专利名称：阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药多糖，涉及基因载体，具体涉及一种阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体。
背景技术：
近年来，随着生物科技的不断发展，基因治疗已经成为临床治疗许多重大疾病如癌症、心脑血管疾病、糖尿病等的有效手段。随着基因治疗研究的深入，人们发现，基因治疗的关键是选择合适有效的基因载体即恰当的导入方法，使目的基因获得靶向性导入、稳定有效的表达，而不对机体产生毒副作用。目前，用于基因治疗的载体有两种病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体在目前的基因治疗临床实验研究中被广泛采用，但是其自身的许多不足，如潜在的致癌性、自身免疫原性、目的基因的容量小以及靶向特异性差等限制了其应用。而非病毒载体具有毒性低、免疫反应小、易于修饰以获得更好的靶向性等优点，越来越受到人们的重视。阳离子聚合物是一类倍受人们关注的基因载体。阳离子聚合物种类很多，目前研究较多的有多肽类聚赖氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺类 聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺树状物；聚甲基丙烯酸类聚酰胺 胺型树状物以及一些天然高分子如壳聚糖、明胶等(参考王勤，龚跃法等。基因阳离子聚合物的研究进展。广东药学院学报，2004,22 (1):180^185. )0这些聚合物结构上的一个共同特点是分子内含有许多氨基，在生理PH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷，使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，或将目的基因包裹在其中， 使DNA免受核酸酶的降解，它们可以作为基因载体。但是这些阳离子聚合物存在自身的局限性，如多聚胺类缺乏生物可降解性、多肽类有潜在的免疫原性等。目前有一种合成材料聚乙烯亚胺(PEI)，试验发现高分子量(>20000 Da)的PEI转染效率非常高，但是细胞毒性很大，而且存在降解性的问题；小分子量PEI (600 Da, 1300 Da, 2000 Da)毒性很小， 在体内易于代谢，几乎无转染毒性(参考=Hongliang Huang，Hai Yu，Guping Tang， Qingqing Wang and Jun Li ’ Low molecular weight polyethylenimine cross linked by 2 hydroxypropyl γ cyclodextrin coupled to peptide targeting HER2 as a gene delivery vector. Biomaterials, 2010, 31(7) : 1830 1838)。还有学者采用乙二胺、精胺、腐胺、精脒等胺类化合物修饰明胶(参考T0SHIHIR0 KUSHIBIKI, RYUJI T0M0SHIGE, KAZUN0RI IffANAGA etal. In vitro transfection of plasmid DNA by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edn，2006，17 (6) : 645 658.)、葡聚糖(参考Hagit Eliyahu，Aviva Joseph , Tony Azzam et al. Dextran-spermine based polypiexes-Evaluation of transgene expression and of local and systemic toxicity in mice. Biomaterials 27 (2006) 16361645.)等高分子化合物，研究其作为非病毒基因载体的可能性。多糖，作为一种自然界广泛存在的天然高分子化合物，广泛存在于植物、海洋生物和菌类等生物中，具有生物可降解性和生物相容性。大多数植物多糖都有生物活性，是有机
4体重要的组成部分之一。由于多糖链含有许多活性羟基，有很高的反应活性，易于进行化学修饰，从而增加新的生物学功能。桑叶多糖是近年来发现的桑叶中又一种有效活性成分，具有降血糖的作用。
发明内容
本发明以桑叶多糖(拉丁学名folium Mori)为主体，使用不同的方法对其进行胺化修饰，增加其正电性，使其易于结合带负电的质粒DNA，成为有效的基因转运载体。 具体为桑叶原药材经水提醇沉，三氯乙酸法除蛋白之后，分别用AB-8大孔吸附树脂和 SephadexG-IOO葡聚糖凝胶树脂进行分离纯化，透析，冻干，得到精制的桑叶多糖之后，分别用胺类化合物精胺、乙二胺以及小分子量PEI修饰多糖链，得到阳离子化的桑叶多糖。然后，阳离子化的桑叶多糖与质粒DNA结合形成纳米复合物。本发明将三种阳离子化的桑叶多糖对质粒DNA的结合、干细胞转染效果、细胞黏附性进行了对比，同时设置脂质体阳性对照，实验结果表明乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖与质粒DNA的结合作用好，干细胞转染效率明显高于精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖和小分子量PEI修饰的阳离子化的桑叶多糖，也高于阳性对照脂质体的干细胞转染效率，并且细胞黏附性试验表明其具有良好的细胞黏附性，细胞毒性试验表明其安全无毒。本发明采用化学修饰的方法，提供了一种基于阳离子化的的高效无毒的基因载体。本发明的技术方案如下
一种阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体，它是一种用胺类化合物修饰的阳离子化的桑叶多糖结合DNA质粒的基因载体，桑叶多糖的分子量分布为3 3. 5 X IO4 Da，其中按质量比计，阳离子化的桑叶多糖DNA质粒=0.5 100:1，质粒的粒径为50-150nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。—种制备上述阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体的方法，它包括以下步骤 步骤1.氧化桑叶多糖的制备
称取0. 5 Ig精制的桑叶多糖，溶解于20ml 50ml双蒸水中，加入KIO4, KIO4与多糖中单糖单位的摩尔比为0. 5 5:1，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h;反应液加入 l(T20ml乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min ；将反应液装入透析袋(截取分子量 >3500Da)，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到氧化桑叶多糖0. 4 0. 9g。步骤2.阳离子化的的制备
A.精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备
称取0.广0.5g步骤1制得的氧化桑叶多糖，溶解于l(T50ml双蒸水中；称取 0. 2^1. 5g精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)；精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为 0. 5 5:1，将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh ；之后，向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，相同条件下继续反应48h ；再向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为0. 5 3:1，相同条件下继续反应Mh;将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h (截取分子量>3500Da)；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖 0. 2 0. 4go
B.乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备
取0.1~0.5g步骤1制得的氧化桑叶多糖，溶解于l(T50ml双蒸水中；取乙二胺溶于 5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)，乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0. 5 5:1 ；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh ；之后，向反应液中加入0. 1~0. 5g硼氢化钠，相同条件下继续反应48h ； 再向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为 0. 5 3:1，相同条件下继续反应Mh ；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖0. 2~0. 4g。C.聚乙烯亚胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备
称取0. 2~0. 5g精制的桑叶多糖，溶于l0~l5ml磷酸盐缓冲液(pH=7)；将活化羟基的连接剂，如N，N’ -羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N，N’ - 二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5ml 二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为0. 5 3:1，在氮气的保护下， 首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在3(Tl00min内加完，加完之后，室温反应90~l50min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺溶于IOml磷酸盐缓冲液中，多糖与聚乙烯亚胺的质量比为0. 5 4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖液中，边加边搅拌，在12(Tl50min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析(截取分子量>3500Da)、冻干之后，得到聚乙烯亚胺修饰的阳离子化的桑叶多糖。步骤3.阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体的制备
分别称取l(T40mg上述三种阳离子化的桑叶多糖溶解于0. 5^2ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。各取阳离子多糖储备液50 μ 1，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液； 分别取10 μ 1阳离子多糖应用液和10 μ 1含0.广3yg DNA质粒溶液，分别在55°C加热 3(T60min ；再将二者混合，涡旋30s，即得到胺类化合物修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体。有益效果
三种阳离子化的桑叶多糖均有良好的DNA质粒结合作用。糖链结合胺类化合物之后， 正电荷增加，因而能够很好的与带负电荷的DNA质粒通过静电作用而结合，保护DNA质粒免受细胞内外各种酶的降解。其中，乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖具有最佳的干细胞转染效果，经电泳实验和干细胞转染实验说明其对DNA质粒有更好的结合和释放效果。而且， 桑叶多糖具有良好的生物活性，与以往用来制备阳离子聚合物的多糖相比，具有更好的生物可降解性和生物相容性，制备工艺简单，价格低廉。荷正电的的桑叶多糖在其天然的生物活性基础上，增加了新的生物学功能，成为一种生物可降解、高效低毒的新型非病毒基因载体材料。
图1为乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备工艺流程图。图2为乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的电泳图，其中 孔道 1 裸 pTGFii-l ；孔道2 8:分别为阳离子化的桑叶多糖与pTGFi3-l (质量)比为1:1 ;1:2 ；1:5 ；1:10； 1:30 ；1:50 ；1:70。图3为乙二胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的透射电镜图。图4为乙二胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径分布图。图5为乙二胺、精胺和PEI修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物基因转染效果图，其中PEI柱代表以PEI-DNA质粒纳米复合物基因转染效果(PEI分子量25KD)为阳性对照组，桑叶-乙二胺柱代表乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物基因转染效果，桑叶-SP柱代表精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因转染效果；桑叶-PEI柱代表PEI修饰的阳离子化的桑叶多糖转染效果。
具体实施例方式以下实施例所采用的材料和仪器
实验材料桑叶(中药材，镇江市芝林大药房)；95%乙醇(山东广源医药有限公司)；无水乙醇、丙酮、乙醚、乙二醇、三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司)；AB-8大孔吸附树脂(安徽三星树脂有限公司)；kphadexG-100 凝胶树脂(Shanghai RiChu Bioscience 有限公司)；ΚΙ04 (国药集团化学试剂有限公司)；精胺(Biosharp公司，美国)，乙二胺 (Sigma^Aldrich, USA) , PEI (Sigma^Aldrich, USA)；硼氢化钠(国药集团化学试剂有限公司);无内毒素质粒大提试剂盒(康为世纪);Rat TGF β 1 ELISA Kit (烟台赛尔斯生物技术有限公司)。实验器材磁力搅拌器(金坛大中仪器厂)；透析袋(Biosharp公司，美国)；超低温高速离心机(Heareus，德国)；CHRIST冷冻干燥干机(BMH公司，德国)，DY602S稳流稳压电泳仪(南京新校园生物技术研究所)；JEMllOO透射电子显微镜(日本电子)；旋转蒸发仪 (Heidolph公司，德国)。实施例1.精制的桑叶多糖的制备
称取干燥桑叶120g，粉碎成粉末，过60目筛；按如下工艺进行提取料液比1 :12，提取温度85°C，提取时间2h/次，提取次数2次；合并两次浸提液，5000rpm离心lOmin，取上清液；再将上清液旋转蒸发浓缩至原体积的1/6，得浓缩液；浓缩液再用95%的医用酒精进行沉淀，至醇浓度为75%，4°C静置12h ；收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次； 真空干燥，得到桑叶粗多糖。称取3g桑叶粗多糖，完全溶解于40ml双蒸水中，向其中加入20%三氯乙酸溶液直至三氯乙酸终浓度为3%，边加边搅拌，加完之后，4°C静置证，离心3000r/min，IOmin,除去沉淀，上清液用IM NaOH溶液中和，旋转蒸发浓缩，透析，冻干，得到除蛋白的桑叶多糖。称取0. 5g除蛋白之后的桑叶多糖，完全溶解于IOml双蒸水中，3000r/min，离心 IOmin,取上清液，上AB-8大孔吸附树脂柱，用双蒸水作为洗脱液，流速6ml/min，收集洗脱液，同时采用硫酸-苯酚法跟踪检测收集的多糖含量；将含多糖的收集液合并，旋转蒸发浓缩，得浓缩液，透析，冻干。称取步骤3得到的桑叶多糖0. 2g，溶解于上S^hadexG-IOO凝胶树脂柱，以0. 1 mol/LNaCl溶液作为洗脱液，流速6ml/min，收集洗脱液，同时采用硫酸-苯酚法跟踪检测收集的多糖含量，将含多糖的收集液合并，旋转蒸发浓缩，透析，冻干，得到纯化的桑叶多
7糖。实施例2.氧化桑叶多糖的制备
称0. 5g精制的桑叶多糖，溶解于30ml双蒸水中，加入0. 8g KIO4,迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h ；反应液加入12ml乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min ；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到氧化桑叶多糖。实施例3.乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备
取0. 3g氧化桑叶多糖，溶解于20ml双蒸水中；取0. Iml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh;之后，向反应液中加入0.4g硼氢化钠，相同条件下继续反应48h;再向反应液中加入0.4g硼氢化钠，相同条件下继续反应 24h ；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖。实施例4.乙二胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体的制备称取30mg乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖溶解于0. 5ml双蒸水，得到阳离子多糖
储备液。取阳离子多糖储备液50 μ 1，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μ1阳离子多糖应用液和10μ1含0.2yg DNA质粒溶液，分别在55°C加热30min;再将二者混合， 涡旋30s，即得到乙二胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体，其透射电镜见图3，粒径分布见图4。实施例5.
取0. 5g氧化桑叶多糖，溶解于30ml双蒸水中；取0. 62ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh;之后，向反应液中加入0.5g硼氢化钠，相同条件下继续反应48h;再向反应液中加入0.5g硼氢化钠，相同条件下继续反应 24h ；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖。电泳检测证明本施例制备的阳离子化的桑叶多糖比实施例3制备的阳离子化的桑叶多糖对质粒DNA的包裹效果好。实施例6.
称取20mg乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖溶解于Iml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μ 1，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μ1阳离子多糖应用液和10 μ 1含0. 4 μ g DNA质粒溶液，分别在55°C加热30min ；再将二者混合， 涡旋30s，即得到乙二胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体。电泳检测证明 实施例4所制备的阳离子化的桑叶多糖比本实施例制备的阳离子化的桑叶多糖对质粒DNA 有更好的包裹作用。实施例7.聚乙烯亚胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备
称0.2g精制的桑叶多糖，溶解于20ml磷酸盐缓冲液(Ph=7)中；将活化羟基的连接剂N，N’-羰基二咪唑(Aldrich，美国)0. 5g溶解于5ml 二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺0. 1ml，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在3(Tl00min内加完，加完之后，室温反应9(Tl50min，获得活化的多糖溶液；分别将5. Og数均分子量为600Da或2000Da的PEI溶于IOml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖液中，边加边搅拌，在 12(Tl50min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析冻干之后， 得到数均分子量600Da或2000Da的PEI修饰的阳离子化的桑叶多糖。以苯并三唑碳酸酯(Aldrich，美国)、羰基咪唑(Aldrich，美国)或N，N，-二琥珀酰亚胺基硫酸酯(Aldrich，美国)替代N，N’ -羰基二咪唑进行上述制备，其它步骤不变，得到相同的结果。实施例8. PEI修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体的制备
称取40mg PEI修饰的阳离子化的桑叶多糖溶解于Iml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μ 1，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μ1阳离子多糖应用液和10 μ 1含0. 2 μ g DNA质粒溶液，分别在55°C加热35min ；再将二者混合，涡旋30s，即得到PEI修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体。实施例9.精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备
称取0. 2g氧化桑叶多糖，溶解于IOml双蒸水中；称取0. 5g精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)；将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh ；之后，向反应液中加入0. 2g硼氢化钠， 相同条件下继续反应48h ；再向反应液中加入0. 2g硼氢化钠，相同条件下继续反应Mh ；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h (截取分子量大于>3500Da)；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖。实施例10.精胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体
称取20mg精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖溶解于Iml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μ 1，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μ1阳离子多糖应用液和10 μ 1含0. 4 μ g DNA质粒溶液，分别在55°C加热45min ；再将二者混合，涡旋30s，即得到精胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体。实施例11.琼脂糖凝胶电泳
制备1%琼脂糖凝胶，加入0. 5 μ g/ml溴化乙啶，铺板，加样，在80V电泳1. 5h后采用凝胶成像系统观察结果。如图二所示，阳离子化的桑叶多糖能够较好的包裹质粒DNA。琼脂糖DNA电泳的步骤如下
步骤1.制备1%琼脂糖凝胶称取0. 2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20ml 0. 5 X TBE, 瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇勻，即得到1. 0%琼脂糖凝胶液。步骤2.胶板制备将电泳槽内的有机玻璃内槽和制胶槽洗干净，晾干。将有机玻璃内槽放入制胶槽内，并在固定位置放好梳子。待琼脂糖凝胶溶液冷却到65 °C左右，向琼脂糖凝胶液中加0. 5μ g/ml溴化乙锭，混勻，小心地倒入有机玻璃内槽，是凝胶液缓慢展开， 直到整个玻璃板表面形成均勻胶层。室温下，水平静置直至凝胶完全凝固，垂直轻轻拔出梳子，将凝胶及内槽一起放入电泳槽中。步骤3.配样采用实施例5所制备的阳离子化的桑叶多糖，以不同的阳离子多糖与质粒DNA的质量比所制备的一些列样品，分别为荷正电桑叶多糖与质粒DNA质量比为 2:1 ；5:1 ；10:1 ；30:1 ；50:1 ；80:1 ；100:1。步骤4.加样在点样板上混合一系列阳离子化的桑叶多糖与质粒DNA不同质量
9比的多糖-质粒DNA复合物样品(阳离子化的桑叶多糖与质粒DNA的质量比从第2孔道到第8孔道依次为2:1 ;5:1 ;10:1 ;30:1 ;50:1 ;80:1 ;100:1)和上样缓冲液，第1孔道为游离质粒DNA。用10 μ 1微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内。步骤5.电泳加油后的凝胶板立即通电进行电泳，电压6(T100V，样品由正极(红色)向负极(黑色)方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板前沿约Icm处时，停止电泳。步骤6.电泳完毕后，取出凝胶。步骤7.观察照相在紫外灯下观察，DNA存在则显示出橙红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。可见阳离子化的桑叶多糖对DNA质粒具有明显的包裹作用(见图2)。 图2中，孔道1中为裸露的质粒，会被凝胶中的溴化乙啶染色，在紫外灯下显现橘红色荧光， 在电泳中朝正极迁移，而从孔道2到孔道8是与阳离子化桑叶多糖结合的质粒(阳离子化多糖与质粒DNA的质量比从第2孔道到第8孔道依次为2:1 ；5:1 ；10:1 ；30:1 ；50:1 ；80:1 ； 100:1)，第2、孔道由于多糖量不足以完全包裹质粒而使部分质粒释放出来，在凝胶中有明显的迁移，第5孔道虽然没有明显的DNA迁移条带，但是在原孔显出橘红色荧光，说明有部分的质粒裸露在纳米复合物的表面；随着多糖质量比重的增加(第6、孔道)，由于质粒完全被阳离子化多糖包裹而避免被溴化乙啶染色，从而显现不出荧光，同时阳离子化多糖的正电荷中和了质粒的负电荷，在电泳中不向正极迁移而滞留在原孔道中。实施例12.转染效果的测定
以TGFii-I质粒为报告基因，按照实施例一、二、三所述制备三种阳离子化的桑叶多糖 )ΝΑ质粒纳米粒基因载体。96孔板中培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，细胞浓度达到 2 X 105/ml完全培养基/孔，孵育24、》!后，用无血清培养基置换原培养基，分别加入三种阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物、脂质体Lipofectamine-DNA质粒复合物、游离质粒，使每孔质粒DNA量均为0. 2 μ g，并以空白细胞为阴性对照，孵育4h后，将无血清培养基置换成新鲜的含血清培养基，继续孵育72h，Rat TGF-β 1 ELISA Kit检测转染效果。 如图5所示，精胺和小分子量PEI修饰的桑叶多糖均有一定的转染效果，但是比不上脂质体-DNA质粒复合物的转染效率，乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒复合物的转染效率最高，且高于脂质体-DNA质粒复合物的转染效率。说明乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖是这三种荷正电的多糖中作为基因转染载体的最佳选择。细胞转染实验步骤 步骤1、干细胞分离及培养
将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡3 5min，无菌条件下取出胫骨和股骨；将其两端干骺端切除，露出骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔；反复吹打冲出骨髓；使骨髓细胞充分分散；所获得的骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预置的 Percoll分离液(相对体积质量1. 073)的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的体积比为 1 1 ；2000rpm,离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；重新悬起细胞，加入完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM)，置于培养瓶中，37°C体积分数为5%的CO2 培养才苜中培养ο步骤2.细胞转染
三种阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的转染分别取乙二胺、精胺和小分子量PEI修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物(20 μ g/ml)，分别加至96孔板中(2. 5X IO5/孔)并轻轻摇晃使其均勻混合；放置37°C CO2培养箱孵育对、他，以脂质体-DNA 质粒复合物的转染效率作为对照。
权利要求
1.一种阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体，其特征是它是一种用胺类化合物修饰的桑叶多糖结合DNA质粒的基因载体，桑叶多糖的分子量分布为33. 5 X IO4 Da,其中按质量比计，阳离子化的桑叶多糖DNA质粒=0.5 100:1，质粒的粒径为50-150nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。
2.一种制备权利要求1所述的阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体的方法，其特征是它包括以下步骤步骤1.氧化桑叶多糖的制备称取0. 5 Ig精制的桑叶多糖，溶解于20m广50ml双蒸水中，加入KI04，KIO4与多糖中单糖单位的摩尔比为0. 5 5:1，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h ；反应液加入l(T20ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min ；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h ； 透析液冻干，得到氧化桑叶多糖0. 4^0. 9g ；步骤2.阳离子化的桑叶多糖的制备A.精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备称取0.广0.5g步骤1制得的氧化桑叶多糖，溶解于l(T50ml双蒸水中；称取 0. 2^1. 5g精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)；精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为 0. 5 5:1，将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh ；之后，向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，相同条件下继续反应48h ；再向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为0. 5 3:1，相同条件下继续反应Mh;将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化的桑叶多糖0. 2^0. 4g ；B.乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备取0.广0.5g步骤1制得的氧化桑叶多糖，溶解于l(T50ml双蒸水中；取乙二胺溶于 5ml的硼酸盐缓冲液(pH=9)，乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0. 5 5:1 ；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应Mh ；之后，向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，相同条件下继续反应48h ； 再向反应液中加入0. Γ0. 5g硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为 0. 5 3:1，相同条件下继续反应Mh ；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h ；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖0. 2^0. 4g ；C.聚乙烯亚胺修饰的阳离子化的桑叶多糖的制备称取0. 2^0. 5g精制的桑叶多糖，溶于l(Tl5ml磷酸盐缓冲液(pH=7)；将活化羟基的连接剂，如N，N’ -羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N，N’ - 二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5ml 二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为0. 5 3:1，在氮气的保护下， 首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在3(Tl00min内加完，加完之后，室温反应9(Tl50min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺溶于IOml磷酸盐缓冲液中，多糖与聚乙烯亚胺的质量比为0. 5 4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖液中，边加边搅拌，在12(Tl50min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析、冻干之后，得到聚乙烯亚胺修饰的阳离子化的桑叶多糖；步骤3.阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体的制备分别称取l(T40mg上述三种阳离子化的桑叶多糖溶解于0. 5^2ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液；各取阳离子多糖储备液50 μ 1，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；分别取10μ 1 阳离子多糖应用液和10 μ 1含0.广3 μ g DNA质粒溶液，分别在55°C加热3(T60min ；再将二者混合，涡旋30s，即得到胺类化合物修饰的阳离子化的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因载体。
全文摘要
一种阳离子化的桑叶多糖纳米粒基因载体，它是一种用胺类化合物修饰的桑叶多糖结合DNA质粒的基因载体，桑叶多糖的分子量分布为3~3.5×104Da，其中按质量比计，阳离子化的桑叶多糖:DNA质粒=0.5~100:1，质粒的粒径为50-150nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。本发明的三种阳离子化的桑叶多糖均有良好的DNA质粒结合作用，成为一种生物可降解、高效低毒的新型非病毒基因载体材料。并且它们制备工艺简单，价格低廉。本发明公开了其制法。
文档编号B82Y5/00GK102154349SQ20101061348
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者余江南, 徐希明, 曹霞, 王淼, 邓纹纹 申请人:江苏大学