稳定金纳米簇的形成方法、含有稳定金纳米簇的组合物和制品的制作方法

专利名称：稳定金纳米簇的形成方法、含有稳定金纳米簇的组合物和制品的制作方法
技术领域：
本发明一般性地涉及金纳米簇，特别涉及荧光金纳米簇。该金纳米簇可以，例如用 蛋白质或稳定剂来稳定。在一些情况下，金纳米簇可以在测定汞离子在样品中的存在与否 和/或浓度的方法或制品中使用。
背景技术：
贵金属纳米簇(NC)通常包含几个到几十个金属原子并且通常尺寸小于lnm。金属 纳米簇中自由电子的空间限域可以产生离散且大小可调的电子跃迁，从而导致如发光和独 特的充电性能的类分子性能。与尺寸较大(例如，约3到IOOnm)且可能含有有毒金属物质 (例如，镉、铅)的半导体量子点(QD)形成对比，贵金属纳米簇由于它们的超细尺寸和无毒 性而对于多种应用(例如传感)具有吸引力。令人感兴趣的是研发用于合成具有红色或近 红外发射的荧光金纳米簇的方法和技术，所述荧光金纳米簇可用于许多应用中，例如用于 汞离子的检测。因为汞离子(Hg2+)对环境和人类健康的有害影响，所以汞离子的常规检测对于 水生生态系统中的环境监测至关重要。在过去的几年中，基于有机小分子(荧光团或生色 团)、生物分子(蛋白质、抗体、寡核苷酸、DNA酶等)和各种材料(聚合物或无机材料)已 经研发了数种用于检测汞离子的光学传感器系统。然而，这些系统中的许多都在实际应用 中在简易性、灵敏性、选择性方面受到约束，和/或受限(例如与水性环境不相容)。因此，需要改进的方法和材料。

发明内容
在一些实施方案中，本发明提供组合物。在第一实施方案中，组合物含有多个金 纳米簇和蛋白质或稳定剂，其中所述金纳米簇能够以至少的量子产率发出波长为约 630nm到约700nm的荧光。在一些实施方案中，本发明提供方法。根据第一实施方案，用于形成多个金纳米簇 的方法包括形成含有多个金原子前体分子和多个蛋白质分子的反应混合物，其中所述金 原子前体分子与蛋白质分子之比为至少约5 1;将反应混合物的pH调节到大于约11，并 且将反应混合物在适当的温度维持足够的时间段，以形成多个由至少一个蛋白质分子稳定 的金纳米簇，其中所述金纳米簇的平均直径小于约2nm。在另一实施方案中，检测汞离子的方法包括提供含有多个金纳米簇和蛋白质或 稳定剂的组合物，将该组合物暴露于怀疑含有汞离子的样品，并且测定该样品是否含有汞离子。在又一实施方案中，检测汞离子的方法包括提供多个金纳米簇，所述金纳米簇在约 630nm到约700nm之间的波长具有量子产率为至少1 %的第一荧光强度，将所述纳米簇暴露 于怀疑含有汞离子的样品并测定荧光强度的变化，并且基于荧光强度的变化来测定该样品 中是否含有汞离子。在一些情况下，检测汞离子的方法包括提供含有多个具有式AUm的稳定金纳米 簇的组合物，将该组合物暴露于怀疑含有汞离子的样品，并且测定该样品中是否含有汞离 子。在一些实施方案中，本发明提供制品。在一些情况下，检测样品中是否存在汞离子 的制品包括底物和与该底物结合的组合物，其中所述组合物含有金纳米簇和蛋白质或稳定 剂。


图1显示根据本发明的一个非限制性实施方案的形成结合牛血清白蛋白的金纳 米簇(BSA-Au-NC)的示意图。图2A显示根据一个实施方案的(I)BSA粉末和O)BSA水溶液以及(3)BSA_Au_NC 水溶液和G) BSA-Au-NC粉末在可见光(上)和UV光(下)下的照片。图2B显示(i)BSA和(ii) BSA-Au-NC的水溶液的光吸收(虚线)和光电发射(实 线，Xex = 470nm)谱图。插图显示BSA-Au-NC在约480nm处的弱吸收峰。图3显示根据一个非限制性实施方案的含有HAuCl4和BSA的反应混合物在37°C 下的光电发射谱图(Xex = 470nm)的时间演变。图 4 显示(A) (iii) BSA-Au-NC 中的 Au 4f 的 XPS 谱图和(B) (iv)BSA 和(ν) BSA-Au-NC 的 MALDI-T0F 质谱。图4C显示根据一个非限制性实施方案的BSA-Au-NC粉末在空气中的TGA分析。图5显示BSA-Au-NC的代表性TEM图。图6显示根据非限制性实施方案的(i，或黑)BSA和(ii，或灰)BSA-Au-NC的㈧ DLS柱状图，(B)傅里叶变换红外(FTIR)谱图，(C)zeta电势结果，和(D)远-UV圆二色性 (CD)谱图。(A)中的插图显示(ii) BSA (与FITC染料共轭)和(i) BSA-Au-NC (在UV光下) 的电泳数据。图7显示对于(O)BSA，(1)在最优化条件下合成的BSA_Au_NC，(2)用NaBH4合成 的 BSA-Au-NC，(3)无 NaOH 时合成的 BSA-Au-NC，(4)在 100°C 下合成的 BSA-Au-NC，和(5) 在低BSA浓度下合成的BSA-Au-NC的㈧可见光下和⑶紫外光下的照片，以及(C)光学 吸收谱图和⑶光电发射谱图(λ ex = 470nm)。 图8显示无NaOH时所合成的BSA-Au-NC的代表性TEM图。图9显示BSA-Au-NC (20mM)在(1)不存在和(2)存在Hg2+离子(50mM)时的(A) 光电发射谱图Uex = 470nm)，和⑶在UV光下的照片，以及(C)基于BSA-Au-NC的荧光 猝灭的Hg2+传感示意图。图10显示(A)由BSA-Au-NC螯合(sequester)的Hg离子和(B)由NaBH4还原的 螯合Hg离子的XPS Hg 4f谱图。图11显示在Hg2+离子存在下的BSA-Au-NC的代表性TEM图。
图12显示(A)与聚苯乙烯珠粒共轭的BSA-Au-NC的示意图和(B)聚苯乙烯珠粒 共轭的BSA-Au-NC的代表性荧光图。图13显示在50mM的各种金属离子的存在下，BSA-Au-NC水溶液QOmM)的(A)在 UV光下的照片，和(B)在入ex = 470nm的相对荧光(I/I0)。图14显示(A) BSA-Au-NC (20nM)在不同Hg2+浓度存在下的光电发射谱图(λ = 470nm)，和⑶随Hg2+浓度变化的BSA-Au-NC的相对荧光(1/1。)。图14C显示1 20nM的Hg2+的线性检测范围。图15Α显示测试条已在50mM的各种金属离子溶液中浸渍过之后的具有BSA-Au-NC 的测试条在UV光下的照片。图15B显示已在Hg2+的溶液中浸渍过的测试条(在UV光下)的照片。图16显示使用(i)BSA，(ii)人血清白蛋白和(iii)溶菌酶合成的Au-NC水溶液 的光电发射(Xex = 470nm)谱图。本发明的其他方面、实施方案和特征将由与附图结合考虑的如下详细描述而变得 明显。附图是示意性的并且无意于按比例绘制。为了清楚起见，当无需说明即可使本领域技 术人员理解本发明时，没有在每幅图中标注每一个元件，也没有显示本发明每个实施方案 的每一个元件。所有专利申请和专利均以全文引用的方式并入本文。在有冲突的情况下， 以本说明书(包括定义)为准。详述本发明一般性地涉及金纳米簇的形成方法、含有金纳米簇的组合物和制品。在一 些情况下，所述金纳米簇是荧光性的并且发出具有高量子产率的红光能量。金纳米簇可以 如本文所述，例如由蛋白质或稳定剂来稳定。本发明的一些方面涉及包括金纳米簇例如，用 于检测汞的应用。在一些实施方案中，金纳米簇包含多个金原子。本文使用的术语“纳米簇”具有在 本领域中的普通含义并且是指含有几个到几十个金属原子的簇。在一些情况下，纳米簇可 大致含有约2到约30个关联的金原子。在特定情形下，纳米簇含有约25个金原子。本领 域普通技术人员将知晓测定纳米簇中所含金属原子的近似数目的方法(例如质谱)。在一 些情况下，纳米簇可含有至少一种氧化态大于0的金原子(例如Au+、Au+3)。在如本文所述 的金纳米簇用于检测汞离子的应用中，存在至少一种氧化态大于0的金原子可能是一个重 要的特征。在一些实施方案中，本发明的金纳米簇可以是发光的。发光材料是指可以吸收电 磁辐射的量子来使材料达到激发态结构并且在一些情况下发出辐射的材料。所发出的辐射 可以是发光，其中“发光”定义为紫外或可见辐射的发射。具体类型的发光包括“荧光”，其 中可见辐射的吸收和发射之间的时间间隔为10_12 10_7秒。在一些情况下，在暴露于光源 时，本发明的金纳米簇可以发射荧光能量。所发射的荧光能量可以用本领域普通技术人员 已知的方法进行检测。在一些情况下，所发射的荧光能量的强度和/或波长可以提供有关 分析中的样品的信息，如本文所述那样。在一些实施方案中，金纳米簇可以在波长为约700 约630nm、约680 约640nm、 约 675 约 650nm，或者约 640nm、约 650nm、约 660nm、约 670nm、约 680nm、约 690nm 处发光
和/或具有发射(例如，最大发射波长)，或光。即，在一些实施方案中，金纳米簇可以发射红光能量和/或在UV光下显现红色。然而，在一些情况下，纳米簇可以在近红外区域 (例如，约700nm 约1400nm)或者其他可见光波长区域(例如，约400nm 约630nm)发光 和/或具有发射。本领域普通技术人员将知晓用于测定多个金纳米簇的发光和/或 入_发射的方法和技术。例如，金纳米簇可以用荧光光谱进行分析。在这样的分析中，将金 纳米簇暴露于光源(例如，紫外光)，该光导致某些分子中的电子被激发，从而发出较低能 量的光(例如，可见光)。在一些实施方案中，可以测定含有金纳米簇的组合物的量子产率。量子产率是组 合物所吸收的光子与组合物通过荧光所发出的光子之比。在一些实施方案中，含有金纳 米簇的组合物可以以至少约1 %、至少约2%、至少约3 %、至少约4%、至少约5 %、至少约 6 %、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%或更大的量子产率发射能量和/或具 有发射。在一些情况下，量子产率为约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约 10%，或者约3% 约10%、约4% 约9%，或者约5% 约8%。本领域普通技术人员将 知晓测定组合物的量子产率的方法。在一些实施方案中，金纳米簇可以在波长为约630nm 到约700nm以至少1 %的量子产率，或者本文所述的值的任意其他组合发出荧光(或者具有 λ —发射)。在一些情况下，纳米簇的平均直径可以为约0. Inm 约2nm、约0. 1 约lnm、约 0. 1 约0. 5nm、约0. 5 约Inm等。在一些情况下，纳米簇的平均直径可以小于约2nm、小 于约1. 5nm、小于约lnm、小于约0. 5nm、小于约0. Inm等。本文所用的多个纳米簇的“平均 直径”为纳米簇直径的算术平均值。本领域普通技术人员将知晓测定多个纳米簇的平均直 径的方法和技术，例如使用激光散射法、动态光散射法(或者光子相关光谱法)、透射电子 显微镜法(TEM)等。在一些实施方案中，纳米簇可以是多分散的、基本单分散的或单分散的(例如，具 有均一分布的直径)。在纳米簇具有的直径分布使得不多于约10%、约5%、约4%、约3%、 约2%、约或更少的小滴的直径大于或小于所有纳米簇的平均直径的约20%、约30%、 约50 %、约75 %、约80 %、约90 %、约95 %、约99 %或更大的情况下，多个纳米簇是基本单 分散的。在一些实施方案中，纳米簇是基本球形的。然而，在其他实施方案中，纳米簇可以 包含多种形状，包括球形、三棱柱、立方形、片形(例如三角形、正方形、圆形、矩形片)等。在一些实施方案中，金纳米簇可以通过与蛋白质和/或稳定剂结合来稳定，从而 形成含有金纳米簇和蛋白质和/或稳定剂的组合物。在一些情况下，蛋白质也可能有助于 如本文所述的金纳米簇的形成。所述结合可以包括，例如金纳米簇和蛋白质或稳定剂之间 (例如，在蛋白质中的残基和金原子或离子之间)的至少一种相互作用的形成。在一些情 况下，所述相互作用可以是离子键、共价键(例如，碳-碳、碳-氧、氧-硅、硫-硫、磷-氮、 碳-氮、金属-氧，或其他共价键)、氢键(例如，羟基、胺、羧基、巯基和/或相似官能团之 间)、配价键(例如，金属离子和单齿配体或多齿配体之间的络合或螯合)、范德华作用力 等。在一些实施方案中，该相互作用不是共价键。用于合成稳定金纳米簇和用于测定适当 蛋白质或稳定剂的方法描述于本文中。在一些实施方案中，本发明提供合成金纳米簇的方法。在一些情况下，所述方法包 括形成含有蛋白质和金原子前体的反应混合物，然后调节反应混合物的PH。可以将反应混 合物在适当的温度下保持充足的时间段，以形成如本文所述的多个金纳米簇。所形成的金纳米簇的特征可在于如本文所述的一个或更多个性质(例如，所发出的荧光波长、量子效 率、平均直径等)。不希望受到理论的束缚，蛋白质的存在可以有助于金纳米簇的形成。例如，蛋白质 分子可以螯合多个金离子(例如，通过金离子和蛋白质如酪氨酸中所包含的残基的结合)， 从而将多个金离子捕集在蛋白质中。然后蛋白质可以将金离子还原为分子金原子，并且金 原子相互的密切接近(例如，因为金原子被捕集在蛋白质内)，可以允许金纳米簇的形成。 在一些情况下，因为各蛋白质可能与同一数目的金离子结合，所以形成的多个金纳米簇可 以是基本单分散或单分散的。在一些实施方案中，至少一个蛋白质(例如，1、2、3、4个等)分 子可以在金纳米簇形成之后保持与一个金纳米簇结合(例如，从而形成稳定的金纳米簇)。 在一些情况下，所述至少一个蛋白质中的至少一些可以如本文所述用稳定剂来替代。在一个具体实例中，可以将含有金原子前体的溶液(例如，含有Au(III)离子)加 入到含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液中，形成反应混合物。该实施方案中的BSA分子可以 螯合金离子并捕集它们(例如，见图1)。通过将反应混合物的PH调节到大于约11，可以激 活BSA分子的还原能力。所捕集的金离子可被还原来形成金纳米簇，其中由BSA分子稳定 所述金纳米簇。在一些情况下，可以形成含有蛋白质和金原子前体的反应混合物。蛋白质溶液可 以添加到金原子前体溶液中，或者金原子前体溶液可以添加到蛋白质溶液中。在一些情况 下，蛋白质和金原子前体可以进行固体混合，然后添加溶剂。溶液可以在不干扰反应的任何 合适溶剂(例如，水)中形成。溶液可以具有的摩尔浓度为约0. IM 约10M、约0. 5M 约 5M、约0. 5M 约2M，或者约1M、约2M、约3M、约4M等。在一些实施方案中，金原子前体分子与蛋白质分子之比为允许形成纳米簇(与形 成纳米颗粒相比)的方法的一个重要特征。不希望受缚于理论，假定该比例是一个重要特 征，这是因为其影响金原子前体分子对蛋白质分子的数目和团聚(例如，见表1中所示结 果)。现在将更加详细地描述用于测定金原子前体分子与蛋白质分子的合适比例的方 法。在一些实施方案中，金原子前体分子与蛋白质分子的适当比例可以通过测定蛋白质中 的半胱氨酸和酪氨酸残基的比例来测定。在一些实施方案中，蛋白质中包含的半胱氨酸和 酪氨酸残基与金原子前体数目之比大致为约1 1 约50 1、约1 1 约25 1、约 5 1 约15 1，或其中的任意范围。在一个特定的实施方案中，该比例为约10 1。从 半胱氨酸与酪氨酸残基的比例，可以测定金原子前体分子与蛋白质分子之比。例如，如果半 胱氨酸和酪氨酸残基与金原子前体之比选定为10 1，并且蛋白质含有50个半胱氨酸和酪 氨酸残基，则金原子前体分子与蛋白质之比为约5 1。在一些情况下，金原子前体分子与 蛋白质分子之比为至少约3 1、至少约5 1、至少约6 1、至少约7 1、至少约8 1、 至少约9 1、至少约10 1、至少约12 1、至少约15 1、至少约20 1或更高。在一 些情况下，该比例为约5 1 约20 1、约8 1 约15 1等。用于本发明的合适的蛋白质包括含有多个(例如，至少约5、10、15、20、30、40、50 个等)半胱氨酸和/或酪氨酸残基的蛋白质。蛋白质的非限制性实例包括牛血清白蛋白 (BSA)、人血清白蛋白、溶菌酶等。本文所用的金原子前体，是指包含氧化态大于0的金(例如，Au+Au+3)且能够被还原(例如，被蛋白质)形成金原子的前体材料。本领域普通技术人员将知晓适当的金原子前 体，例如HAuC14、AuCl3和AuBr3。在一些情况下，金原子前体可以是水合的(例如，含水)。在形成含有金原子前体和蛋白质的反应混合物之后，可以例如通过向反应混合物 中加入碱来调节该反应混合物的pH。碱可以在形成反应混合物后立即加入或者在形成反 应混合物后约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟等加入。该碱可以是任何 合适的碱(例如，NaOH)并且可以以任何适当的摩尔浓度(例如，约0. 1M、约0. 5M、约1M、约 2M)和量添加以按需调节pH。在一些情况下，所添加的碱量可以使得反应混合物的pH被调 节到至少约10. 5、至少约11、至少约11. 5、至少约12、至少约13或更高。在一些情况下，反 应混合物的PH可以为约11 约14、约12 约14，等等。不希望受缚于理论，在一些实施 方案中，因为反应混合物的PH影响蛋白质中包含的残基的质子化或脱质子化(例如，天冬 氨酸和谷氨酸残基中的羧基、半胱氨酸中的巯基、赖氨酸中的胺基等)，从而影响蛋白质的 结构和反应性(例如，见表1中所示结果)，所以反应混合物的PH可以是本发明的一个重要 特征。在将反应混合物的pH调节到选定水平之后，可以将反应混合物在合适的温度下 维持足够的时间段，以形成多个金纳米簇。在该时间段中可以搅动(例如，搅拌、摇动)反 应混合物。本领域普通技术人员将能够确定适当的反应温度和反应时间。例如，可以选择 温度使得不会出现蛋白质的失活分解。作为另一实例，可以选择反应温度使得反应在合理 长的时间内(例如，小于约48小时、约M小时、约12小时等)进行。在一些情况下，反应 可以进行到直至已消耗至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95 %、至少约99 %或 更多的有限反应物为止。可以使用本领域普通技术人员已知的方法和/或技术(例如，光 电发射光谱、核磁共振等)确定反应的进展。在一些实施方案中，反应混合物可以维持在环境温度、环境温度以上或以下。在一 些情况下，反应可以维持在高于环境温度的温度下，例如约30°C、约35°C、约37°C、约40°C、 约50 V、约60 V、约80 V、约100 V或者更高。在一些情况下，反应可以在约30°C 约40 V、 约25°C 约40°C、约25°C 约50°C、约30°C 约100°C等进行。反应混合物可以在适当的温度下保持约0 48小时、约2 M小时、约4 约18 小时、约8 约12小时，或者约1小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约18小 时、约M小时、约36小时，或者约48小时，或者更长时间。在一些实施方案中，在形成与至少一个蛋白质分子结合的金纳米簇之后，所述至 少一个蛋白质分子中的一个或更多个分子可以替换为稳定剂。在一些情况下，基本上所有 的蛋白质分子都可以被稳定剂所替代。在一些实施方案中，可以向含有蛋白质稳定的金纳 米簇的溶液中提供多种稳定剂分子，其中与蛋白质相比，所述稳定剂对金纳米簇具有更大 的亲和性。因而，与各个金纳米簇结合的至少一部分蛋白质分子可以被至少一种稳定剂分 子所替代。在一些情况下，在替代蛋白质之后，所述至少一种稳定剂可以保持与金纳米簇结 合。例如，在一些实施方案中，可以使用化学封端剂(capping agent)如半胱氨酸或谷胱甘 肽来萃取蛋白质分子。在稳定剂与金纳米簇结合之后，例如可以通过过滤、清洗和/或离心 法将蛋白质分子与由稳定剂稳定的金纳米簇分离。纳米簇可以储存任意时间段或者立即用于本文所讨论的应用之一中。纳米簇可以 储存至少约1天、至少约2天、至少约5天、至少约10天、至少约1个月、至少约3个月、至少约6个月或至少约1年，而每储存一月的性能损失不多于10%，或者每存储一月的性能 损失不多于5%，或者甚至2%。本文所述的纳米簇可以在不同的条件下储存。在一些情况 下，纳米簇可以在环境条件中和/或空气气氛下储存。在其他情况下，纳米簇可以在真空下 储存。在又一些情况下，纳米簇可以被冻干。本文所述的金纳米簇可以包含在多种系统/装置中和/或可以用于具体应用所用 的多种方法中。例如，金纳米簇可以用于电或化学传感装置中，其中所述装置可以用来定性 和/或定量地测定目标环境中的化学物质。即，金纳米簇可以与所述化学物质相互作用，使 得可以测定金纳米簇的性质变化，来确定物质在样品中是否存在和/或存在的量。作为另 一实例，金纳米簇也可以用于催化作用和/或生物应用中。在一些实施方案中，本发明提供定性和/或定量测定样品中的汞离子(Hf)的方 法和/或系统。汞是分布广泛的污染物，且Hg+2是具有高细胞毒性的腐蚀性和致癌物质。 Hg+2的测定方法对于环境样品的分析特别有用。在一些情况下，可以在暴露于怀疑患有汞 离子的样品之前和之后测定多个金纳米簇的性质(例如荧光)。可以测定性质变化，从而定 量地(例如，通过对照校准曲线)或者定性地(例如，通过性质的提高或下降)确定分析物 是否存在于样品中。在一些实施方案中，可以通过多个金纳米簇的性质的增/减(on/off)分析来定性 地确定汞离子(Hg”)的存在。在一些情况下，检测机制可以是“关闭(turn-off)”检测机 制，其中在不存在汞离子时，多个金纳米簇可产生荧光发射(或其他可测量的性质)。在汞 离子存在下，多个金纳米簇可以与至少一种汞离子相互作用并可出现猝灭态或暗态，在猝 灭态或暗态中观察到基本上降低的荧光发射或没有荧光发射(或其他可测量的性质)。在一些实施方案中，检测汞离子的方法包括提供多个金纳米簇(例如如本文所述 的)并且测定第一荧光强度(或其他可测量的性质)。然后可以使多个金纳米簇暴露于含 有或怀疑含有汞离子的样品并且可以测定第二荧光强度。可以通过测定第一和第二荧光 (或其他可测量的性质)之差来确定汞离子在样品中的存在与否和/或浓度。在一些实施 方案中，第一和第二荧光强度之差可以作为相对荧光(例如第二荧光强度除以第一荧光强 度)进行测定。可以将相对荧光与校准曲线进行对比以确定样品中汞离子的浓度。本领域普通技术人员将知晓测定材料(例如含金纳米簇的组合物)的荧光的方法 和技术。在一些实施方案中，可以由第一波长的光激发材料，该材料可以在较低能量的第二 波长(例如，较长波长)处发射能量。在一些情况下，本文所述的材料和组合物可以暴露于 波长小于约300nm、约300 约500nm、约400 约500nm，或者约420nm、约430nm、约440nm、 约450nm、约460nm、约470nm、约480nm、约490nm等的光。在一个特定的实施方案中，所述 光的波长为约470nm。组合物可发射具有如本文所述的波长(例如，约630nm 约700nm) 的能量。在一些情况下，所述方法可以包括提供含有多个金纳米簇和蛋白质和/或稳定 剂的组合物，将该组合物暴露于怀疑含有汞离子的样品，并且测定样品中是否含有汞离子 (例如通过测定组合物的至少一个性质的变化)。本发明的方法可以检测在样品中处于低浓度水平的汞离子。新近的理论研究表明 闭壳金属原子之间的分散力是特异性且强烈的，并且通过相对论性效应大大放大，特别是 当这些相互作用涉及重离子如Hg2+Gf14Sdici)和AU+(4f145d1(l)时更是如此。不希望受缚于理论，如本文所述的Au-NC的表面据信含有少量的Au+，从而允许与Hg2+的强而特异性的相 互作用，提供低检测限。在一些实施方案中，本文所述的方法具有的样品中汞离子的检测限 可以小于约50nM、小于约WnM、小于约ΙΟηΜ、小于约5nM、小于约InM、小于约0. 5nM、小于约 0. InM，或者约 ΙΟηΜ、约 5nM、约 InM、约 0. 5nM、约 0. InM，等。在一些情况下，检测汞离子的方法和制品可以是对汞离子特异性的。S卩，相比于其 他金属离子如 Ag+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、Cd2+、Pt4+、Pd2+、Co2+、Pb2+ 和 Ca2+ 离子，所述方法和制品可以特定地检测汞离子。特异性在样品取自环境来源的情况下(例 如，在样品有可能含有其他金属离子的情况下)是有利的。在一些情况下，金纳米簇或组合 物的荧光强度(或其他性质)变化在暴露于至少不同于Hf2的金属离子时小于约30%、小 于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约3%、小于约等。此外，检测汞 离子的方法和制品对于可能包含于样品中的多种阴离子(例如，Cl—、NO3—、S042—、PO43-和缓 冲液(例如，2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸))可以是稳健的。在一些实施方案中，可以提供制品，用于测定汞离子在样品中的存在与否和/或 浓度。在一些情况下，制品可包括底物和组合物，所述组合物与底物结合。组合物可包含金 纳米簇和蛋白质或稳定剂(例如如本文所述的)。在一些实施方案中，该制品可以是测试条，其中可以将该条暴露于怀疑含有汞离 子的溶液中。测试条可含有组合物(例如，含有金纳米簇和蛋白质或稳定剂)，其可以在暴 露于汞离子时具有荧光发射(或其他性质)变化。在一些实施方案中，荧光发射(或其他 性质)变化可以定量和/或定性地测定汞离子是否存在于样品中(例如，如本文所述)。测 试条可以具有任意合适的尺寸和/或形状(例如，正方形、矩形、圆形等)。在一些情况下， 测试条的尺寸可以使得其可以适合常用的实验室玻璃器皿(例如，试管)的口中。在一些情况下，可以提供一种包括用于测定汞离子在样品中的存在与否和/或浓 度的至少一个测试条和颜色(或其他性质)参比的试剂盒。在一些情况下，在颜色参比上 提供的颜色可以用来在暴露于怀疑含有或含有汞离子的样品后比对测试条的颜色。在一些 情况下，颜色参比的颜色可以用来比对测试条的荧光颜色(例如，在UV光下观察到的测试 条颜色)。在将测试条暴露于含有或怀疑含有汞离子的样品后，可以将测试条的颜色与颜色 参比相比对，来测定汞离子的存在与否，和/或测定汞离子在样品中的大致浓度。例如，在 测试条定性地起作用的情况下，颜色参比可以在暴露于不含汞离子的样品时显示测试条的 颜色。因而，如果暴露于样品后，测试条的颜色不同于颜色参比，则样品含汞。在测试条定 量地起作用的情况下，颜色参比可以显示多种颜色，每种颜色涉及样品中汞离子的大致浓 度。因而，在暴露于样品后，可以对测试条的颜色进行比对并且与颜色参比上最接近的颜色 进行匹配，从而表明汞离子在样品中的大致浓度。本领域普通技术人员将知晓测定颜色参 比的适当颜色的方法和技术(例如，通过将测试条暴露于各种已知浓度的含有汞离子的样 品)。该试剂盒可以另外包括使用说明书。颜色参比可以完全独立于测试条来显示或者可 以与测试条有关。组合物可以结合任何合适的底物以提供本发明的测试条。在一些实施方案中，底 物材料可以包含能够结合组合物中所含的或者与金纳米簇相结合的蛋白质或稳定剂的材 料。底物的非限制性的实例包括纤维素材料和非纤维素材料，例如硝化纤维素，纸，天然或 合成纤维，由诸如棉、人造丝、大麻、黄麻、竹纤维、醋酸纤维素、羧甲基化的溶纺纤维素纤维或其组合制得的线和纱。在一些实施方案中，底物可以包含聚合物，例如聚酯、聚酰胺、聚丙 烯酰胺、聚醋酸酯等或其组合。底物可以是多孔或无孔的。例如，组合物可以涂布到底物表 面上或者浸入底物中。底物可以是柔性和/或刚性的。在制造本发明的测试条时，可以使用本领域普通技术人员已知的技术将组合物施 涂于合适的底物。在本发明的实施方案中，测试条的制造包括制备可以施涂于底物的可涂 布液体组合物。一般而言，液体组合物通过将多个BSA-结合的金纳米簇加入到溶剂中而制 得。底物可以在使用前进行干燥(例如，在环境温度、在升高的温度、在真空下)。在一些实 施方案中，可以存在另外的组分(例如，表面活性剂、粘合剂等)。可以从任何合适来源获得样品。在一些实施方案中，所述样品可包括化学样品、水 样、提取物、环境样品(例如，环境来源)、食品等。在一些实施方案中，所述样品可以含有 或怀疑含有汞离子。样品可以作为自来源获得的原样直接使用或者可以预处理以改变样品 的至少一种特性。预处理方法可以包括过滤、蒸馏、浓缩、干扰组分的灭活，和/或试剂的添 加。在一些实施方案中，样品可以稀释或浓缩(例如，在汞离子的浓度过高以致于无法通过 与校准曲线或颜色参比简单对比而测定的情况下)。以下参考文献通过引用并入本文2008年8月5日由Ying等人提交的标题为 “Protein/peptide-mediated synthesis of highly fluorescent metal nanoclusters" 的美国临时专利申请序列号No. 61/129，994。在考虑以下实施例后将进一步理解本发明的这个和其他方面，所述实施例旨在举 例说明本发明的某些特定实施方案而无意于限制其由权利要求书限定的范围。实施例1以下实施例描述根据本发明的一些实施方案的金纳米簇的合成和性质。具体而言，该实施例描述一种基于常见市售蛋白质一牛血清白蛋白(BSA)的生物 矿化能力的简单一锅法“绿色”合成路径，用于制备在生理学温度(37°C)下具有红色发射 Uem最大=640nm，量子产率(QY) 6%)的Au-NC。在该实施例中，将Au (III)离子加入 BSA水溶液中。在一些情况下，BSA分子螯合Au离子并且捕集它们(见图1)。通过将反应 混合物的PH调节到约12激活BSA分子的还原能力；所捕集的离子经历逐步还原原位形成 BSA共轭的金纳米簇(BSA-Au-NC)。所制备的BSA-Au-NC含有约25个金原子(如显见于基 质辅助激光解吸/电离时间飞行(MALDI-T0F)质谱)，并且在BSA分子中作为BSA-Au-NC而 稳定(图1)。在该实施方案中的BSA-Au-NC是水溶性、缓冲液稳定的，并且甚至在苛刻条 件(例如强酸/碱和浓盐(IMWNaCl))的溶液中也稳定。合成方法能够容易地按比例放 大到克量级，其具有批次间的良好再现性，并且所制备的BSA-Au-NC能够在冻干后作为粉 末储藏。除了该方法的良好生物相容性和相当可观的环境/成本优势之外，Au-NC上的BSA 涂层还促进利用官能团的后合成表面修饰。在典型的合成中，在剧烈搅拌下将HAuCl4水溶液(5mL，10mM，37°C )加入BSA溶 液(5mL, 50mg/mL, 37°C )中。经过2分钟后，加入NaOH溶液(0. 5mL, 1M)，并且将混合物在 37°C培育12小时。溶液的颜色由浅黄变为浅棕，然后变成深棕色(图2A)。具体地，图2A 显示(I)BSA粉末和O)BSA水溶液以及(3)BSA-Au-NC水溶液和G)BSA-Au-NC粉末在可见 光(上图)和UV光(下图)下的照片。图2B显示(i)BSA和(ii)BSA-Au-NC的水溶液的 光吸收(虚线)和光电发射(实线，Aex = 470nm)谱图。图2B中的插图显示BSA-Au-NC在约480nm处的弱吸收峰。反应在约12小时内完成，如通过荧光演变的时程测量所确认地 那样(图幻。具体而言，图3显示含有HAuCl4和BSA的反应混合物在37°C下的光电发射 谱图(Xex = 470nm)的时间演变。BSA-Au-NC的深棕色溶液在UV光(约365nm)下发出强烈的红色荧光(图2A，下 图，3)。相反，对照BSA溶液在可见光下为浅黄色(图2A，上图，2)，且在UV光下发出峰值蓝 色荧光(图2A，下图，2)，其为氨基酸残基(色氨酸、酪氨酸(Tyr)和苯基丙氨酸)中的侧芳 基的特征。荧光性的Au-NC分别在约480nm和约640nm显示吸收峰和发射峰(图2B)。光 致发光量子产率(QY)为 6% (使用470-nm激光器的荧光素校准)。通过X-射线光电子能谱(XPS)测定BSA-Au-NC的氧化态。Au 4f7/2谱图能够反卷 积(deconvolute into)成中心结合能为84. 0和85. IeV的两个不同部分(图4B中分别为 线ii和i)，它们分别可以指认为Au(O)和Au(I)。具体地，图4显示(A) (iii)BSA-Au-NC 中的 Au 4f 的 XPS 谱图以及(B) (iv) BSA 和(v) BSA-Au-NC 的 MALDI-TOF 质谱。Au核表面上存在的少量Au(I)( 17% )有助于稳定纳米簇，如巯基保护的 BSA-Au-NC的先前结构研究中所述。考虑到BSA单体中存在35个巯基(来自35个半胱氨 酸(Cys)残基)，所制备的BSA-Au-NC可能具有类似的结构。BSA-Au-NC在约640nm具有光 电发射峰，表明存在基于球形Jellium模型的Aum簇。已经通过MALDI-T0F质谱法进一步 确认了所制备的Au-NC的尺寸。定义明确的蛋白质结构使得能够用MALDI-T0F质谱法分析 封装的纳米簇尺寸。无AuCl4-的BSA谱图在m/z 66kDa处显示一个峰(图4B)，该峰对 应于BSA的分子量。所制备的BSA-Au-NC显示出 5kDa的峰移位，这可能归因于Au-NC的 25个金原子。BSA-Au-NC的热重(TGA)分析也提供了支持性证据(图4C)。具体地，图4C 显示BSA-Au-NC粉末在空气中的TGA分析。已经报道过具有25个原子的Au-NC高度稳定， 且其对应于最常见的具有壳闭合和几何贡献的不可思议(magic)簇尺寸。对于在宽pH范围(3-12)溶液中，或者在各种缓冲溶液(例如，50mM的HEPES缓冲 液(pH 7. 65))中，或者在具有高盐浓度的溶液(例如，IM的NaCl)中的BSA_Au_NC，没有观 察到荧光性质的明显差别。溶剂可通过冷干去除，且BSA-Au-NC可以固体形式储存(图2A， 4)至少2个月，并在需要时重新分散。BSA-Au-NC可以通过与蛋白质(例如，通过BSA中的 35个Cys残基)键合的Au-S和由于蛋白质的庞大性引起的位阻保护作用的组合而被稳定。 BSA-Au-NC的高稳定性可以大大便于它们在体外和体内生物成像应用中的使用。Au-NC ( 0.8nm)(参见图5中代表性的TEM图)在BSA分子中的封装对BSA骨架(scaffold)的结构 影响很小(参见图6)。具体地，图6显示(i，或黑)BSA和(ii，或灰)BSA-Au-NC的(A)DLS 柱状图，(B)傅里叶变换红外(FTIR)谱图，(Ozeta电势结果，和(D)远-UV圆二色性(CD) 谱图。(A)中的插图显示(ii) BSA (与FITC染料共轭)和(i) BSA-Au-NC (在UV光下)的电 泳数据。尽管还不清楚在分子水平上BSA分子是如何使荧光性Au-NC “生物矿化”的，但存 在数个有启迪性的实验观测报告。不希望受缚于理论，在一些实施方案中，蛋白质的反应 残基对封装的Au离子的原位还原和NaOH的添加对于BSA-Au-NC的形成都是重要的。通过 在与BSA-Au-NC合成中的相同反应溶液中添加额外的还原剂硼氢化钠(NaBH4),进行对照 实验。所得的BSA-Au-NC发出非常弱的红色荧光(QY 0. 1%，表1和图7)。具体地，图7 显示对于(O)BSA，(1)在最优化条件下合成的BSA-Au-NC，(2)用NaBH4合成的BSA-Au-NC，(3)无NaOH时合成的BSA-Au-NC，(4)在100°C下合成的BSA_Au_NC，和(5)在低BSA浓度 (2. 5mg/mL)下合成的BSA-Au-NC的㈧可见光下和⑶紫外光下的照片，以及(C)光学吸 收谱图和(D)光电发射谱图(λ ex = 470nm)。近来研究已经显示Tyr或含有Tyr残基的定 制肽可以通过其酚基还原Au(III)或Ag⑴离子；它们的还原能力可通过将反应pH调节 到Tyr的pKa( 10)以上而得到大大改善。NaOH的添加也是必要的，如果没有NaOH，则仅 获得具有不规则或片状形貌的大纳米颗粒(> 20nm)(参见图8，其显示无NaOH时合成的 BSA-Au-NC的代表性TEM图)，并且这些纳米颗粒不显示荧光性。在合成具有高QY的荧光 性Au-NC中，反应温度是一个重要的考虑事项。反应在不同温度05、37和100°C)下进行， Au-NC在25°C下非常缓慢地形成；即使在反应12小时以后也没有检测到簇。在生理学温度 (370C )下的反应显示出合理的还原动力学。反应在12小时内完成，并获得具有高QY( 6%)的BSA-Au-NC。当反应温度升至100°C时，反应速度急剧增加。反应在几分钟内完成； 但是，所制备的BSA-Au-NC具有相对较低的QY( 0. 5%，参见表1和图7)。BSA浓度与Au 前体之比是重要的。在固定的Au前体浓度(5mM)下，为了有效保护Au-NC，需要高BSA浓度 (10-25mg/mL)(氨基酸残基浓度为 20_50mM)。将BSA浓度降至2. 5mg/mL,同时保持Au前 体浓度恒定(5mM)，产生不具有荧光性的大纳米颗粒(表1和图7)。表1.不同反应条件下合成的BSA-Au-NC的光学性能。
合成糾λ吸收(最大，nm)λ发射(最大， nm)QY (%)最优化条件(例如，参见实施例2 )4806406具有NaBH45306830.1不添加NaOH520, 584, 667--在 100 5446600.5在低BSA浓度(2.5 mg/mL )下530--在表1中，通过测量BSA-Au-NC和参比(基础乙醇中的荧光素溶液，QY = 97% ) 在470nm激发下的积分荧光强度来测定BSA-Au-NC的QY。用于光谱测量的BSA-Au-NC用去 离子水稀释以在470nm产生 0. 1的吸光度。总之，该实施例说明通过使用常见蛋白质来螯合并原位还原Au前体来制备具有 红色发光的Au-NC的新方法。所制备的BSA-Au-NC在溶液(水性或缓冲液)中以及固体形 式下都是稳定的。发光的Au-NC包含约25个金原子(Au25)。已优化实验条件来获得具有 高QY的BSA-Au-NC。方法和产品重要，不仅因为它们提供生产荧光性BSA-Au-NC的简单“绿 色”方法，还因为它们例证了蛋白质/肽和Au离子的相互作用(生物矿化或仿生矿化)可 以用来产生蛋白质-Au-NC。实施例2以下实施例描述有关实施例1中所制和使用的金纳米簇的另外的实验信息。所有化学药品都购自Sigma-Aldrich并且原样使用。使用超纯微孔水(18. 2M)。
红色荧光Au-NC的合成。所有玻璃器皿都用王水(HCl HNO3体积比=3 1) 清洗，且用乙醇和超纯水润洗。在一个典型的实验中，在剧烈搅拌下将HAuCl4水溶液(5mL， IOmM, 37°C )加入到 BSA 溶液(5mL, 50mg/mL, 37°C )中。2 分钟后加入 NaOH 溶液(0. 5mL, 1M)，使反应在剧烈搅拌下在37°C进行12小时。材料表征。分别用Agilent 8453 UV-可见分光光度计和Jobin Yvon Horiba Fluorolog荧光分光计获得吸收和光电发射谱图。使用BI-200SM激光光散射系统 (Brookhaven Instruments Corporation)进 亍 BSA—Au—NC 禾口 BSA/K溶液的 DLS 分析。在 ELAN 9000/DRC ICP-MS系统上进行元素分析。BSA和BSA-Au-NC的分子量用MALDI-T0F质 谱法在Bruker Daltonics Autoflex II T0F/T0F系统上进行分析。分别在200kV的FEI Tecnai TF-20场发射高分辨透射电子显微镜和VG ESCALAB MKII分光计上进行透射电子 显微镜(TEM)和XPS分析。通过XPSPEAK软件(4. 1版)，使用无定形碳校准Cls的结合能 (284. kV)，对Au 4f核级的窄区扫描XPS谱图反卷积。实施例3以下实施例说明使用根据本发明的一个非限制性实施方案的金纳米簇来检测汞 离子(Hg+2)。因为汞离子(Hg2+)对环境和人类健康的有害影响，所以其常规检测是水生生 态系统中环境监控的一个重要方面。不希望受缚于理论，近来的理论研究表明闭壳金属原子之间的分散力是高度 特异性和强烈的，并且通过相对论性效应被大幅放大，特别是在这些相互作用涉及如 Hg2+(4f145d10)和AU+(4f145d1(l)的重离子时更是如此。利用Hg2+-Au+的相互作用因而对于 Hg2+检测中的无标记方法有吸引力。如实施例1中所述，金纳米簇(BSA-Au-NC)是使用蛋 白质模板法合成的。所制备的BSA-Au-NC包含约25个金原子(Au25)，并且发出强烈的红 色荧光(λ em最大=640nm)。所述簇核表面通过少量可能与Hg2+具有强而特异性相互作用 的Au+( 17%)稳定。在该实施例中，如图9中所示，提供了一种用于检测Hg2+的技术，该 技术依赖于嗜金属的(metallophilic)Hg2+-Au+的相互作用来猝灭BSA-Au-NC的荧光。图 9显示(C)基于高亲和性嗜金属的Hg2+-Au+键引起的Au-NC荧光猝灭的Hg2+传感示意图， 以及Au-NC(20mM)在(1)不存在和⑵存在Hg2+离子(50mM)时的㈧光电发射谱图Uex = 470nm)，和(B)在UV光下的照片。这种一步法简单、快速，且具有高选择性和灵敏性。而 且，其可以用作(如以下所示)试纸条促进常规Hg2+的监测。荧光性BSA-Au-NC是根据实施例4中所述程序合成并提纯的。在将Hg2+离子 (50mM)加入Au-NC水溶液( 20mM)之后，BSA-Au-NC的红色荧光(图9B，1)在数秒内完 全猝灭(图9B，2)，在光电发射谱图中也很明显(图9A)。BSA-Au-NC的荧光猝灭归因于Hg2+ 与Au+的相互作用。可通过在Hg2+离子存在下向BSA-Au-NC溶液中加入强还原剂(例如， 硼氢化钠)来部分恢复BSA-Au-NC的红色荧光(图9A和9B，3)。不希望受缚于理论，据信 硼氢化钠将Hg2+还原成Hg°，并且因为Hg°与Au+的结合能较弱，因而对荧光性Au-NC的猝灭 效率较低。Hg的氧化态通过X-射线光电子能谱(XPS)加以确认(图10)。具体地，图10 显示(A)由BSA-Au-NC螯合的Hg离子和(B)由NaBH4还原的螯合Hg离子的XPS Hg 4f谱 图。BSA-Au-NC溶液中Hg2+离子的加入对BSA-Au-NC的尺寸具有很小的影响(图11)， 这排除了 BSA-Au-NC团聚对荧光猝灭的影响。图11显示在Hg2+离子存在下的BSA-Au-NC的代表性TEM图，表明簇尺寸为 0. 8nm。而且，所制备的BSA-Au-NC的团聚对BSA-Au-NC的荧 光具有可忽略的影响(图12)。图12显示(A)通过1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚 胺(EDC)法与聚苯乙烯珠粒(Imm)共轭的BSA-Au-NC的示意图和(B)聚苯乙烯-BSA-Au-NC 的代表性荧光图。Hg2+-Au+相互作用的高特异性为该方法提供了与其他环境相关金属离子相比检测 Hg2+的优异选择性。图13A显示BSA-Au-NC的荧光没有被50M的Ag+、Cu2+、Si2+、Mg2+、K+、Na+、 Ni2+、Mn2+、Fe3\ Cd2+、Pt4+、Pd2+、Co2+、Pb2+ 和 Ca2+ 离子猝灭。只有 Hg2+ 离子导致 BSA-Au-NC 的荧光几乎100%的猝灭(图13B)。这种检测选择性可用肉眼目测(图13B)。具体地，图 13显示在50mM的各种金属离子的存在下，Au-NC水溶液QOmM)的㈧在UV光下的照片， 和⑶在λ ex = 470nm的相对荧光(1/1。)。此外，所制备的Au-NC对于各种阴离子(例如，Cl_、N03_、S042—和P043_)和缓冲液 (例如，2-(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸(HEPEQ)是稳健的，使得该方法适于检测 来自各种环境的样品。Hg2+与Au+的强结合能也使得该方法高度灵敏。理论上，BSA-Au-NC 的荧光可以被一个Hg2+离子通过与NC表面上的一个Au+离子相互作用而猝灭。为评估该分 析的灵敏性，将不同浓度的Hg2+(0. 05-100nM)加入一系列含有20nM的Au-NC的溶液中。如 图14中所示，BSA-Au-NC的荧光随着Hg2+浓度的增加而下降。在1_20ηΜ的Hg2+浓度范围 内，BSA-Au-NC的荧光强度针对Hg2+线性下降。具体地，图14显示(A) BSA-Au-NC (20nM)在 不同Hg2+浓度存在下的光电发射谱图(λ = 470ηπι)，和⑶随Hg2+浓度变化的BSA-Au-NC 的相对荧光(Ι/Ι。)。图14C显示对于1-20ηΜ的Hg2+的线性检测范围。在信噪比为3时，Hg2+ 的检测限(LOD)估计为0. 5nM(0. lppb)，这远远低于美国国家环境保护局(United States Environmental Protection Agency (EPA))所容许的饮用水中汞的最大含量(2. Oppb)。使用金纳米簇的Hg+2检测可以扩展到试纸条体系。将BSA-Au-NC分散到硝化纤维 素条上。它们通过能够被捕集在硝化纤维素膜中的BSA骨架封装。未结合的BSA-Au-NC被 水冲洗掉。通过将该测试条浸渍在浓度为50mM的各种金属离子的溶液中评估该试纸条体 系用于Hg2+检测的选择性。只有在Hg2+离子溶液中浸渍的测试条在UV光下为淡绿色(其 为硝化纤维素膜的背景颜色)(图15A)。具体地，图15A显示测试条已在50mM的各种金属 离子溶液中浸渍过之后的具有BSA-Au-NC的测试条在UV光下的照片。所有其他测试条发 出与BSA-Au-NC有关的红色强烈荧光。如图15B所示，在测试条于各种浓度QmM(深绿)、 200nM(紫)、20nM(紫-粉)和2nM(粉))的Hg2+离子溶液中浸渍之后，它们还给出不同的 颜色(从绿色到紫色)。具体地，图15B显示已在Hg2+溶液中浸渍过的测试条(在UV光下) 的照片。因而，它们能够用来在视觉上快速评估Hg2+离子的浓度。该实施例说明根据非限制性的实施方案，使用在水性介质中的荧光性BSA-Au-NC 以极高选择性和灵敏度检测Hg2+离子的新的简单方法。传感机理是基于高亲合性嗜金属的 Hg2+-Au+相互作用，其有效猝灭BSA-Au-NC的荧光。BSA-Au-NC显示与其他金属离子相比对 Hg2+显著高的选择性，并且以低至0. 5nM的浓度检测Hg2+离子。该方法是值得注意的，因为 其涉及绿色化学并且能够研发成简单的试纸条体系用于Hg2+离子的快速常规监测。实施例4以下实施例描述关于实施例3中所制和所用金纳米簇的另外的实验信息。所有化学药品都购自Sigma-Aldrich并且原样使用。使用超纯微孔水(18. 2MW)。
红色荧光Au-NC的合成。所有玻璃器皿都用王水(HCl HNO3体积比=3 1) 清洗，且用乙醇和超纯水润洗。在一个典型的实验中，在剧烈搅拌下将HAuCl4水溶液(5mL， IOmM, 37°C )加入到 BSA 溶液(5mL, 50mg/mL, 37°C )中。2 分钟后加入 NaOH 溶液(0. 5mL, 1M)，使反应在剧烈搅拌下在37°C进行12小时。实施例5使用实施例4中所述程序，利用人血清白蛋白(HSA)或溶菌酶(LYS)代替BSA来 合成Au-NC。利用(i)BSA，(ii)HAS，或者(iii) LYS合成的Au-NC的水溶液的光电发射Uex =470nm)谱图，示于图16中。虽然本文中描述和说明了本发明的若干实施方案，但本领域普通技术人员将易于 想到多种实现本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一种或多种所述优点的其 他手段和/或结构，各个这类变化和/或修改均被视为在本发明的范围之内。更普遍地，本 领域技术人员将易于理解本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和构造是示例性的，实际的 参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教导的具体应用。本领域技术人员将认 识到或能仅用常规实验方法确定本文所述本发明的具体实施方案的许多等价物。因此，应 理解前述实施方案仅是以实例的方式给出的，在所附的权利要求书及其等价物的范围内， 本发明可以采取除了具体描述和要求保护的方式之外的方式实施。本发明旨涉及本文中所 述的各个独立特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两种或多种这类特征、系 统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包括在本发明的范围之内，如果这类特征、 系统、制品、材料、试剂盒和/或方法互不矛盾的话。除非有明确的相反指示，否则本说明书和权利要求书中没有限定数量词应理解为 指“至少一个”。本说明书和权利要求书中用到的表述“和/或”应理解为指所连结的要素的“任一 或二者”，即要素有时连在一起出现、有时分开出现。除“和/或”从句明确指出的要素外， 其他要素也可任选存在，无论与那些明确指出的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性 的实例，当与开放式语言如“包含” 一起使用时，"A和/或B”的提及在一个实施方案中可 仅指A没有B (任选包括B之外的要素)；在另一个实施方案中可仅指B没有A (任选包括A 之外的要素)；而在又一个实施方案中可指A和B (任选包括其他要素)；等等。本说明书和权利要求书中所用的“或”应理解为具有与上面定义的“和/或”相同 的含义。例如，在列表中分开列举项目时，“或”或“和/或”应理解为包括性的，即包括许 多要素或要素列表中的至少一个但也包括一个以上，并任选包括另外的未列出的项目。只 有明确指出相反的术语例如“仅……之一”或“确切地……之一”或当在权利要求书中使用 “由……组成”时指包括许多要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当前面有排他性的 术语如“任一”、“……中之一”、“仅……中之一”或“……中确切之一”时，本文中用到的术 语“或”应仅理解为表示排他的或者(即“一个或另一个而非二者”)。用于权利要求书中 时，“基本由……组成”应具有其在专利法领域中所用的普通含义。本说明书和权利要求书中指代一个或多个要素的列表所用到的表述“至少一个” 应理解为意指选自要素列表中任何一个或多个要素中的至少一个要素，但不一定包括要素 列表内明确列出的至少每一个要素，也不排除要素列表中要素的任何组合。在该定义下，除 要素列表内由表述“至少一个”所明确指出的要素外的要素也可任选存在，而无论其与那些明确指出的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性的实例，“A和B中的至少一个”(或 等价于“A或B中的至少一个”或等价于“A和/或B中的至少一个”在一个实施方案中可指 至少一个、任选包括一个以上A而无B存在(并任选包括B之外的要素)；在另一个实施方 案中可指至少一个、任选包括一个以上B而无A存在(并任选包括A之外的要素)；而在又 一个实施方案中可指至少一个、任选包括一个以上A和至少一个、任选包括一个以上B (并 任选包括其他要素)；等。 在权利要求书和以上说明书中，所有过渡词语如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、 “含有”、“涉及”、“持有”等均应理解为开放式的，即指包括但不限于。仅过渡词语“由…… 组成”和“基本由……组成”分别对应于封闭或半封闭式的过渡词语，如美国专利局专利审 查程序手册第2111. 03部分中所规定的。
权利要求
1.一种组合物，其包含 多个金纳米簇；和蛋白质或稳定剂，其中所述金纳米簇能够以至少1 %的量子产率发出波长为约630nm到约700nm的荧光。
2.一种形成多个金纳米簇的方法，其包括形成含有多个金原子前体分子和多个蛋白质分子的反应混合物，其中所述金原子前体 分子与所述蛋白质分子之比为至少约5 1 ；将所述反应混合物的PH调节到大于约11 ；以及将所述反应混合物在适当的温度维持足够的时间段，以形成多个由至少一个蛋白质分 子稳定的金纳米簇，其中所述金纳米簇的平均直径小于约2nm。
3.—种检测汞离子的方法，其包括提供含有多个金纳米簇和蛋白质或稳定剂的组合物； 将所述组合物暴露于怀疑含有汞离子的样品；以及 测定所述样品是否含有汞离子。
4.一种检测汞离子的方法，其包括提供多个金纳米簇，所述金纳米簇在约630nm到约700nm的波长具有量子产率为至少的第一荧光强度；将所述纳米簇暴露于怀疑含有汞离子的样品并测定所述荧光强度的变化；以及 基于所述荧光强度的变化测定所述样品中是否含有汞离子。
5.一种检测汞离子的方法，其包括提供含有多个具有式Aum的稳定金纳米簇的组合物； 将所述组合物暴露于怀疑含有汞离子的样品；以及 测定所述样品中是否含有汞离子。
6.一种用于测定样品中是否存在汞离子的制品，其包括 底物；和与所述底物结合的组合物，其中所述组合物含有金纳米簇和蛋白质或稳定剂。
7.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇含有约25个金原子。
8.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述蛋白质为牛血清白蛋白。
9.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述蛋白质为人血清白蛋白。
10.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述蛋白质为溶菌酶。
11.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇的平均直径小于 约 2nm0
12.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇的平均直径小于 约 lnm。
13.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇是基本单分散的。
14.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇能够发出波长为约630nm到约700nm的荧光。
15.
16.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇能够发出量子产 率为至少的荧光。
17.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇能够发出量子产 率为至少3%的荧光。
18.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述金纳米簇能够发出量子产 率为约6%的荧光。
19.前述权利要求中任一项的方法，包括将所述反应混合物加热到至少30°C持续至少 2小时。
20.前述权利要求中任一项的方法，包括将所述反应混合物在约37°C加热至少约8小时。
21.前述权利要求中任一项的方法，还包括用稳定剂来替代稳定所述金纳米簇的至少 一个蛋白质分子中的一个或更多个分子。
22.前述权利要求中任一项的组合物、方法或制品，其中所述稳定剂为半胱氨酸或谷胱 甘肽。
23.前述权利要求中任一项的方法或制品，其中所述汞离子的检测限小于约5nM。
24.前述权利要求中任一项的方法或制品，其中所述汞离子的检测限小于约InM。
25.前述权利要求中任一项的方法或制品，其中所述汞离子的检测限小于约0.5nM。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中测定样品中是否含有汞离子包括测定所述组 合物或金纳米簇的荧光变化。
27.前述权利要求中任一项的方法，其中所述金纳米簇或组合物的荧光强度变化在暴 露于选自 Ag+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、Cd2+、Pt4+、Pd2+、Co2+、Pb2+ 或 Ca2+ 的至 少一种金属离子时小于20%。
28.前述权利要求中任一项的方法，还包括测定所述样品中汞离子的浓度水平。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品中汞离子的浓度水平是基于所述组 合物或金纳米簇的荧光变化测定的。
30.前述权利要求中任一项的方法，其中从环境来源获得所述样品。
31.前述权利要求中任一项的制品，其中所述底物包括硝化纤维素。
32.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述反应混合物的pH调节到大于约12。
33.前述权利要求中任一项的方法，其中通过向所述反应混合物提供碱来调节所述反 应混合物的PH。
34.权利要求33的方法，其中所述碱为NaOH。
全文摘要
本发明一般性地涉及金纳米簇，特别涉及荧光性金纳米簇。该金纳米簇可以，例如用蛋白质或稳定剂来稳定。在一些情况下，金纳米簇可以用于测定汞离子在样品中的存在与否和/或浓度的方法或制品中。
文档编号B82B1/00GK102150034SQ200980134750
公开日2011年8月10日 申请日期2009年8月4日 优先权日2008年8月5日
发明者应仪如, 谢建平, 郑远刚 申请人:新加坡科技研究局