高了微流控芯片毛细管电泳的分析样品的速度；且在产生负压的泵和阀内无导电液体，大大提高了本发明操作的安全性。本发明所用设备简单，除微流控芯片外，仅用一个柱塞泵，一个三通阀和一个高压电源。
图1负压进样微流控芯片毛细管电泳分离装置示意2微流控芯片与三通阀接口示意3负压进样微流控芯片毛细管电泳分离电泳中1-微流控芯片，2-柱塞泵，3-三通阀及a、b、c三个端口，4-接口，5-高压电源，6-进样通道，7-样品废液储液池中的溶液，8-样品废液储液池中液面上方的空气，9-样品废液储液池SW，10-密封胶管，11-联接管道。
具体实施例方式
实施例1本发明的微流控芯片负压进样毛细管电泳分析方法步骤如下负压进样微流控芯片毛细管电泳分离的装置图见图1。其中1代表微流控芯片，微流控芯片上B和BW之间的通道是分离通道，S和SW之间的通道是进样通道，B、BW、S和SW分别代表缓冲液储液池、缓冲液废液储液池、样品储液池和样品废液池。2代表注射泵，3是三通阀，4是接口，5是高压电源。在微流控芯片上样品储液池S中加入样品溶液，在其他储液池B、SW、BW加入不同体积的电泳缓冲液，保持分离通道两端储液池B和BW的液面高度相同，样品储液池S中液面的高度小于分离通道两端储液池B和BW的液面高度，样品废液储液池SW中的液面高度小于储液池S中液面的高度，防止样品溶液在分离时进入分离通道。用聚四氟乙烯管将柱塞泵2通过三通阀3和接口4与微流控芯片的样品废液池(SW)相连。接口示意图见图2。其中6为进样通道，7为样品废液储液池中的溶液，8是样品废液储液池中液面上方的空气，9是样品废液储液池SW，10是密封胶管，将联接用聚四氟乙烯管11-端插入密封胶管10中，再将密封胶管插入废液储液池上部，插入的密封胶管始终保持不与SW储液池内的电泳缓冲液的液面相接触，同时保证接口的气密性。
微流控芯片毛细管电泳分析的操作由注样和分离二个阶段组成。在注样阶段，三通阀3的b端和c端连通，使柱塞泵2通过三通阀3和接口4在1-10秒钟内抽样品废液池(SW)中50-500μL空气，使样品废液池(SW)内造成负压，并保持负压1-10秒钟，微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液等在大气压的作用下向样品废液池流动，在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞；在分离阶段，使三通阀b端和a端连通。由于三通阀的a端直接与大气相通，从而使使样品废液池与大气相通，它与其它液池之间的压力差立即同时消失。在微流控芯片交叉处已形成皮克级的样品塞被加在分离通道上的电场所产生的电渗流带入分离通道，开始电泳分离；分离结束前，使三通阀a端和c端连通，柱塞泵在1-10秒钟内压出50-500μL空气，使柱塞复位。
实施例2根据实施例1提供更具体的一个优化实例，参见图1，微流控芯片上通道宽度为10-100μm，深5-50μm，其中S与SW之间的通道是进样通道，长度为5-50mm，B和BW之间的通道是分离通道，长度为10-100mm。分离通道与进样通道十字交叉，或为双T结构。在进样通道和分离通道两端各打小孔，在小孔上用粘接剂粘合微量塑料储液池，塑料储液池外径6mm，内径4mm，高6mm。分别用S、SW、B、BW表示样品储液池、样品废液储液池、缓冲液储液池和缓冲液废液储液池。在储液池B和BW中分别加入150μL 20mmol/L pH9.2的硼砂缓冲液，在储液池S加入样品溶液90μL，样品溶液的组成为4.0×10-7mol/L荧光素钠(Flu)和6.0×10-7mol/L罗丹明123(Rh123)的混合物，样品废液池SW中加45μL 20mmol/L pH9.2的硼砂缓冲液溶液。
取外径为1.6mm内径0.8mm的聚四氟乙烯管作为连接管，一端与三通阀b相接，另一端插入作为密封胶管的硅橡胶管中，硅橡胶管长10mm，内径1.5mm，外径4.1mm，再将密封胶管插入废液储液池SW上部。始终保持插入的密封胶管不与SW储液池内的电泳缓冲液的液面相接触，同时保证接口的气密性。
将激光光斑聚焦在分离通道上距通道十字交叉点10mm的检测点处，用激光荧光法检测电泳分离结果。在分离通道B端施加+1200V高电压，BW端接地。用微机控制三通阀3的b端和c端连通，用注射器容积为0.5-1mL的柱塞泵2通过三通阀3和接口4在3秒钟内抽样品废液池(SW)中100微升空气，使样品废液池(SW)内造成负压，并保持负压2秒钟，微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液等在大气压的作用下向样品废液池流动，在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞；切换三通阀使b端和a端连通，在微流控芯片交叉处已形成皮克级的样品塞被加在分离通道上的电场所产生的电渗流带入分离通道，开始电泳分离，同时记录电泳图；分离结束前，使三通阀a端和c端连通，柱塞泵在3秒钟内压出100微升空气，使柱塞复位。分离得到的电泳图见图3。连续进行56次分析，罗丹明123和荧光素钠迁移时间的标准相对偏差分别为3.3和1.5％，峰高的标准相对偏差分别为6.2和4.4％，峰面积的标准相对偏差分别为7.8和5.5％。
权利要求
1.一种微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是采用专用负压进样和分离的装置，其操作由注样和分离二个阶段组成在注样阶段，采用柱塞泵通过三通阀和接口抽取样品废液池中的空气，在样品废液池上形成负压，微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液在大气压的作用下向样品废液池流动，在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞；在分离阶段，通过三通阀切换阀位使样品废液池与大气相通，样品废液池上的负压释放，其它储液池中缓冲液和样品溶液立即停止向样品废液池流动，在电渗流的驱动下，在进样通道和分离通道的交叉处形成的皮克级样品塞进入分离通道，从而实现样品的分离检测。
2.权利要求1所述的微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是所述专用负压进样和分离的装置，由微流控芯片、柱塞泵、三通阀、接口，高压电源组成，三通阀a端口直接与大气相通，柱塞泵与三通阀c端口相接，三通阀b端口通过联接管道与接口相通，微流控芯片上有缓冲液储液池B、缓冲液废液储液池BW、样品储液池S、样品废液池SW，接口安装在微流控芯片样品废液池SW上面，微流控芯片进样通道为S-SW，分离通道为B-BW，在分离通道B-BW二端设置高压电源。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是微流控芯片中带电的液体通过空气或真空与产生负压和释放负压的泵和阀等装置相绝缘。
4.根据权利要求1或2所述微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是所述柱塞泵和三通阀由计算机或单片机控制，自动实现抽气，切换阀位操作。
5.根据权利要求1或2所述的微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是柱塞泵所配制的注射器最佳容积为0.5-1mL，抽气的时间为1-10秒，抽气的体积为50-500μL。
6.根据权利要求1或2所述的微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是所述负压维持时间为1-10秒。
7.根据权利要求1或2所述的微流控芯片毛细管电泳负压进样方法，其特征是在微流控芯片上样品储液池S中加入样品溶液，在其他储液池B、SW、BW加入不同体积的电泳缓冲液，保持分离通道两端储液池B和BW的液面高度相同，样品储液池S中液面的高度小于分离通道两端储液池B和BW的液面高度，样品废液储液池SW中的液面高度小于储液池S中液面的高度，防止样品溶液在分离时进入分离通道。
全文摘要
一种微流控芯片毛细管电泳进样和分离方法，包括通过一个柱塞泵，一个三通阀和一组高压电源实现微流控毛细管电泳芯片进样和分离。其特征是利用微流控芯片的网络结构，采用柱塞泵通过三通阀和接口抽取样品废液池中的空气，在样品废液池上形成负压，微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液等在大气压的作用下向样品废液池流动，在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞；通过三通阀切换阀位使样品废液池与大气相通，其它储液池中缓冲液和样品溶液立即停止向样品废液池流动，在电渗流的驱动下，在进样通道和分离通道的交叉处形成的皮克级样品塞进入分离通道，从而实现样品的分离检测。
文档编号B81B1/00GK1737562SQ200510050458
公开日2006年2月22日 申请日期2005年6月27日 优先权日2005年6月27日
发明者殷学锋, 张磊 申请人:浙江大学