专利名称：一种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种功能型纳米复合材料的制备方法，特别涉及一种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法。
背景技术：
纳米金一般是指氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下聚合成的一定大小的金颗粒,这些颗粒由于静电作用成为稳定的胶体状态，故又称为胶体金。纳米金除具有一般纳米粒子的表面效应、量子尺寸效应外，同时还具有良好的生物相容性。由于生物大分子和功能化的纳米金粒子同处于纳米维度，当在相应的生物体系中加入功能化的纳米金颗粒时，其具有定向吸附效应以及富集效应等。两者通过化学或物理吸附可制得既稳定又具有一定计量关系的生物/纳米复合材料。纳米金具有高电子密度的特性，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些颗粒大量聚集时，肉眼可见红色或者粉红色斑点，因而与生物大分子(如蛋白质)结合而功能化了的纳米金复合材料可用于定性或半定量的快速检测方法中。人们对于生物大分子功能化的纳米金的应用研究已经持续了很多年，取得了重大的成果，如将纳米金应用于显微镜示踪，流式细胞仪，免疫印记技术，生物传感器，生物芯片，农兽药残留的快速检测，致病微生物检测等等，因此纳米金标记技术(NanogoldLabelling Techique)被誉为现代四大标记技术之一,在生物医学、分子生物学等生物标记分析领域中具有广泛而重要的应用。纳米金与生物分子结合的机理一般被认为是纳米金表面所带负电荷与蛋白质的正电荷基团，因静电吸附而形成非共价吸附。这种吸附与溶液的PH值和盐度密切相关，改变溶液的这些性质，容易导致胶体金颗粒的聚集或者生物分子的脱落。因此，寻找一种简单实用的方法来合成稳定的功能化纳米金-生物大分子复合材料，是目前正在增加的市场需求，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料制备方法。本发明方法中，蛋白质与纳米金的结合采用羧基与蛋白质上的胺基进行交联反应，产生牢固的共价键，从而克服了传统方法中纳米金稳定性受溶液介质影响较大的缺点，是一种更加可靠的功能化纳米金的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案:—种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，包括:(I)巯基^^一酸根(MUA) 保护的纳米金的制备；(2)将步骤(I)获得的巯基十一酸根保护的纳米金与内切酶连接制备所述具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料；其中，步骤(I)具体包括如下步骤:
(1-1)将纳米金胶体用氮气吹扫脱气10-60秒；(1-2)将脱气后的纳米金胶体分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，稳定至少20分钟，然后加入巯基十一酸水溶液，常温下静置2-4小时，获得混合液；其中，纳米金胶体与巯基i^一酸的摩尔比为1: (100-200);(1-3)将步骤(1-2)获得的混合液离心分离，去除上层清液后，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散；(1-4)重复步骤(1-3)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含巯基十一酸，将离心收集到的巯基i^一酸根保护的纳米金分散于磷酸缓冲溶液中备用；步骤(2)具体包括如下步骤:(2-1)将步骤(I)中获得的巯基i^一酸根保护的纳米金的磷酸缓冲溶液与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及内切酶加入到2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，常温静置反应2-4小时，获得混合液；(2-2)将步骤(2-1)获得的混合液离心分离，去除上层清液后，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散；(2-3)重复步骤(2-2)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含EDAC、NHS、MES以及内切酶；(2-4)离心分离，收集具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，将获得的具有酶催化性能的纳米金-蛋 白质复合材料分散于磷酸缓冲溶液中即可。进一步的，步骤(1-2)中，分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中的纳米金胶体的浓度为 4_5nmol/L。进一步的，步骤(1-2)中磷酸缓冲溶液需要加入含有吐温20，含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，吐温20浓度为0.1-lmg/mL。进一步的，步骤(1-2)中加入巯基十一酸水溶液中巯基十一酸的浓度为
1-1 Ommol /T,n进一步的，步骤(1-4)中，分散于磷酸缓冲溶液中的巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为4_5nmol/L。进一步的，步骤(2-1)混合液中所加入的EDAC和NHS的摩尔比为1: (1_5);步骤(2-1)中需用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液，其溶剂为超纯水(电阻率为18m Q *cm);步骤(2-1)混合液中的2-(N-吗啉代)乙磺酸MES的浓度为5-20mmol/L。MES的存在有助于联接反应过程中酶的稳定性，在反应结束后，用离心方法去除即可。进一步的，步骤(2-1)混合液中，巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为2_3nmol/L,内切酶的浓度为1000-5000U/mL。进一步的，步骤(2-4)中，分散于磷酸缓冲溶液中的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的浓度4-5nmol/L。进一步的，步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)、(2-2)和(2_4)中所用缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，其溶质浓度为5-20mmol/L。进一步的，上述的内切酶为限制性内切酶，选自EcoRI核酸内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、EcoRV内切酶、SmaI内切酶、BamHI内切酶、HhaI内切酶、XcmI内切酶和BbvCI内切酶。上述内切酶都可直接购于市场。
本发明与现有技术相比，具有如下特点:本发明具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法不涉及对酶的复杂化学修饰，不影响其活性；且反应在室温进行，条件温和，避免了很多复杂的化学反应及纯化过程。最终获得的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料成品不容易受到溶液介质的影响，其酶蛋白上的胺基与巯基十一酸根保护的纳米金上的羧基进行交联反应，产生了牢固的共价键，具有很好的稳定性。
图1为本发明制备具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的合成路线示意图；图2为本发明的纳米金胶体、巯基十一酸根(MUA)保护的纳米金和纳米金-蛋白质复合材料的紫外可见吸收光谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。本发明的纳米金可以通过本领域技术人员公知的工艺进行制备，例如K.C.Grabar, R.G.Freeman, M.B.Hommer, M.J.Natan, Anal.Chem.1995，67，735.，该文献中具体报道了柠檬酸钠还原氯金酸制备直径为10纳米左右的纳米金的反应。本发明所用的缓冲溶液、巯基十一酸、1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺购于西格玛 奥利奇(Sigma Aldrich)公司，核酸内切酶都购于 New England Biolabs Inc0实施例1具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的制备，其制备路线如图1所示。1、制备纳米金胶体:(l)50mL氯金酸溶液(lmmol/L)加热至沸腾。⑵5mL新鲜制备的柠檬酸钠溶液(柠檬酸钠浓度为lwt% )迅速加入到氯金酸溶液中，等溶液颜色变为红色，继续回流溶液20分钟获得纳米金胶体，纳米金的直径约为10纳米。2、制备巯基十一酸根(MUA)保护的纳米金:(2-1)将步骤(I)获得的纳米金胶体用氮气吹扫脱气30秒。(2-2)取450 ii L脱气后的纳米金胶体分散于450 U L的含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，稳定至少20分钟，然后加入巯基十一酸溶液IOOy L，常温下静置4小时，获得混合液；其中，含有吐温20的磷酸缓冲溶液中吐温20的浓度为0.5mg/mL，磷酸缓冲溶液中的溶质浓度为IOmM ;巯基^ 酸溶液中巯基i 酸的浓度为5mM。(2-3)将步骤(2-2)获得的混合液离心(16000rpm)，去除上层清夜后，将沉淀溶解于IOmM的磷酸缓冲溶液中，超声分散。 (2-4)重复步骤(2-3)的离心、去清、重悬过程，直至上层清夜中不含巯基十一酸，将离心收集到的巯基i^一酸根保护的纳米金分散于ImL的磷酸缓冲溶液(IOmM)中备用。3、制备具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料:(3-1)将500 ii L步骤⑵中获得的巯基i^一酸根保护的纳米金与100 ii L的2- (N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液(MES缓冲溶液中MES浓度为0.1M，pH = 5.3)、5 y L的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC，0.1M)，IOii L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.lM)、50iiL的EcoRI核酸内切酶(100000U/mL)以及335 y L超纯水(其电阻率为ISmQ cm)混合，常温下静置反应2小时，获得混合液。(3-2)将步骤(2-1)获得的混合液离心分离，去除上层清夜，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散；(3-3)重复步骤(3-2)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含EDAC、NHS、MES以及酶。(3-4)离心分离，收集具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，将收集到的具有酶催化性能的纳米金- 蛋白质复合材料分散于500 u L磷酸缓冲溶液(10mM，pH = 7)中即可。本实施例获得的纳米金胶体、巯基1--酸根(MUA)保护的纳米金和纳米金-EcoRI
核酸内切酶复合材料的紫外可见吸收光谱如图2所示。从图2可知修饰EcoRI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料经入DNA鉴定，其EcoRI核酸内切酶活性未受到影响。实施例2具有酶催化性能的纳米金-Nt.AlwI切刻内切酶复合材料的制备，除酶为Nt.AlwI内切酶外，其他步骤与实施例1相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基1--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-Nt.AlwI
切刻内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰Nt.AlwI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-Nt.AlwI切刻内切酶复合材料经超螺旋pUCIOIDNA(dam-/dcm-)鉴定，其Nt.AlwI切刻内切酶活性未受到影响。实施例3具有酶催化性能的纳米金-EcoRV限制性内切酶复合材料的制备，除酶为EcoRV内切酶外，其他步骤与实施例1相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-EcoRV限
制性内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰EcoRV后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-EcoRV限制性内切酶复合材料经入DNA鉴定，其EcoRV限制性内切酶活性未受到影响。实施例4
具有酶催化性能的纳米金-SmaI限制性内切酶复合材料的制备，除酶为SmaI内切酶外，其他步骤与实施例1相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-SmaI限
制性内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰SmaI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-SmaI限制性内切酶复合材料经\ DNA (Hindi 11消化)鉴定，其SmaI限制性内切酶活性未受到影响。实施例5具有酶催化性能的纳米金-BamHI限制性内切酶复合材料的制备，除酶为BamHI内切酶外，其他步骤与实施例1相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-BamHI限
制性内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰BamHI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-BamHI限制性内切酶复合材料经入DNA鉴定，其BamHI限制性内切酶活性未受到影响。实施例6具有酶催化性能的纳米金-HhaI限制性内切酶复合材料的制备，除酶为HhaI内切酶外，其他步骤与实施例1 相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-HhaI限
制性内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰HhaI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-HhaI限制性内切酶复合材料经入DNA鉴定，其HhaI限制性内切酶活性未受到影响。实施例7具有酶催化性能的纳米金-XcmI限制性内切酶复合材料的制备，除酶为XcmI内切酶外，其他步骤与实施例1相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基1--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-XcmI限
制性内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰XcmI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-XcmI限制性内切酶复合材料经入DNA鉴定，其XcmI限制性内切酶活性未受到影响。实施例8具有酶催化性能的纳米金-BbvCI限制性内切酶复合材料的制备，除酶为BbvCI内切酶外，其他步骤与实施例1相同。本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根MUA保护的纳米金和纳米金-BbvCI限制性内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱图，从该图谱中可知修饰BbvCI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-BbvCI限制性内切酶复合材料经入DNA鉴定，其BbvCI限制性内切酶活性未受到影响。实施例9具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的制备:1、制备纳米金胶体，其制备方法与实施例1相同:2、制备巯基i^一酸根(MUA)保护的纳米金:(2-1)将步骤⑴获得的纳米金胶体用氮气吹扫脱气60秒。(2-2)将脱气后的纳米金胶体分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中的纳米金胶体的浓度为5nmol/L，稳定至少20分钟，然后加入巯基i^一酸水溶液，其中纳米金胶体与巯基i^一酸的摩尔比为1: 150,常温下静置3小时,获得混合液；其中，含有吐温20的磷酸缓冲溶液中吐温20的浓度为lmg/mL，磷酸缓冲溶液中的溶质浓度为IOmM ;巯基^ 酸溶液中巯基i 酸的浓度为8mM。(2-3)将步骤(2-2)获得的混合液离心(16000rpm)，去除上层清夜后，将沉淀溶解于IOmM的磷酸缓冲溶液中，超声分散。(2-4)重复步骤(2-3)的离心、去清、重悬过程，直至上层清夜中不含巯基十一酸，将离心收集到的巯基i^一酸根保护的纳米金分散于的磷酸缓冲溶液(其溶质浓度IOmM)中备用，分散于磷酸缓冲溶液中的巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为4nmmol/L。3、制备具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料:(3-1)将步骤⑵中获得的巯基i^一酸根保护的纳米金与MES、EDAC、NHS、EcoRI核酸内切酶(100000U/mL)以及超纯水(其电阻率为18mQ -cm))混合，常温下静置反应3小时，获得混合液；其中混合液中，MES的摩尔浓度为5mmol/L，EDAC和NHS的摩尔比为1: 5，巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为2nmol/L，EcoRI核酸内切酶的浓度为1000U/mL。(3-2)将步骤(2-1)获得的混合液离心分离，去除上层清夜，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散；(3-3)重复步骤(3-2)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含EDAC、NHS、MES以及酶。(3-4)离心分离，收集具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，将收集到的具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料分散于磷酸缓冲溶液(10mM，pH = 7)中即可，分散于磷酸缓冲溶液中的具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的浓度为4nmmol/L。本实施例获得的纳 米金胶体、巯基^--酸根(MUA)保护的纳米金和纳米金-EcoRI
核酸内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱。从紫外可见吸收光谱中可知修饰EcoRI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的活性未受到影响。本实施例的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料经入DNA鉴定，其EcoRI核酸内切酶活性未受到影响。
实施例10具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的制备:1、制备纳米金胶体，其制备方法与实施例1相同:2、制备巯基i^一酸根(MUA)保护的纳米金:(2-1)将步骤(I)获得的纳米金胶体用氮气吹扫脱气10秒。(2-2)将脱气后的纳米金胶体分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中的纳米金胶体的浓度为10nmol/L，稳定至少20分钟，然后加入巯基i^一酸水溶液，其中纳米金胶体与巯基i^一酸的摩尔比为1: 200,常温下静置2小时,获得混合液；其中，含有吐温20的磷酸缓冲溶液中吐温20的浓度为0.8mg/mL，磷酸缓冲溶液中的溶质浓度为IOmM ;巯基^ 酸溶液中巯基i 酸的浓度为ImM。(2-3)将步骤( 2-2)获得的混合液离心(16000rpm)，去除上层清夜后，将沉淀溶解于IOmM的磷酸缓冲溶液中，超声分散。(2-4)重复步骤(2-3)的离心、去清、重悬过程，直至上层清夜中不含巯基十一酸，将离心收集到的巯基i^一酸根保护的纳米金分散于的磷酸缓冲溶液(其溶质浓度IOmM)中备用，分散于磷酸缓冲溶液中的巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为5nmmol/L。3、制备具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料:(3-1)将步骤⑵中获得的巯基i^一酸根保护的纳米金与MES、EDAC, NHS、EcoRI核酸内切酶(100000U/mL)以及超纯水(其电阻率为18mQ -cm)混合，常温下静置反应4小时，获得混合液；其中混合液中，MES的摩尔浓度为20mmol/L，EDAC和NHS的摩尔比为1: 1，巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为3nmol/L，EcoRI核酸内切酶的浓度为2500U/mL。(3-2)将步骤(2-1)获得的混合液离心分离，去除上层清夜，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散；(3-3)重复步骤(3-2)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含EDAC、NHS、MES以及酶。(3-4)离心分离，收集具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，将收集到的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料分散于磷酸缓冲溶液(10mM，pH = 7)中即可，分散于磷酸缓冲溶液中的具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的浓度为Snmmo I /L本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根(MUA)保护的纳米金和纳米金-EcoRI
核酸内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱。从紫外可见吸收光谱中可知修饰EcoRI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的活性未受到影响。本实施例的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料经入DNA鉴定，其EcoRI核酸内切酶活性未受到影响。实施例11具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的制备:1、制备纳米金胶体，其制备方法与实施例1相同:2、制备巯基十一酸根(MUA)保护的纳米金:(2-1)将步骤(I)获得的纳米金胶体用氮气吹扫脱气40秒。
(2-2)将脱气后的纳米金胶体分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中的纳米金胶体的浓度为8nmol/L，稳定至少20分钟，然后加入巯基i^一酸水溶液，其中纳米金胶体与巯基i^一酸的摩尔比为1: 100,常温下静置4小时,获得混合液；其中，含有吐温20的磷酸缓冲溶液中吐温20的浓度为0.lmg/mL，磷酸缓冲溶液中的溶质浓度为IOmM ;巯基^ 酸溶液中巯基i 酸的浓度为10mM。(2-3)将步骤(2-2)获得的混合液离心(16000rpm)，去除上层清夜后，将沉淀溶解于IOmM的磷酸缓冲溶液中，超声分散。(2-4)重复步骤(2-3)的离心、去清、重悬过程，直至上层清夜中不含巯基十一酸，将离心收集到的巯基十一酸根保护的纳米金分散于的磷酸缓冲溶液(其溶质浓度IOmM)中备用，分散于磷酸缓冲溶液中的巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为4.5nmmol/L。3、制备具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料:(3-1)将步骤⑵中获得的巯基i^一酸根保护的纳米金与MES、EDAC, NHS、EcoRI核酸内切酶(100000U/mL)以及超纯水(其电阻率为18mQ -cm)混合，常温下静置反应2小时，获得混合液；其中混合液中，MES的摩尔浓度为10mmol/L，EDAC和NHS的摩尔比为1: 3，巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为2.5nmol/L, EcoRI核酸内切酶的浓度为5000U/mL。(3-2)将步骤(2-1)获得的混合液离心分离，去除上层清夜，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散；(3-3)重复步骤(3-2)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含EDAC、NHS、MES以及酶。(3-4)离心分离，收集具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，将收集到的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料分散于磷酸缓冲溶液(10mM，pH = 7)中即可，分散于磷酸缓冲溶液中的具有酶催化性能的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料的浓度为
4.Snmmo I /L本实施例获得的纳米金胶体、巯基^--酸根(MUA)保护的纳米金和纳米金-EcoRI
核酸内切酶复合材料经检测获得紫外可见吸收光谱。从紫外可见吸收光谱中可知修饰EcoRI后的纳米金胶体复合材料在紫外可见吸收光谱中无明显的等离子峰位移，说明胶体金的性质未受到影响。本实施例的纳米金-EcoRI核酸内切酶复合材料经入DNA鉴定，其EcoRI核酸内切酶活性未受到影响。
权利要求
1.一种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，包括: (1)疏基十一Ife根保护的纳米金的制备； (2)将步骤(I)获得的巯基十一酸根保护的纳米金与内切酶连接制备所述具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料； 其中，步骤(I)具体包括如下步骤: (1-1)将纳米金胶体用氮气吹扫脱气10-60秒； (1-2)将脱气后的纳米金胶体分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，稳定至少20分钟，然后加入巯基十一酸水溶液，常温下静置2-4小时，获得混合液；其中，纳米金胶体与巯基i^一酸的摩尔比为1: (100-200); (1-3)将步骤(1-2)获得的混合液离心分离，去除上层清液后，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散； (1-4)重复步骤(1-3)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含巯基十一酸，将离心收集到的巯基i^ 一酸根保护的纳米金分散于磷酸缓冲溶液中备用； 步骤(2)具体包括如下步骤: (2-1)将步骤(I)中获得的巯基十一酸根保护的纳米金的磷酸缓冲溶液与1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐EDAC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS以及内切酶加入到2- (N-吗啉代)乙磺酸MES缓冲溶液中，常温静置反应2-4小时，获得混合液； (2-2)将步骤(2-1)获得的混合液离心分离，去除上层清液后，将沉淀溶于磷酸缓冲溶液中，超声分散； (2-3)重复步骤(2-2)的离心、去清、重悬过程，直至上层清液中不含EDAC、NHS、MES以及内切酶； (2-4)离心分离，收集具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，将获得的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料分散于磷酸缓冲溶液中即可。
2.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1-2)中，分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中的纳米金胶体的浓度为5-10nmol/Lo
3.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1-2)中，含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，吐温20浓度为0.1-lmg/mL ;巯基i 酸水溶液中巯基i 酸的浓度为l-10mmol/L。
4.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1-4)中，分散于磷酸缓冲溶液中的巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为4_5nmol/L0
5.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2-1)混合液中所加入的EDAC和NHS的摩尔比为1: (1_5);步骤(2_1)混合液中2-(N-吗啉代)乙磺酸MES的浓度为5-20mmol/L。
6.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2-1)混合液中，巯基i^一酸根保护的纳米金的浓度为2-3nmol/L，内切酶的浓度为 1000-5000U/mL。
7.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2-4)中，分散于磷酸缓冲溶液中的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的浓度4-5nmol/L。
8.如权利要求1所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1-2)、(1-3)、(1-4)、(2-2)和(2-4)中所用缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，其溶质浓度为5_20mmol/L。
9.如权利要求1-8任一所述的具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，其特征在于，所述内切酶为限制性内切酶，选自EcoRI核酸内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、EcoRV内切酶、SmaI内切酶、BamHI内切酶、HhaI内切酶、XcmI内切酶和BbvCI内切酶。
10.一种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料，为根据权利要求1-9任一所述的具有酶催化性能的纳米金 -蛋白质复合材料的制备方法制得。
全文摘要
本发明提供了一种具有酶催化性能的纳米金-蛋白质复合材料的制备方法，包括先将纳米金溶胶用氮气吹扫脱气后分散于含有吐温20的磷酸缓冲溶液中，再与巯基十一酸混合，常温下静置反应；混合液离心、去清、重悬过程，直至上层清夜中不含巯基十一酸；离心收集MUA保护的纳米金并分散于磷酸缓冲溶液中备用；再将MUA保护的纳米金与EDAC、NHS、内切酶混合加入MES缓冲溶液中，常温静置反应；最后重复离心、去清、重悬过程，所得的复合材料分散于磷酸缓冲溶液中。本发明的制备方法不涉及对酶的复杂化学修饰，不影响其活性；反应在室温进行，条件温和；制备的功能化纳米金-蛋白质复合材料不容易受到溶液介质的影响，具有很好的稳定性。
文档编号B82Y5/00GK103197080SQ201310130699
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者徐玮, 陈平, 程晓丹, 李光朔, 陈明富 申请人:苏州汉能环保材料科技有限公司