专利名称：：磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物血液检测方法，特别是一种能快速通过显色来检测畜产品血浆中兽药(磺胺二甲嘧啶)残留的方法。
背景技术：
：随着农业和畜牧业的发展，饲料添加剂的使用范围及其用量不断的增加，从而提高了畜牧业的产量。特别是抗生素类饲料添加剂在改善动物生产性能方面和预防疾病的效果是其它任何词料添加剂都无法比拟的。然而，大量、长期在词料中使用兽药不可避免地造成兽药在畜产品中的残留。畜产品中兽药残留不仅危害人类健康，同时也影响畜产品品质，造成经济损失。动物性食品中抗生素残留问题是当今最为关注的一个现实问题，已引起人们高度的重视。磺胺二甲嘧啶属于我国现在允许使用的兽药范围内，己建立了国家标准检测方法，但在快速现场残留检测还存在着空缺，详见下表。几种常用检测方法的比较表类型特点应用情况微生物检测法薄层色谱法气相色谱法高效液相色谱法联用技术酶联免疫吸附法不易筛选到特别敏感的菌株，常受到其它敏感菌株的影响操作简单，灵敏度不高，可定性或半-需对样品衍生处理高效、灵敏度高，检出率高，但设备昂贵，对实验技术人员有较高的要求，但分析费时能确证结构，但专属性强，成本也高前处理简便，可同时分析多个样品，分析时间短，且敏感度高，还能减少环境的污染。目前免疫试剂合昂贵、对实验技术人员有较高的要求。检测限往往高于药物的MRLs，且缺乏特异性和敏感性应用较少，因需进行复杂的前处理较少用于兽药残留分析是目前应用最普遍、最有效的分析方法，最低检测限可以达到0.5-0.2ng之间应用越来越广泛，检测限可达到ng级目前几乎所有重要的兽药已建立或试图建立ELISA，检测限可以达到ng级，适亍火量样品的筛选这就在客观上要求改进传统的检测方法，寻求一种快速、精确的检测方法，使得检测结果更加准确、可靠。
发明内容本发明提供一种磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法，利用磺胺二甲嘧徒的特殊结构，与某些物质发生显色反应，根据颜色深浅判断其残留量大小，具有检测快速、精确、可靠的特点。一种磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法，建立了磺胺二甲嘧啶的化学重氮-偶合反应，血浆中不同残留浓度的磺胺二甲嘧啶经过反应后，呈现不同的颜色，借助分光光度计，就能得出血浆中磺胺二甲嘧啶残留的浓度，实现了磺胺二甲嘧啶残留的活体检测。磺胺二甲嘧啶为白色或微黄色粉末，无臭，基本无味，易溶于盐酸，碱溶液，溶于热乙醇，不溶于水和乙醚。其分子结构为从磺胺二甲嘧啶结构图中，可以看出，氨基是一个活泼的基团，在进行显色反应时首先要考虑从氨基的特殊性入手，偶氮化合物一般都有颜色。该反应能生成猩红色的重氮-偶合产物，磺胺二甲嘧啶与盐酸萘乙二胺在酸性条件下能生成有色的重氮-偶合产物具体如下:(猩红色偶氮化合物)其中，亚硝酸钠与血浆的配比应在0.05mg/m1-0.3mg/ml范围内。形成的偶合产物于紫外-可见分光光度计进行可见光波段的全扫描，在可见光区域，所形成的偶合物有特征吸收峰，其最大检测波长为545nm。反应所需的酸性条件的pH值范围为2.0-2.5。本发明的效果检测(1)回收率的测定取5.Oml血浆于50ml离心管中，分别加入IOW、50W、10(^1浓度为100Pg/ml、的标准工作液，使血浆中的磺胺二甲嘧啶浓度为1.0Pg/ml、5Pg/ml、10!ig/ml三个添加水平，每个水平设三个重复，按照1.3确定的前处理方法，其回收率和变异系数见下表。表试样的加标回收率及变异系数<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可知，在1.0Pg/g、5.0Pg/g、10.0Pg/g三个添加水平上，血浆中磺胺二甲嘧啶的回收率范围分别为79.8%81.3%，81.6%83.1%，78.15%81.23%，平均回收率在79.0%以上，变异系数在2.0%以下。(2)最低检测限的确立取5ml血浆，添加适量的SM2标准贮备液，使浓度成为0.054g/ml、0.ll^g/m〗、0.5Pg/ml、Hg/ml、5.0iVml、10.OPg/ml系列血浆浓度，按照1.3确定方法进行处理，测定结果显示，血浆中的药物浓度与所生成的颜色呈正比，3浓度大于1.(Hig/ml时，直接用肉眼就能识别，当其浓度小于l.(￥g/ml时，可以选用721分光光度计，此时的检测浓度可以达到0.l化/ml。四图l是本发明的标准工作曲线——浓度吸光度值关系图五具体实施例方式一种磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法，建立磺胺二甲嘧啶的化学重氮-偶合反应，血浆中不同残留浓度的磺胺二甲嘧啶经过反应后，呈现不同的颜色，借助分光光度计，就能得出血桨中磺胺二甲嘧啶残留的浓度，实现了磺胺二甲嘧啶残留的活体检测。该反应能生成猩红色的重氮-偶合产物，磺胺二甲嘧啶与盐酸萘乙二胺在pH值为2的酸性条件下能生成有色的重氮-偶合产物(猩红色偶氮化合物)其中，亚硝酸钠与血浆的配比是O.lmg/ml。形成的偶合产物于紫外-可见分光光度计进行可见光波段的全扫描，在可见光区域，所形成的偶合物有特征吸收峰，其最大检测波长为545nm。(1)仪器电子天平(AG245，PB303,PB5001)，瑞士梅特勒公司，感应量0.Olmg;721分光光度计；离心机(RC25C，RC3C)，美国杜邦公司。(2)溶液的配制标准储备溶液准确称取10mg磺胺二甲嘧啶标准品，用水定容于10ml的容量瓶中，使之浓度为lmg/m]的标准，并贮藏于4。C以下的冰箱中。5()%三氯乙酸准确称取5()g三氯乙酸，溶解于50ml的水中，使之浓度成为50%的溶液。0.5%亚硝酸钠准确称取0.5g亚硝酸钠，用水定容于1000ml的容量瓶中，使之浓度为O.5%的溶液。2g/L盐酸萘乙二胺准确称取2g盐酸萘乙二胺，用水定容于1000ml的容量瓶中，使之浓度为2g/ml的溶液。(3)血浆样品的处理方法5ml血浆中加入lml三氯乙酸，400()r/min离心lOm.iri，过滤，再用2m]水进行淋洗，加入的亚硝酸钠，静置5min，加入lml的盐酸萘乙二胺。(4)标准工作曲线的制备在6个试管中分别加入5ml血浆，在6个试管中分别添加浓度为lmg/ml的磺胺二甲嘧啶标准储备液014、25^1、5(M、7514、IOOW，使血浆中的磺胺二甲嘧啶为OPg/ml、5Pg/m]、醇g/ml、歸g/ml、20Pg/ml。以浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标，绘制标准工作曲线——浓度吸光度值关系图。(5)血浆样品的检测5ml血浆中加入lml三氯乙酸，4000r/min离心10min，过滤，再用2ml水进行淋洗，加入1()W的亚硝酸钠，静置5min，加入.l.ml的盐酸萘乙二胺。直接用分光光度计于545nm下测定其吸光度值，根据所制备的标准工作曲线，就可以得出血浆中磺胺二甲嘧啶的残留量。磺胺二甲嘧啶的重氮偶合反应简便、快速，能够适用于血浆的现场快速筛选，整个处理过程只需1520min即可完成，该方法即使采用较简易的7^1分光光度计，吸光度值和残留浓度之间的线性关系良好，其相关系数能达到().98以上。在l.O、5.0、10.0化/g三个添加水平上，血浆中磺胺二甲嘧啶的回收率范围分别为79.8%81.3%，81.6%83.1%，78.15%81.23%，平均回收率在79.0%以上，变异系数在2.0%以下。权利要求1、一种磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法，其特征在于建立磺胺二甲嘧啶的化学重氮-偶合反应，血浆中不同残留浓度的磺胺二甲嘧啶经过反应后，呈现不同的颜色，借助分光光度计，就能得出血浆中磺胺二甲嘧啶残留的浓度，实现了磺胺二甲嘧啶残留的活体检测。该反应能生成猩红色的重氮-偶合产物，磺胺二甲嘧啶与盐酸萘乙二胺在酸性条件下能生成有色的重氮-偶合产物(猩红色偶氮化合物)其中，亚硝酸钠与血浆的配比应在0.05mg/ml-0.3mg/ml范围内。形成的偶合产物于紫外-可见分光光度计进行可见光波段的全扫描，在可见光区域，所形成的偶合物有特征吸收峰，其最大检测波长为545nm。2、根据权利要求l所述的磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法，其特征在于反应所需的酸性条件的pH值范围为2.0-2.5。全文摘要本发明提供了一种血浆磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法，该利用磺胺二甲嘧啶的特殊结构，与盐酸萘乙二胺在酸性条件下发生显色反应，生成有色的重氮-偶合产物，见上图，根据反应生成颜色的深浅，借助分光光度计就可得出血浆中磺胺二甲嘧啶的残留量。整个处理过程只需15～20min即可完成，方法的平均回收率能达到78％以上，该检测方法快速、精确、可靠，能够适用于血浆的现场快速筛选。文档编号G01N21/78GK101430325SQ20071006634公开日2009年5月13日申请日期2007年11月5日优先权日2007年11月5日发明者勇刘,曦张,杨秀娟,葛长荣,陶琳丽申请人:云南农业大学