纳米治疗性胶态金属组合物和方法

专利名称：纳米治疗性胶态金属组合物和方法
技术领域：
本发明涉及全身递送试剂和递送试剂至特定部位的组合物和方法。通常，本发明涉及胶态金属组合物和用于制备和使用这样的组合物的方法。
背景技术：
长期以来，发现会追踪到需要的部位和递送治疗反应剂而没有过度副作用的魔术弹是治疗性治疗的目标。为了达到该目标，已经尝试了许多方法。治疗剂经过设计以利用活性剂的不同，所述不同比如疏水性或亲水性、或针对通过身体细胞不同处理的治疗性微粒的尺寸。如下治疗是存在的其通过原位注射递送治疗剂至特定的身体部分或特定的细胞，和利用或克服身体防御比如血脑屏障，所述身体防御限制了治疗剂的递送。一种用于特别地靶向治疗剂至特定组织或细胞的方法是基于治疗剂和特定受体的结合配偶体的组合的递送。例如，所述治疗剂可以是细胞毒素的或放射性的，当其与细胞受体的结合配偶体组合时，一旦结合靶细胞，其引起细胞死亡或干扰细胞活性的遗传控制。 这类递送装置需要对于待治疗的细胞类型有特异性的受体、所述受体的有效的结合配偶体和有效的治疗剂。已经使用分子基因操作来克服一些这些问题。将遗传序列特定地递送到外源细胞中或过度表达内源序列是目前非常令人感兴趣的方法。使用了将基因插入细胞的多种技术。这些技术包括沉淀、病毒载体、用微量吸液管和基因枪直接插入、及将核酸暴露于细胞。广泛使用的沉淀技术使用磷酸钙来沉淀 DNA，形成不溶性颗粒。该目标是使这些颗粒的至少一部分通过一般的细胞胞吞作用而内摄 (internalized)到宿主细胞内。这引起新的或外源基因表达。该技术使外源基因进入细胞内从而引起基因表达的效率低。基因的内摄对于转染的细胞是非特异性的，因为所有暴露的细胞都能够使外源基因内化，这是因为对于胞吞作用，不能依赖任何特定的识别位点。该技术在体外广泛使用，但是因为靶细胞选择的缺乏特异性和高度分化细胞的吸收差，还没有涉及其体内使用。另外，其体内使用受到沉淀的核酸的不溶性质的限制。类似的技术包括使用DEAE-Dextran用于体外转染细胞。DEAE-Dextran对细胞是有害的，并且还导致核酸非特异性插入细胞。该方法不建议体内使用。用于转染细胞或提供用于外源基因进入细胞的其它技术也受限制。使用病毒作为载体对于体外和体内引入外源基因到细胞中具有一些适用性。总是存在如下风险病毒蛋白的存在在体内使用中引起不需要的作用。另外，在可进入细胞的外源性遗传物质尺寸方面，病毒载体可能受到限制。反复使用病毒载体引起接受者的免疫反应，和限制了可以使用载体的次数。外源性基因递送也可以和脂质体-俘获的核酸一起使用。脂质体是膜封闭的囊， 其可以填充多种物质，包括核酸。脂质体递送不能提供向细胞的均勻递送，因为脂质体的填充不均勻。尽管脂质体可以靶向特定的细胞类型(如果包括针对受体的结合配偶体的话)， 但是脂质体具有破裂的问题，因而递送不是特异性的。插入外源核酸的强力技术包括用微量移液管或基因枪刺穿细胞膜，以将外源DNA 插入细胞中。这些技术对于某些手术工作良好，但是不是广泛可应用的。它们是高劳动密集的，需要非常有经验的处理受体细胞。这些不是在体内作用良好的简单手术的技术。电穿孔，用于改变细胞膜渗透性的使用电的方法，已经成功地用于将基因插入细胞的一些体外治疗。在靶向递送DNA至依赖于糖蛋白受体存在的特定细胞方面进行了一些尝试。该递送系统使用聚阳离子，比如聚赖氨酸，其非共价键合DNA，并且也共价键合配体。一旦开始细胞内摄机制，这样的使用聚阳离子共价键合至配体不会使所述递送系统分解。该大的复杂的、共价键合的递送系统与在细胞内天然存在的核酸的方式非常不同。如对于本领域技术人员显而易见的，继续需要长期寻找由颗粒递送系统促进的实体瘤的靶向癌症治疗，所述颗粒递送系统能够逃选网状内皮系统的噬菌清除(RES ； Papisov 1998，Moghimi，1998和Woodle，199 。在理想的条件下，这样的递送系统将优选地从肿瘤血管系统中渗出，并聚集在肿瘤微环境内(Nafayasu 1999，Maruyama 1999)。另外，能够仅仅将癌症药物螯合(sequestering)在肿瘤内的期望的颗粒递送系统也将减少所述药物在健康器官中的累积(Papisov 1998，Moghimi，1998 和 Woodle，1998，Nafayasu 1999, Maruyama 1999)。因此，这些递送系统将增加癌症治疗的相对功效或安全性，从而有助于增加药物的治疗指数。基于颗粒的药物递送领域目前集中于两种化学上不同的胶态颗粒，脂质体和可生物降解的聚合物(M Uller 2000, Jain, 1998, Rafferty, 1996, Ogawa 1997 和 Maruyama， 1998)。两种递送系统都包囊活性药物。在脂质体的情况下当其溶解时，或者如同对于可生物降解的聚合物所描述的当其崩解时，药物从颗粒中释放出。胶态金纳米颗粒代表一种基于颗粒的肿瘤靶向药物递送领域的完全新的技术。在 1857年，Michael Faraday首次报道了这些颗粒的合成，其描述了从氯化金和柠檬酸钠制备纳米尺寸的Au°颗粒的化学方法(Faraday，1857)。在20世纪50年代，发现这些颗粒的可以结合蛋白质生物学，而不会改变其活性，这为其在手持式(hand-held)免疫诊断学和组织病理学中的应用铺平了道路(Chandler，2001)。其中特别相关的是使用由Au198制备的放射性胶态金纳米颗粒治疗肝癌和肉瘤(Rubin 1964, Root 1954) 0静脉内给药这些纳米颗粒由于放射性暴露而导致药物相关的毒性。然而，从这些颗粒本身没有发现可证实的毒性。 最近，金纳米颗粒已经被装配到支架中，用于DNA诊断和生物传感器(Mirkin 1996)。生物纳米技术(或纳米生物技术)领域的出现提供了开发极其灵敏的诊断和器官 /肿瘤-靶向治疗的可能。例如，诊断的微型化不仅可以提供给临床医师在正常和疾病状态中更完全的血液化学、激素和生长因子的快照，而且也可以使其能够追踪(tract)公认的治疗的功效[Koehne等人，2004]。作为一个主要的实例，补充其预先的(advances)诊断生物纳米技术也使得有希望增加治疗指数，治疗指数是一种目前癌症治疗的益处/风险比例的测量标准[Papisov 等人，1998，Moghimi 等人，1998，ffoodle, 1998，Nafayasu 等人，1999， Maruyama等人，1999]。实际上，材料科学和肿瘤生物学的联合引起发展新的载体，其具有获得肿瘤靶向药物递送的长期追求的目标、使得活性剂仅到达实体瘤处需要其的位置的潜在性。然而，为了成功地实现该目标，纳米颗粒递送系统必须克服天然存在于身体中的和肿瘤生长和发展期间形成的生物屏障。这样的天然屏障包括，但不限于网状内皮系统的清除 (根据尺寸或调理作用(oposonization))、引起组织间隙(肿瘤)液压增加的肿瘤血管生成、配体/受体基纳米治疗靶点、肿瘤间质内的屏障实体瘤形成和细胞异质性期间建立的肿瘤内屏障。尽管在处理上述列出的天然屏障问题方面有一些进展，但仍然存在许多挑战。例如，肿瘤靶向药物递送载体还没有接近“真实的”或最佳的纳米尺寸，该纳米尺寸不仅会降低在血液中受调理作用和被网状内皮系统摄取(RES;即；较大颗粒比较小颗粒更好地激活补体)的可能，而且防止了其在存在于脾的红髓中内皮内狭缝的狭窄区域内的清除。据认为为了进一步改善避免RES，可以将亲水性聚合物嫁接到现用的纳米颗粒系统的表面上。一旦这些纳米颗粒载体自由地在身体内循环，据认为由于肿瘤新血管系统的内在漏洞 (inherent leakiness)和在这些纳米颗粒载体的表面上存在肿瘤特异性配体，它们可以被动地以及主动地螯合到实体瘤中和其周围。然而，这样的纳米颗粒还没有有效地进行实施。本领域技术人员也认识到在构建有效的纳米治疗中需要最后一个要素，其就是能够开发将多种治疗剂有效地递送到异源癌细胞群(包括实体瘤)的载体。在其最简单的模型中，实体瘤可以看作是包含在促进肿瘤生长方面共同起作用的多个细胞类型的器官 [Spremulli和Dexter, 1983，Dexter等人，1978]。因此，用于治疗介入的靶向单一类型细胞的药物可能只提供最低限度的抗肿瘤作用。而且，在许多情况下，在疾病进程和/或响应治疗期间，实体瘤细胞显示出连续谱的表型。因此，如下情况看起来是不可能的无论纳米颗粒递送系统将其螯合在实体瘤中的能力如何，单一试剂治疗将被证实抗恶性肿瘤内存在的无数细胞是有效的。因此，为了克服该限制，需要下一代纳米治疗剂，其不仅必须设法到达实体瘤，而且也必须有效地破坏促进肿瘤生长的不同细胞群。简而言之，目前不能获得用于将特定治疗剂递送到体内特定部位以治疗疾病或病理或检测这样的部位的有效递送系统。例如，癌症的当前治疗包括给药化疗剂及其它生物活性因子，比如细胞因子和免疫因子，其影响整个生物体。副作用包括器官损伤，感觉比如味觉和触感丧失及毛发损失。这样的治疗提供了病症的治疗，但是也需要治疗副作用的许多辅助治疗。需要针对能作用于期望的细胞或部位的试剂递送系统的组合物和方法。这些递送系统可用于递送所有类型的试剂至特定细胞，所述试剂包括检测剂和治疗剂。还需要不会引起整个生物体内不需要的副作用的递送系统。

发明内容
本发明包括用于试剂递送系统的组合物和方法，所述试剂包括，但不限于治疗化合物、药用试剂、药物、前药、检测剂、核酸序列和生物因子。通常，本发明提供作为多官能纳米治疗剂的这些递送或载体组合物，其基本上包括用于装配纳米药物的平台(比如胶态金属溶胶)、靶向配体(例如肿瘤靶向配体，比如肿瘤坏死因子(TNF))、隐形试剂(stealth agent)(比如聚乙二醇，用于水合纳米颗粒药物，从而防止其被网状内皮系统(RES)摄取和清除)、和在某些实施方案中的一种或多种活性剂或药物(比如帕利他西)。本发明进一步包括用于制备这样的胶态金属溶胶组合物的方法和组合物。本发明描述了胶态金纳米颗粒作为减慢所述纳米治疗剂在循环中水解转化的工具的用途。所述金纳米颗粒也促进治疗剂或诊断剂在疾病部位(即，实体瘤)的累积，在该处所述试剂慢慢地转变成其活性形式。在本发明的某些实施方案中，所述胶态金属溶胶包括金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、铁纳米颗粒、金属杂混纳米颗粒比如金/铁纳米颗粒、纳米壳 (nanoshlls)、金纳米壳、银纳米壳、金纳米棒(nanorods)、银纳米棒、金属杂混纳米棒、量子点、纳米簇、脂质体、树枝状聚合物、金属/脂质体颗粒、金属/树枝状聚合物纳米混合物和碳纳米管。在替换性实施方案中，所述靶向配体包括例如肿瘤坏死因子(TNF)。在本发明的仍然其它的实施方案中，所述保护剂可以包括PEG、HES(羟乙基淀粉) 、PolyPEG 或rPEG，其中任一种都可以使用其原始形式、硫醇化的或以其他方式衍生化的形式。可以在本发明中使用的其它的PEG样化合物包括，但不限于硫醇化的聚氧丙烯聚合物、硫醇化的嵌段共聚物或三嵌段共聚物(包括聚氧乙烯/聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段)。本发明的纳米治疗剂或载体组合物特别地用于实体瘤的检测或治疗。本发明的优选的组合物包括载体，其包括胶态金属溶胶(优选地金金属溶胶)与衍生化的-PEG、优选硫醇-peg、或衍生化的或硫醇化的HES 、PolyPEG 、衍生化的或硫醇化的PolyPEG 、 rPEG、衍生化的或硫醇化的rPEG的缔合，还包括一种或多种有助于特定地靶向所述载体或具有治疗作用或可检测的试剂。本发明包括通过已知的方法比如注射或口服给药本发明的组合物的递送方法，其中所述组合物递送至特定细胞或器官。在一个实施方案中，本发明包括通过给药本发明的组合物治疗疾病比如癌症或实体瘤的方法，所述组合物包括已知用于治疗这样的疾病的试剂。另一个实施方案包括载体组合物，其包括衍生化的PEG、TNF(肿瘤坏死因子)和抗癌剂，并缔合有胶态金属颗粒。在另一个实施方案中，本发明包括通过给药本发明的组合物进行基因治疗的方法，所述组合物包括用于基因治疗的试剂，比如寡核苷酸、反义寡核苷酸、 载体、核酶、si、RNAs、DNA、mRNA、有义寡核苷酸和核酸。


图1为用于制备纳米药物的混合装置的示意图。图2为显示TNF与胶态金的饱和结合的图。图3A为显示TNF 金的结合比例对cAu_TNF安全性影响的图。图;3B为显示TNF 金的结合比例对cAu_TNF安全性影响的图。图3C为显示cAu-TNF和天然TNF的抗肿瘤功效的图。图3D为显示1小时后TNF分布曲线的图。图3E为显示8小时后TNF分布曲线的图。
图3F为天然TNF和cAu_TNF载体在负载MC38肿瘤的C57/BL6小鼠中的药代动力学曲线的图。图4A-C显示了用PT-cAu-TNF载体(A)、cAu_TNF载体(B)处理的和没有处理(C) 的小鼠的肝和脾。图5A为显示多个器官中金分布的图。图5B为显示TNF药代动力学分析的图。图5C为显示随时间逝去肿瘤内TNF分布的图。图5D为比较利用胶态金纳米药物的不同制剂的肿瘤内TNF浓度的图。图5E和F为显示随时间逝去多个器官中TNF分布的图。图6A为比较天然TNF或PT_cAu_TNF载体的安全性和功效的图。图6B为比较天然TNF和20K-PT-cAu_TNF的安全性和功效的图。图6C为比较天然TNF和30K-PT-cAu_TNF的安全性和功效的图。图7为具有多种试剂的载体的示意图。图8为用于检测载体的俘获方法的实施方案的示意图。图9为显示TNF-和END-俘获载体的图，所述载体显示出存在第二种试剂。图10为显示TNF-和END-俘获载体的图，所述载体显示出存在第二种试剂。图11为被称为PolyPeg 的聚乙二醇化试剂(a pegylating agent)的示意图。详细说明本发明包括用于递送试剂的组合物和方法。本发明还包括用于制备所述组合物和体外和体内给药所述组合物的方法。通常，本发明考虑纳米治疗组合物，其包括形成平台的金属溶胶颗粒、与单独或组合形式的下述组分的任何或全部的组合靶向分子、活性剂、隐形试剂(例如一种或多种类型的PEG或其它类型的隐形部分)、检测剂和整合分子 (integrating molecule)0递送试剂用于检测或治疗特定细胞或组织。例如，本发明用于使特定组织，比如实体瘤，成像。递送试剂用于治疗生物学病症，包括，但不限于慢性和急性疾病、免疫系统及其它生物系统的维持和控制、传染病、疫苗接种、激素维持和控制、癌症、实体瘤和血管生成状态以及其它生理障碍。这样的递送可以靶向特定细胞或细胞类型，或者所述递送可以在以无毒的方式低水平释放所述试剂的方法中特异性较弱地提供给身体。金属溶胶组合物的说明和使用在美国专利No. 6，274，552 ；和相关专利申请，美国专利申请 No. 09/808，809 ；09/935, 062 ；09/189, 748 ；09/189, 657，和 09/803，123 ；和美国临时专利申请60/287,363中有教导，将所有这些文件的全部内容引入本文。也将美国临时专利申请 60/287，363,60/974,310,61/069, 108,61/123, 796,60/981, 920,61/040, 022,61/124, 290 ^P 61/126, 899的全部内容引入本申请内。本发明涉及包括作为新型多官能纳米治疗剂和用于递送试剂的载体的胶态金属的方法和组合物。特别地，优选的组合物用于治疗或检测方法中，所述方法包括一种或多种类型的载体累积在实体瘤中。本发明的多官能纳米治疗剂包括载体组合物，其包括用于装配纳米药物的平台、靶向配体、隐形试剂和一种或多种活性剂。所述平台典型地包括胶态金属溶胶，比如金纳米颗粒。所述靶向配体可以是靶向肿瘤部位的配体比如TNF。尽管本文根据特定功能和目的描述了所述纳米治疗剂的组分，但是应当注意所述组分可以容易地起超过一种功能的作用。例如，如下进一步讨论的，所述金纳米颗粒不仅起用于制备纳米治疗剂平台的作用，而且其对“隐形/保护功能”有贡献，因为它防止了一系列前药的水解转化。在某些实施方案中，由存在金颗粒引起的独特化学过程延迟试剂或前药的活化(或水解)直到到达靶向部位。另外，虽然本文提供和讨论了 TNF作为靶向试剂， 但TNF也对所述纳米颗粒的治疗效用有贡献。隐形或保护剂可以是保护纳米药物以防止其在到达靶点之前被吸收、消化或其它代谢活动的试剂。在某些实施方案中，所述隐形试剂包括PEG或硫醇化的PEG。本发明的组合物和方法可用于多种目的。在某些实施方案中，所述组合物和方法用于治疗实体瘤，包括给药胶态金属溶胶组合物，该组合物包括PEG，优选衍生化的-PEG， 更优选地硫醇-衍生化的聚乙二醇。尽管不希望受到任何特定理论的限制，据认为使用这样的组合物会引起载体组合物到达(trafficking)和聚集于肿瘤。在不存在靶向分子或活性剂的情况下，衍生化的PEG 胶态金属载体到达肿瘤，并螯合于此。本发明考虑所有的给药方法，尽管最优选的给药途径是静脉内或口服。当优选地静脉内或口服给药时，在肿瘤中发现所述胶态载体或者发现与其缔合(associate)。本发明的组合物优选地包括胶态金属溶胶、衍生化的化合物和一种或多种试剂。 所述试剂可以是可以用于治疗应用的生物活性剂，或者所述试剂可以是用于检测方法的试剂。在优选的实施方案中，混合一种或多种试剂，将其与胶态金属直接地或间接地缔合或结合。混合、缔合和结合包括共价键和离子键及其它更弱的或更强的缔合，其允许所述衍生化的-PEG、试剂及其它组分彼此之间以及和所述金属溶胶颗粒之间的长期或短期缔合。在仍然另一个实施方案中，所述组合物也包括与所述胶态金属混合、缔合或结合的一种或多种靶向分子。所述靶向分子可以直接地或间接地结合金属颗粒。间接结合包括通过分子比如聚赖氨酸或其它整合分子的结合，或与分子(所述分子结合所述靶向分子以及或者所述金属溶胶或者结合到所述金属溶胶上的另一分子)的任何缔合。平台任何胶态金属都可以用于本发明。胶态金属包括分散在液态水、水溶胶或金属溶胶中的任何水不溶性金属颗粒或金属化合物。所述胶态金属可选自周期表的IA、IB、IIB和 IHB族的金属以及过渡金属，特别是VIII族的那些。优选的金属包括金、银、铝、钌、锌、铁、 镍和钙。其它合适的金属也包括以所有其各种氧化态存在的下述金属锂、钠、镁、钾、钪、 钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、钼和钆。所述金属优选地以来源于合适的金属化合物的离子形式提供，例如Al3+、Ru3+、Zn2\ Fe3\ Ni2+和Ca2+离子。在本发明中作为平台也适用的其它纳米颗粒，包括，但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、铁纳米颗粒、金属杂混纳米颗粒比如金/铁纳米颗粒、纳米壳、金纳米壳、银纳米壳、 金纳米棒、银纳米棒、金属杂混纳米棒、量子点、纳米簇、脂质体、树枝状聚合物、金属/脂质体颗粒、金属/树枝状聚合物纳米混合物和碳纳米管。优选的金属为金，特别是Au3+形式的。特别优选的胶态金形式是HAuC14。在一个实施方案中，所述胶态金颗粒在约中性PH具有负电荷。据认为该负电荷防止了其它带负电荷分子的吸引和附着。相反，带正电荷的分子被吸引到并结合胶态金颗粒。所述胶态金以溶胶的形式应用，其包含具有一定范围颗粒尺寸的金颗粒，尽管优选的尺寸为约1至40nm的颗粒尺寸。在本发明的优选的实施方案中，不仅金在纳米颗粒中起全部分子的平台的作用， 其也防止了药物/试剂比如药物类似物或前药在血液中的转化，并促进其转化成试剂或药物的活性形式。尽管不希望受到下述理论的束缚，据认为金在纳米颗粒中对独特的化学过程有贡献，该化学过程防止了这样的类似物在血液中转化成活性药物或试剂。因此，金对于纳米治疗剂的安全性和功效有贡献，因为其防止了所述试剂或药物转化成其活性状态，直到到达靶点(即，实体瘤)。另外，如下所示，所述纳米治疗剂不仅将药用试剂螯合到实体瘤内，而且使所述药物类似物随时间逝去转化成活性药物。因此，凭借靶向递送和随时间逝去产生活性药物，纳米治疗通过促进使用较低剂量的药物也改善了药物的安全性。金的存在对药物的总稳定性有贡献。在一个具体的实施方案中，所述纳米治疗剂包括作为平台的金、 作为靶向试剂的TNF、作为隐形试剂的PEG和前药。因为直到到达靶点(典型地为肿瘤)时前药才水解和转化成其活性形式，因而所述纳米治疗剂是高度有效的。因为使不加选择的作用或功效降低的可能性最小化，将非活性试剂延迟水解或延迟转化成活性剂是高度合意的。另一种优选的金属是银，特别是在硼酸钠缓冲液中，其具有的浓度为约0. 至 0. 001%,最优选地为约0. 01 %的溶液。优选地，这样的胶体银溶液的颜色是黄色，胶态颗粒为1至40nm。这样的金属离子可以以单独的络合物或与其它无机离子的络合物形式存在。靶向配体/分子靶向分子也是本发明组合物的组分。一种或多种靶向分子可以直接或间接地附着、结合或缔合胶态金属。这些靶向分子可以针对特定细胞或细胞类型、来自特定胚胎组织、器官或组织的细胞。这样的靶向分子包括能够选择性地结合特定细胞或细胞类型的任何分子。通常，这样的靶向分子为结合对的一个成员，这样其选择性地结合另一个成员。这样的选择性可以通过结合在细胞上天然存在的结构，比如细胞膜、核膜中存在的受体或与 DNA相关的受体来获得。也可以将所述结合对成员合成性引入到细胞、细胞类型、组织或器官上。靶向分子也包括如下受体或受体的部分，所述受体或受体部分可以结合细胞膜或非细胞膜中存在的分子、配体、抗体、抗体片段、酶、辅助因子、底物及本领域技术人员已知的其它结合对成员。靶向分子也能够结合多种类型的结合伴侣(binding partner)。例如，靶向分子可以结合一类或一个家族的受体或其它结合伴侶。靶向分子也可以是能够结合一些酶或一些类型的酶的酶底物或辅助因子。靶向分子的具体实例包括，但不限于白细胞介素-1( “IL-1”)、白细胞介素-1β ( “IL-Ιβ ”)、白细胞介素-2( “IL-2”)、白细胞介素-3( “IL-3”)、白细胞介素-4 (“ IL-4”)、白细胞介素-5 (“ IL-5 ”)、白细胞介素_6 (“ IL-6 ”)、白细胞介素_7 (“ IL-7 ”)、 白细胞介素-8( “IL-8”)、白细胞介素-9( “IL-9”)、白细胞介素-10( “IL-10”)、白细胞介素-11( “IL-11”)、白细胞介素-12( “IL-12”)、白细胞介素-13( “IL-13”)、白细胞介素-14( “IL-14”)、白细胞介素-15( “IL-15”)、白细胞介素-16( “IL-16”)、白细胞介素-17( “IL-17”)、白细胞介素-18( “IL-18”)白细胞介素21 ( “ IL-21 ”)、B7、脂质A、磷脂酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B及其它毒素、I型干扰素、IFNy、II型干扰素、肿瘤坏死因子(“TNF”或“TNFa ”)、转化生长因子-α ( " TGF-α ”)、淋巴细胞毒素、移动抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)、单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子(“VEGF”)、血管生成因子、血管生成素、转化生长因子-β ( "TGF-β ”)、血型的碳水化合物部分、Mi因子、成纤维细胞生长因子及其它炎症免疫调节蛋白、激素比如生长激素、胰岛素、胰高血糖素、甲状旁腺素、促黄体素、促卵泡激素和促黄体素释放激素、内分泌激素、细胞表面受体、抗体、核酸，核苷酸、DNA、RNA、有义核酸、反义核酸、癌细胞特异性抗原、MART、MAGE、BAGE和分子伴侣比如HSP(热激蛋白)、突变体p53 ；酪氨酸酶；自身免疫抗原；受体蛋白、葡萄糖、糖原、磷脂和单克隆和/或多克隆的抗体、碱性成纤维细胞生长因子、酶、辅助因子、酶底物免疫调节的分子(即CD40L)、粘附分子(ICAM)、血管的和新血管标记物(CD31 和 CD34)。在本发明的优选的实施方案中，所述靶向配体包括TNF。所述载有纳米治疗剂的、 作为靶向配体的TNF是高度有效的，因为其有助于限定所述纳米颗粒主要生物分布到疾病部位，并且使其不仅能够同时攻击实体瘤中存在的肿瘤细胞，而且能够杀死支持和促进肿瘤生长的宿主基质细胞。因此，在某些实施方案中，包括其中TNF作为靶向试剂应用的实施方案中，所述靶向试剂除了履行其作为靶向试剂的作用之外，还对于所述纳米治疗剂的治疗值有贡献。在本发明中使用的整合分子可以特异性地结合整合分子，比如结合对的成员，或者可以非特异性地结合特异性较弱结合的整合分子。整合分子是根据其提供用于结合或缔合两个实体的部位的功能定义的。一个实体可以包括金属溶胶颗粒，另一个实体可以包括一种或多种活性剂或一种或多种靶向分子，或者两者或其组合。本发明的组合物可以包括一种或多种整合分子。非特异性结合-整合分子的实例是聚阳离子分子，比如聚赖氨酸或组蛋白，其用于结合核酸。聚阳离子分子是本领域技术人员已知的，其包括，但不限于聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白、组蛋白或无唾液酸糖蛋白。所本发明还考虑提供用于将一种或多种实体结合至所述金属颗粒的合成分子的用途。特异性结合-整合分子包括可用于本发明的结合对的任何成员。这样的结合对是本领域技术人员已知的，其包括，但不限于抗体-抗原对、酶-底物对、受体-配体对和抗生蛋白链菌素-生物素。除了这样的已知结合对之外，可以特别地设计新的结合对。结合对的特征是所述结合对的两个成员之间的结合。所述结合伴侣的另一个期望的特征是所述对的一个成员能够结合或被结合到一种或多种试剂或靶向分子，所述对的另一个成员能够结合金属颗粒。隐形试剂如本文使用的“隐形试剂”指当结合本文描述的纳米治疗剂颗粒的表面时能防止所述颗粒在循环中受调理作用和随后被网状内皮系统(REQ清除的任何化合物。所述隐形试剂包括辅助保护所述纳米治疗剂以防止在到达其靶点之前的消化、吸收、受调理作用或其它代谢活动的试剂。通常，所述隐形试剂保护所述纳米治疗剂以防止在到达靶向部位之前崩解。例如，硫醇化的聚乙二醇水合所述纳米颗粒药物，如此，防止了网状内皮系统(REQ对其的摄取和清除。在某些实施方案中，本发明的组合物包括作为隐形试剂的二醇化合物，优选聚乙二醇(PEG)(也是本领域普通技术人员已知为聚氧乙烯或Ρ0Ε)，更优选衍生化的PEG。本发明包括含有衍生化的PEG的组合物，其中所述PEG为5，000至30，000 (道尔顿)MW。衍生化的PEG化合物为市售可获得的，比如来自于SunBio，Seoul，South Korea。PEG化合物可以是双官能的或单官能的，比如甲氧基-PEG(mPEG)。直链和支链PEG的活化衍生物可以以各种分子量获得。如本文使用的术语“衍生化的PEG”或“PEG衍生物”指通过官能团、化学实体的加入或者其它PEG基团的加入而由直链分子提供支链从而改变的任何聚乙二醇分子。 这样的衍生化的PEG可用于与生物活性化合物共轭、制备聚合物接枝、或者由该衍生分子提供的其它功能。一种类型的PEG衍生物是在一个或两个末端具有伯氨基的聚乙二醇分子。优选的分子为在一个末端具有氨基的甲氧基PEG。另一种类型的PEG衍生物包括亲电活化的PEG。 这些PEG用于使PEG或甲氧基PEG(mPEG)附着到蛋白质、脂质体、可溶性和不溶性聚合物和各种分子上。亲电活化PEG衍生物包括PEG丙酸的琥珀酰亚胺、PEG 丁酸的琥珀酰亚胺、附着到羟基琥珀酰亚胺或者醛上的多个PEG、mPEG双酯(mPEG-CM-HBA-NHS)、mPEG苯并三唑碳酸酯、和mPEG丙醛、mPEG乙醛二乙基乙缩醛。优选类型的衍生化的PEG包括硫醇衍生化的PEG或者巯基选择性PEG。支链的、分叉的或者线性的PEG可以用作分子量为5000-40000 (道尔顿)mw的PEG骨架。优选的硫醇衍生化的PEG包括具有马来酰亚胺官能团的PEG，硫醇基团可以和所述马来酰亚胺官能团共轭。优选的硫醇-PEG为具有PEG mw为5000-40000道尔顿的甲氧基-PEG-马来酰亚胺。本发明也考虑杂官能的PEG作为衍生化的PEG的用途。PEG的杂官能的衍生物具有通式结构X-PEG-Y。当X和Y是提供共轭能力的官能团时，在PEG分子的末端之一或者两者上可以结合许多不同的实体。例如，X可以是乙烯砜(vinylsulfone)或者马来酰亚胺，Y 可以是NHS酯。对于检测方法而言，X和/或Y可以是荧光分子、放射性分子、发光分子或者其它可检测的标记物。杂官能的PEG或者单官能的PEG可用于和结合对的一个成员共轭， 所述结合对比如PEG-生物素、PEG-抗体、PEG-抗原、PEG-受体、PEG-酶或者PEG-酶底物。 PEG也可以和脂质共轭，比如PEG-磷脂。在本发明中，用作隐形试剂的另一种类型的聚乙二醇化试剂(pegylating agent)是PolyPEG (Warwick Effect Polymers, Ltd. ， Coventry, United Kingdom)。 PolyPEG 是一种与治疗蛋白质、肽和小分子共轭的新的聚乙二醇化试剂。PolyPEG . 是在甲基丙烯酸类聚合物骨架上具有peg齿的梳形聚合物。PolyPEG 具有各种分子量、 peg链长和共轭端基。PolyPEG 的结构可以通过如下而变化(1)甲基丙烯酸类骨架，其决定所述梳的长度；0)PEG链长，其决定所梳上各齿的PEG的数量；和C3)活性端基，其决定PolyPEG 和靶向生物分子之间共轭的位点。PolyPEG 的梳样结构提供另一种聚乙二醇化的方式，其通过利用结构的性质， 将其降解成随时间逝去容易排泄的小单元。这允许它们以高的总剂量使用，而避免了与大分子量PEG链在组织中累积相关的潜在毒理学问题。在其通过延长其在循环中的存在而增
强生物分子的治疗效果方面，PolyPEG 与常规peg类似。PolyPEG 能够比常规peg 更大程度地改善一些肽的生物活性。针对聚乙二醇化大量治疗分子的特定需求，可以定制 PolyPEG 分子。它们可以用选择的共轭基合成，以便稳定的、共价的部位-直接连接至肽和蛋白质的赖氨酸或半胱氨酸残基或N-末端胺。本发明的另外的实施方案包括隐形试剂，其包括其它PEG类化合物，包括，但不限于硫醇化的聚氧丙烯聚合物、硫醇化的嵌段共聚物比如PLUR0NIC，其是包括聚氧乙烯/聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段的三嵌段共聚物。用于本发明的PLUR0NIC的实例包括，但不限于下述的
权利要求
1.组合物，其包括平台、至少一种靶向试剂、至少一种隐形试剂和至少一种治疗或诊断剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述平台包括胶态金属纳米颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、铁纳米颗粒、金属杂混纳米颗粒比如金/铁纳米颗粒、纳米壳、金纳米壳、银纳米壳、金纳米棒、银纳米棒、金属杂混纳米棒、量子点、纳米簇、脂质体、树枝状聚合物、金属/脂质体颗粒、金属/树枝状聚合物纳米混合物和碳纳米管。
3.权利要求2的组合物，其中所述胶态金属包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍和钙、锂、钠、 镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、钼或钆。
4.权利要求1的组合物，其中所述靶向试剂包括可以结合配体、抗体、抗体片段、酶、辅助因子、底物、或者细胞膜或非细胞膜中存在的分子的受体或受体的一部分。
5.权利要求1的组合物，其中所述靶向试剂包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、生长因子、激素、辅助因子、酶底物、免疫调节分子、抗体、粘附分子、血管标记物、新血管标记物、分子侣伴或热激蛋白。
6.权利要求ι的组合物，其中所述隐形试剂包括聚乙二醇、PolyPEG 、聚氧丙烯聚合物、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、rPEG或羟乙基淀粉、亲水性试剂和聚合物。
7.权利要求1的组合物，其中所述隐形试剂为改性的、衍生化的硫醇化的、胺化的或多胺化的。
8.权利要求1的组合物，其中治疗或诊断剂包括化学品、治疗剂、药用试剂、药物、生物因子、生物分子比如抗体、蛋白、脂质、核酸或碳水化合物类的片段；核酸、抗体、蛋白、脂质、 营养物、辅助因子、病毒、营养药、麻醉药、检测剂和在体内具有作用的试剂。
9.权利要求1的组合物，其中所述治疗或诊断剂包括细胞因子、生长因子、神经化学物质、细胞通讯分子、激素、药物、抗炎剂、抗体、化疗剂、免疫治疗剂、核酸基物质、成像体系、 染料和放射性物质。
10.权利要求9的组合物，其中所述治疗或诊断剂包括紫杉醇、帕利他西、帕利他西类似物、紫杉烷、长春碱、长春新碱、多柔比星、阿昔洛韦、顺钼、埃坡霉素、吉西他滨、美法仑、 5-FU或其前药形式、他克林及其类似物和钆/钆螯合剂，所述钆/钆螯合剂可以用硫醇、胺或多胺部分改性。
11.权利要求10的组合物，其中所述治疗或诊断剂包括紫杉醇、紫杉烷、长春碱、长春新碱、多柔比星、阿昔洛韦、顺钼、埃坡霉素、吉西他滨、美法仑、5-FU或其前药形式和他克林。
12.递送试剂至靶向部位用于受试者中的生理学作用的方法，其包括给药受试者包括如下组分的组合物平台、至少一种靶向试剂、至少一种隐形试剂和至少一种治疗或诊断剂。
13.权利要求12的方法，其中所述平台包括胶态金属纳米颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、铁纳米颗粒、金属杂混纳米颗粒比如金/铁纳米颗粒、纳米壳、金纳米壳、银纳米壳、金纳米棒、银纳米棒、金属杂混纳米棒、量子点、纳米簇、脂质体、树枝状聚合物、金属/脂质体颗粒、金属/树枝状聚合物纳米混合物和碳纳米管。
14.权利要求12的方法，其中所述靶向试剂包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、生长因子、激素、辅助因子、酶底物、免疫调节分子、抗体、粘附分子、血管标记物、新血管标记物、分子侣伴或热激蛋白。
15.权利要求12的方法，其中所述隐形试剂包括聚乙二醇、PolyPEG 、聚氧丙烯聚合物、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、rPEG或羟乙基淀粉。
16.权利要求12的方法，其中所述隐形试剂为改性的、衍生化硫醇化的、胺化的或多胺化的。
17.权利要求12的方法，其中治疗或诊断剂包括化学品、治疗剂、药用试剂、药物、生物因子、生物分子比如抗体、蛋白、脂质、核酸或碳水化合物类的片段；核酸、抗体、蛋白、脂质、 营养物、辅助因子、营养药、麻醉药、检测剂和在体内具有作用的试剂。
18.权利要求12的方法，其中所述生理作用包括特定细胞或组织的检测或治疗、特定组织的成像、实体瘤的成像、生物学病症的治疗、慢性和急性疾病的治疗、免疫系统的维持和控制、传染病的治疗、疫苗接种、激素维持和控制、癌症的治疗、实体瘤的治疗、血源性肿瘤的治疗、潜在的髓赘生物和血管生成状态的治疗。
19.权利要求12的方法，其中所述治疗或诊断剂可以是转变成活性药物的前药。
20.权利要求12的方法，其中治疗或诊断剂包括钆或类似的造影剂。
21.权利要求12的方法，其中所述靶向位点为肿瘤、感染部位、疾病部位、机能失调部位或发炎的关节。
全文摘要
本发明包括用于试剂递送系统的组合物和方法，所述试剂包括治疗化合物、药用试剂、药物、检测剂、核酸序列和生物因子。通常，本发明的纳米治疗组合物包括包含胶态金属的平台、靶向配体比如肿瘤坏死因子、隐形试剂比如聚乙二醇、和一种或多种用于递送的诊断或治疗剂。本发明还包括用于制造这样的纳米治疗组合物和用于治疗癌症的方法和组合物。
文档编号B82B1/00GK102203002SQ200880117353
公开日2011年9月28日 申请日期2008年9月22日 优先权日2007年9月21日
发明者G·F·佩乔蒂, L·塔马金, M·S·胡塔 申请人:细胞免疫科学公司