刺激生物源甲烷从含烃地层中生成的方法

专利名称：刺激生物源甲烷从含烃地层中生成的方法
刺激生物源甲烷从含烃地层中生成的方法
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发明背景
本发明总的来说涉及来自含烃地层(诸如煤层)的本土的产甲烷微生物及其限定 的聚集体的分子表征；并且更具体地涉及来自这样的微生物的环境基因组数据的分析， 以及使用刺激剂来提高甲烷的转化和回收的这样的数据和微生物的用途，所述刺激剂是 通过确定在烃到甲烷的转化涉及的途径中的酶的存在而鉴定的。
煤层气(CBM)是在煤藏中通过生物或生热产生的天然气的来源。CBM的生物 源生成是在多种微生物种群中微生物新陈代谢和用随后的电子流降解煤的结果。CBM的 热源生成是当温度升至产生甲烷的微生物能够存活的水平以上时后来在煤化中发生的沉 积的有机物或油的热裂解的结果。在煤床中，来自上覆岩石和周围水的压力促使CBM结 合到煤的表面并被吸收进入煤的固体基质中，作为微孔和割理(煤中的天然裂隙)中的游 离气体，作为在水中溶解的气体，作为在煤中的煤显微成分(maceral)(包含煤块的有机 成分)、微孔和割理表面上由分子引力维持的吸附气体，并且作为煤的分子结构内的吸附 气体。
煤是具有不同程度的渗透性的沉积岩，具有主要存在于割理中的甲烷。在煤中 的这些裂隙充当允许CBM流动的主要通道。为开采CBM，将外包钢孔钻入煤层，由于 通向表面的孔而使压力下降或使小量的水从煤床泵出(排水)。CBM在水中具有非常低 的溶解度并且当压力下降时容易分离，允许CBM从水中分离以管道输出井。之后CBM 被输送至压缩站并进入天然气管道。
CBM代表在美国产生的天然气的重要部分，估计提供约10%的天然气供给或约 1.8万亿立方英尺(TCF)。国际储量提供用于未来的CBM生产的巨大的机会。位于科 罗拉多州和新墨西哥州的圣胡安煤田Man Juan Basin)是最多产的地区之一。基于这些巨 大的CBM储藏库，在CBM回收上最小的改进能够因此导致矿井的生产显著增加，并且 因此，正在研制各种方法以提高CBM从煤层中回收。
纯物理的介入可以包括优化钻孔方法和压裂方法。其他改进方法包括直接应 用外部因素到煤床上。这些外部因素包括，例如注射气体，诸如氮气(见，例如 Shimizu, S., Akiyama, M., Naganuma, T., Fujioka, M., Nako, M.禾口 Ishijima， Y.2007.Molecular characterization of microbial communities in deep coal seam groundwater of northern Japan (在日本北部的深煤层的地下水中微生物群落的分子表征).Geobiology 5(4) 423-433 ；美国专利第4,883,122号)和CO2 (见，例如美国专利第5,402,847号)； 以及注射热的流体，诸如水或蒸汽(见，例如美国专利第5,072,990号)。多种方法旨在物 理地(见，例如美国专利第5,014,788号)或化学地(见，例如美国专利第5,865,248号) 增加煤床层的渗透性。
最近，正研制改进的方法以提高从现存矿井中生物源甲烷的生成。美国专利第5,424,195号公开了使用原位或在含煤基质上培养的微生物的聚生体以生物学方法将 煤转化成甲烷。PCT/GB2006/004443 (W02007/060473)公开了生成和使用地下微生 物的培养物的方法。PCT/US2006/039352(W02008/041990)公开了通过引入注射流体 刺激生物源生成的方法和系统，所述注射流体通过本土微生物促进非液态烃层的厌氧生 物降解。PCT/US2007/080161(W02008/042888)公开了包含原位加热非液态烃层以允 许甲烷的生物源生成的方法。美国专利第7,426,960号公开了刺激具有提高的氢含量的 代谢产物生物源生成的方法，包含将水注入开口中以分散其中的微生物聚生体。美国 专利第6^43,535号公开了通过使用由分析地层的成分获得的信息并表征聚生体的微生 物来刺激在含烃的地下地层中的微生物聚生体活性以将烃转化成甲烷的工艺。虽然美 国专利第6,M3,535号考虑比较分离的微生物与已知的微生物以建立相对于这些已知生 物体的系统发生身份，但该专利没有公开来自聚生体中产甲烷细菌的编码将煤生物转化 成甲烷涉及的酶的特定基因的鉴定或使用，或鉴定新颖刺激剂的酶分析的使用。美国 专利申请公开号2008/(^89816公开了用于在厌氧环境下将微生物引入至含碳物质的工 艺和用于增加生物源烃的生成的工艺，包括改良的地层水的使用。美国专利申请公开 号2008/(^99635公开了用产甲烷聚生体从含碳物质中刺激甲烷生成的方法。美国专利 申请公开号2009/0023612公开了增加燃料气体从含碳物质中生物源生成的方法，包括 使用包括假单胞菌属(Pseudomonas)的物种在内的厌氧聚生体。美国专利申请公开号 2009/0023611公开了用于从复合烃中生物源生成甲烷的分离的微生物聚生体，包含热袍 菌属(Thermotoga)的物种。美国专利申请公开号2008/(^86855公开了增加具有提高的氢 含量的物质生成的方法，该方法包括引入包括分离的棕色热气单胞菌ahermacetogenium phaeum)培养物在内的聚生体。美国专利第7,416,879号公开了刺激地质层中棕色热 气单胞菌的生物学活性的方法，该方法包括将改良剂加至地层。美国专利申请公开号 2008/0182318公开了用于生物源甲烷生成的分离的微生物聚生体，包括脱硫单胞菌属 (Desulforomonas)的物种。美国专利申请公开号2007/(^95505公开了刺激在包括含碳物 质的地质层中具有提高的氢含量的代谢产物的生物源生成的方法，该方法包括提供含磷 化合物给其中的微生物。美国专利申请公开号2007/(^61843公开了刺激在包括含碳物质 的地质层中具有提高的氢含量的代谢产物的生物源生成的方法，该方法包括提供氢和含 磷化合物给其中的微生物。PCT/US2006/031723(W02007/022122)公开了用于提高生物 源甲烷生成的系统，该系统包括改良CBM水和其他含微生物介质、减少硫酸盐还原反应 的竞争以及提高有机物浓度。
甲烷的生物源生成是成功分解复杂的大分子、多环、木质素来源的有机物的多 个可能的酶促途径的产物。例如，木质素降解酶可包括过氧化物酶(锰过氧化物酶、木 质素过氧化物酶等)、酚氧化酶(漆酶)、水解酶、酯酶及氧化酶(见，例如，Fakoussa， R.M.和 Hofrichter，Μ. 1999.Biotechnology and Microbiology of Coal Degradation (煤降解的 生物工艺学和微生物学).Appl.Microbiol.Biotechnol.52 25-40)。一旦发生最初的破裂， 与脱甲基化和环破裂、芳香部分和脂族部分的氧化以及随后的发酵途径和产甲烷途径有 关的酶便牵涉其中。相信在含烃地层中存在的微生物(包括产甲烷生物)是专性厌氧微 生物。
本领域中尚存在有效地刺激含烃地层(诸如煤)中的生物源生成和提高现存矿井的CBM生产率的需要。本发明不仅提供用于鉴定和使用在地层环境中存在的微生物的方 法，而且提供用于在确定与导致甲烷生成的代谢途径有关的特定基因产物的存在之后鉴 定特定介入物(诸如能够被引入所述环境中以提高甲烷的生物源生成的刺激剂)的方法。
发明简述
本发明提供了鉴定和使用在含烃地层中用于甲烷的生物源生成的刺激剂和酶的 方法和工艺。发明方法包括使用获自含烃地层中鉴定的多种微生物的核酸信息来鉴定基 因产物，所述基因产物是在所述微生物中存在的、能够在由烃源起始并导致甲烷生成的 多种途径中起作用的酶。见，例如

图1。
在第一方面，本发明提供了鉴定在含烃地层中增加甲烷的生物源生成的刺激剂 的方法，该方法包括(a)从来源于含烃地层环境的一种或多种微生物中获得核酸序列； (b)确定所述核酸序列的一种或多种基因产物的存在，其中所述基因产物是烃到甲烷的转 化涉及的途径中的酶；以及(c)鉴定当提供给所述含烃地层中的一种或多种微生物时增 加甲烷生成的所述酶的底物、反应物或辅因子。
在一个实施方案中，通过选择在作为唯一碳源的煤上生长的能力，富集来自含 烃地层的一种或多种微生物。
在另一个实施方案中，上述步骤(C)包括在体外以多于一个浓度测试一种或多种 底物、反应物或辅因子以便在包含从所述含烃地层分离的至少一种微生物的培养系统中 监测和优化甲烷的生成，此外其中所述培养系统提供煤作为唯一碳源。
在一个优选的实施方案中，至少一种微生物是能够将烃转化成选自由以下组 成的组的产物的细菌物种或古细菌物种氢、二氧化碳、乙酸盐、甲酸盐、甲醇、甲 胺和产甲烷的底物；降解烃的细菌物种；产甲烷的细菌物种或产甲烷生物的古细菌物 种。在另一优选的实施方案中，这种微生物是选自由假单胞菌属(Pseudomonas)、 弓形杆菌属(Arcotiacter)、脱硫单胞菌属(Desulftiromonas)、暗杆菌属(Pelotiacter)、 脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺旋体属(Spirochaeta)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、 索氏菌属ahauera)、梭菌属(Clostridium)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、磁螺菌 属(Magnetospirillum)和硫磺单胞菌属Mulfurospirillum)组成的属组的细菌物种； 或选自由甲烷叶菌属(Methanolobus)、甲烷卵圆形菌属(Methanocalculus)和泉古菌 (Crenarcheaota)门的成员组成的组的古细菌物种。
在一个可选的实施方案中，步骤(c)是用限定的微生物聚集体进行的，所述限定 的微生物聚集体将来自含烃地层的单菌株微生物的培养物与另一种单菌株微生物的至少 一种其他的限定的培养物相组合，以致所述限定的微生物聚集体的成员协同作用以生成 甲烷；并且此外其中所述培养系统提供煤作为唯一的碳源。优选的限定的微生物聚集体 包含选自由假单胞菌属、弓形杆菌属、脱硫单胞菌属、暗杆菌属、脱硫弧菌属、螺旋体 属、丹毒丝菌属、索氏菌属、梭菌属、无胆甾原体属、磁螺菌属、硫磺单胞菌属；甲烷 叶菌属、甲烷卵圆形菌属和泉古菌门的成员组成的属组的至少两种微生物物种。
在多种实施方案中，含烃地层选自由煤、泥煤、褐煤、油页岩、油地层、传统 的黑油、粘性油、油砂和焦油砂组成的组。在优选的实施方案中，地层是在煤层或煤床 中的煤。
在多种实施方案中，与烃到甲烷的转化有关的酶选自由过氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶(etherase)、氧化酶、固氮酶、 纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶(pullanase)、还原酶、歧化酶、加氧酶、单加 氧酶、双加氧酶、过氧化氢酶、氢化酶和羧化酶组成的组。在优选的实施方案中，酶选 自由加氧酶、单加氧酶和双加氧酶组成的组。
在多种实施方案中，底物、反应物或辅因子选自由含硫化合物、含氮化合物、 含磷化合物、微量元素、电子受体、电子供体、卤素、金属、醇、有机酸、烷、烯、 炔、芳香化合物、胺、醚、醛、酮、硫醇、乙酸盐、芳香烃和气体组成的组。在优选的 实施方案中反应物是氧气。
在第二方面，本发明提供了用于提高含烃地层中甲烷的生物源生成的方法，所 述方法包括弓I入通过第一方面的任何上述方法鉴定的刺激剂至含烃地层中。
在一个实施方案中，该工艺引入氧气至所述含烃地层中。在优选的实施方案 中，含烃地层是煤。
在第三方面，本发明提供用于提高含烃地层中甲烷的生物源生成的方法，所述 方法包括调节选自由以下组成的组的酶过氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水 解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶、氧化酶、固氮酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、普 鲁兰酶、还原酶、歧化酶、加氧酶、单加氧酶、双加氧酶、过氧化氢酶、氢化酶和羧化 酶。
在可选的实施方案中酶在含烃地层中现存的微生物中存在，或被引入至含烃地 层中。在之后的实施方案中，酶是通过引入表达所述酶的微生物至所述含烃地层中而被 引入。在一个实施方案中，被引入的表达所述酶的微生物是通过修饰来源于所述含烃地 层的微生物而制备的重组微生物。在另一个实施方案中，表达所述酶的微生物是合成的 微生物。
在第四方面，本发明提供了鉴定用于煤到甲烷的转化的限定的微生物聚集体的 方法，该方法包括(a)从来源于煤环境的一种或多种微生物中获得核酸序列；(b)鉴定 所述核酸序列的一种或多种基因产物的存在，其中所述基因产物是煤到甲烷的转化涉及 的途径中的酶；(c)制备来自所述煤环境的所述一种或多种微生物的单菌株的培养物，其 中单菌株微生物包含所述一种或多种基因产物；以及(d)将所述培养的单菌株微生物与 另一种单菌株微生物的至少一种其他的限定培养物相组合以提供限定的微生物聚集体； 其中所述限定的微生物聚集体的成员协同作用以生成甲烷。
在一个实施方案中，提供了通过上述发明方法鉴定的用于煤到甲烷转化的限定 的微生物聚集体。
在另一个实施方案中，该方法还包括(e)提供底物、反应物或辅因子给增加甲烷 生成的所述限定的微生物聚集体。
在优选的实施方案中，限定的微生物聚集体包括选自由假单胞菌属、弓形杆菌 属、脱硫单胞菌属、暗杆菌属、脱硫弧菌属、螺旋体属、丹毒丝菌属、索氏菌属、梭菌 属、无胆甾原体属、磁螺菌属、硫磺单胞菌属；甲烷叶菌属、甲烷卵圆形菌属和泉古菌 门的成员组成的属组的至少两种微生物的物种。
在第五方面，本发明提供了用于通过将由本文描述的发明方法鉴定的限定的微 生物聚集体引入至煤床中来提高从煤中生物源生成甲烷的工艺。
在优选的实施方案中，这样的工艺包括将如上鉴定的限定的微生物聚集体连同 所述底物、反应物或辅因子引入至煤床中。
附图简述
图1图示了在煤到甲烷的转化中的多种潜在的酶途径。
图2A和图2B图示了代表性的生成甲烷的富集培养物在培养10天和30天之后 的细菌分类学组成和古细菌分类学组成。
图3图示了通过来自宏基因组的RecA基因序列分析的在地层水的代表性样品中 细菌的多样性。
图4图示并比较了在地层水、生成甲烷的富集培养物和基因组被测序的两种个 别菌株的代表性样品中加氧酶的图谱。
图5图示并比较了在代表性的储库(reservoir)样品和生成甲烷的富集培养物样品 中加氧酶的图谱。
图6图示并比较了在代表性的储库样品、 品中氧化应激反应酶的图谱。
图7图示并比较了在代表性的储库样品、 品中产甲烷酶的图谱。
图8图示并比较了在代表性的储库样品、 品中酯酶的图谱。
图9图示并比较了在代表性的储库样品、 品中解糖酶(saccharaolytic enzyme)的图谱。
图10图示并比较了在代表性的储库样品、 品中氢化酶的图谱。
图11图示并比较了在代表性的储库样品、 品中氮固定蛋白的图谱。
图12图示并比较了在代表性的储库样品、 品中脱氮蛋白的图谱。
图13图示了用多种电子受体和氧气刺激之后通过限定的微生物聚集体增加的甲 烷生成。
图14图示了用氢气和乙酸盐刺激之后通过限定的微生物聚集体增加的甲烷生 成。
图15图示了用甘油或三甲胺刺激之后通过限定的微生物聚集体增加的甲烷生 成。
图16图示了用于经由再注入的地层水引入外部因素诸如酶或刺激剂以增加甲烷 生成的工艺。
发明详述
本发明提供了通过使用培养的来源于地层的微生物来刺激含烃地层(诸如煤层 和煤层气矿井)中生物源甲烷的生成的新颖方法和工艺。从存在于含烃地层中的定居微 生物种群获得的基因组信息被用以鉴定和刺激与烃到甲烷的转化有关的多种途径中涉及 的酶，该酶存在于在地层中的一种或多种微生物中或优选地与鉴定的刺激剂一起被引入生成甲烷的富集培养物样品和矿井样 生成甲烷的富集培养物样品和矿井样 生成甲烷的富集培养物样品和矿井样 生成甲烷的富集培养物样品和矿井样 生成甲烷的富集培养物样品和矿井样 生成甲烷的富集培养物样品和矿井样 生成甲烷的富集培养物样品和矿井样地层中。
本发明的方法提供分步的方法以鉴定用于增加甲烷的生物源生成的刺激剂和/ 或DMA。本文提供的实施例显示了增加甲烷生成的刺激剂的成功鉴定中的分步方法。 简言之，在本文提供的实施例中，地层水样品收集自圣胡安煤田的煤层气矿井，先前的 研究显示该煤层气矿井具有7千万年的年龄，是由与地表层分离产生的并且无地下参与 事件的证据。水可从井口、隔离池(分离罐)或储池(reservoir tank)收集，因为这些水 样品是最容易得到的物质。之后经由光学显微镜目测含有活微生物的这些水样品并且使 用地层水作为矿物基质培养微生物。微生物的培养物富含使用煤作为唯一碳源的生成甲 烷的微生物。电子受体，诸如硝酸盐、硫酸盐或铁-磷酸盐的多种组合作为用于微生物 呼吸的刺激剂被测试。之后使用气相色谱筛选微生物富集物的甲烷生成。使用系统发生 的标记物来分析培养的微生物群落组成以鉴定优势的微生物群，并且将若干微生物独立 培养成纯培养物(解褶合)以研究它们的酶谱、新陈代谢和降解煤的能力。群落可以用 合理的方式(重组)重建和建造以优化从煤生成甲烷，从而产生设计的复合微生物生态系 统或限定的微生物聚集体(DMA)。
在由于增加甲烷从煤中的生物源生成而作为刺激剂的氧气的鉴定中能够看到 本发明的方法的力量。通过在样品的基因组分析中鉴定大量的加氧酶、单加氧酶和双 加氧酶的存在，氧气被鉴定为刺激剂。由于微生物来源于厌氧环境，所以这些酶的鉴 定是未预期的。细菌的芳香烃双加氧酶是多组分酶系统，其通过甲苯双加氧酶添加双 氧至芳基核(aromatic nucleus)以形成芳烃顺式二醇，用于将苯氧化成顺_1，2-二羟环 己-3，5-二烯(苯顺式二醇)(Gibson，D.T., Cardini, G.E., Maseles, F.C., Kallio, R.E.Incorporation of oxygen-18 into benzene by Pseudomonas putida (氧气-18 通过恶臭假单 胞菌掺入苯).Biochemistry. 1970.9 : 1631-1635)。在基因组分析、生成甲烷的富集物以及 分离的假单胞菌属菌株中检测的其他类型的加氧酶与儿茶酚2，3-双加氧酶有关。儿茶 酚双加氧酶是执行儿茶酚的氧化裂解的金属蛋白酶。这类酶将双氧掺入底物。儿茶酚双 加氧酶属于氧化还原酶类别并拥有若干不同的底物专一性，该酶包括儿茶酚1，2-双加 氧酶(EC 1.13.11.1)、儿茶酚2，3-双加氧酶(EC 1.13.11.2)以及原儿茶酸3，4-双加氧 酶(EC 1.13.11. 。儿茶酚双加氧酶的活性位点最经常包含铁，但是含锰的形式也是已 知的。由加氧酶催化的反应将释放能够用于微生物生长的能量，并且作为这种生长的结 果，能够被其他物种同化的其他代谢产物将被生成。
由于已经报导需氧菌株在推定的厌氧环境，诸如油藏中茁壮生长，所以氧气可 言旨是在地下的相关气体(Nazina 等人.The phylogenetic diversity of aerobic organotrophic bacteria from the Dagang high temperature oil field (来自 Dagang 高温油田的需氧的有机营养 菌的系统发生多样性).2007.MiCrobiology 74: 343-351)。然而，这些方法没有描述作用 的机制或方式、以及调节或控制潜在的生物工艺的能力，并且响应于这样的刺激的微生 物群落由于无这样的知识而受限制。
微生物的来源和它们的表征
如本文所使用的，术语“含烃地层”是指从中可生成甲烷的任何烃源，包括但 不限于煤、泥煤、褐煤、油页岩、油地层、传统的黑油、粘性油、油砂和焦油砂。在 本文讨论的多种实施方案中，含烃地层或甚至含烃地层的环境可包括但不限于油页岩、煤、煤层、废煤、煤衍生物、褐煤、泥煤、油地层、焦油砂、烃污染的土、石油渣、钻 屑及类似物，并且甚至可能包括除油页岩、煤、煤层、废煤、煤衍生物、褐煤、泥煤、 油地层、焦油砂、烃污染的土、石油渣、钻屑及类似物以外的那些状况或甚至周围环 境。在某些实施方案中，本发明可提供有时被称为原位含烃地层环境或原位甲烷生成环 境的原位含烃地层。实施方案可包括有时被称为异位含烃地层环境或异位甲烷生成环境 的异位含烃地层。原位可指其中含烃来源可能是在它们的原始来源位置中的地层或环 境，例如，原位环境可包括地下地层。异位可指其中含烃地层已经从它的原始位置移除 的地层或环境并且也许甚至可存在于生物反应器、异位反应器、矿井、地面以上结构和 类似地点。作为非限制性实例，生物反应器可指支持生物活性环境的任何装置或系统。
使用煤作为示例性的含烃地层，有许多本土微生物的资源，其在能够被分析的 烃到甲烷的转化中发挥作用。煤是由若干组煤显微成分或主要的有机物类型组成的复杂 有机物，煤显微成分和主要的有机物类型在不同类型的沉积环境(诸如泥煤沼泽或泥煤 湿地)中累积。煤显微成分组分以及因此的煤组分在个别的煤床内横向地和纵向地改 变。一旦微生物被鉴定为含有在转化步骤涉及的途径中的酶，由本发明的方法鉴定的 不同的限定的微生物聚集体或刺激剂可能在特定的煤显微成分组上更好地起作用，并且 因此每种煤床对于何种类型的微生物和刺激剂在煤的原位生物转化上最有效可能是唯一 的。
在地下有许多与煤和其他富含有机物的沉积物相伴随的自然存在的微生物。随 着时间的推移，这些微生物物种在地下通过自然选择的过程在代谢地下有机物上可能已 经变得非常有效。细菌相对快的适应于地区的环境状况暗示收集自煤田或个别煤层的微 生物可能在遗传上是独特的。一旦被收集，这些微生物能够如本文所描述的在实验室培 养物中生长以评价和确定提高和/或限制煤转化为甲烷的因素。在一些情况下，关键的 营养素或微量元素可能缺失，并且这种限制因素的添加可显著地增加甲烷的生成。当细 菌被除去营养素时，便发生生理改变，而且如果饥饿状态持续，所有的代谢系统中止功 能并且细菌经历代谢停滞。当环境状况改变时，细菌可恢复并再次建立有活力的种群。 因此，有可能在富含有机物的沉积物中的一些细菌已经达到代谢停滞状态并且添加的营 养素是激活本发明之下的种群的全部所需。通过具体地分析在这样的种群中出现的酶， 我们能够鉴定正由这些微生物种群的一个或多个成员进行的刺激煤到甲烷的转化涉及的 代谢途径的方法。
来自地下的厌氧菌能够用若干不同的方法收集，该方法包括(1)生成的或取样 的地层水、(2)钻屑、(3)侧壁岩芯样品、(4)整个岩芯样品、以及(5)加压的整个岩芯样 品。虽然加压的岩芯样品可提供收集有活力的微生物种群的最好机会，但是我们已经发 现来自地层水的微生物种群的收集已经提供存在的微生物种群的代表性样品。产甲烷生 物是专性厌氧微生物，但通过形成多细胞块能够在氧气存在下保持活力达M小时之多。 另外，在充氧的系统中缺氧的/还原的微环境能够潜在地将厌氧菌的活力延至更长。在 一些情况下，收集并放置在厌氧密封的容器中的钻屑会含有能够在几小时内将煤转化成 甲烷的微生物，从而给出错误的气体含量测量结果。
我们已经优化了就地收集的方法以提供其中厌氧微生物种群的最适回收。本发 明包括用先前由PCT申请第PCT/US2008/057919(W02008/116187)号描述的方法无氧地10收集微生物种群，以及培养定居在含烃地层环境中(诸如地层水矿井或煤层气矿井)的本 土微生物。
本文提供的方法还给予在遗传上改变微生物的机会。通过鉴定在定居微生物内 的酶功能以及可用于增加甲烷生成的刺激剂，我们能够使用该信息以便从遗传上改造具 有能够束缚于刺激并增加甲烷生成的能力的微生物。用本文描述的方法选择的微生物富 含有效地代谢煤和其他富含有机物的底物的能力。一旦在这些富集的培养物上进行酶分 析，我们就能够优化靶向的刺激剂和/或遗传工程改造的细菌。增加甲烷从矿井生成的 多种可能性包含将鉴定的刺激剂、鉴定的微生物、限定的生物体的聚集体、遗传修饰的 生物体或其任意组合弓I入至地层。
根据本发明的方法，本土微生物被鉴定并且之后被刺激以便将烃转化为甲烷。 在地层中天然存在的微生物是优选的，因为已知它们能够在地层环境中存活并茁壮生 长，而且应该提供开始于烃水解直至产甲烷作用的多种途径的酶组分。然而，本发明不 限于本土微生物的使用。当分析本土微生物的酶谱时，将这种信息与外源微生物的酶谱 相结合可能是有利的。这种信息可能来源于已知的微生物，优选那些适合于在地下地层 中生长、并且通过类比具有类似潜在的酶过程的微生物。
如本文所使用的，术语“限定的微生物聚集体”或“DMA”是指多于一种微生 物的培养物，其中有意地结合或选择不同的菌株以优化烃到甲烷的转化。微生物的聚集 体是“限定的”，这样使得在任一时间点我们能够通过使用遗传方法(诸如本文所描述 的16S分类法)确定种群的成员。DMA不必随时间推移保持静止，但是可进化为优化烃 水解和甲烷生成的培养物流。优选地，DMA被制备以提供具有烃到甲烷的途径中的强大 酶谱的微生物。DMA可包括2种或任意组合的多种微生物以提供能够将烃转化成任何导 致甲烷和/或任何产甲烷的物种的产生的中间产物的细菌物种或古细菌物种。例如，在 DMA中可能存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种的生物 体。DMA的成员在它们之中或与含烃地层中存在的微生物一起协同作用来生成甲烷。
术语“微生物”旨在包括细菌生物体和古细菌生物体，以及相关的真菌、酵母 和霉菌。应理解细菌和古细菌大体上是能够降解烃并且将所生成的产物转化成甲烷的微 生物的代表。微生物的类别之间的分界线不总是清楚的，尤其在细菌和真菌之间。因 此，优选的是使用术语微生物来包括能够将烃转化成甲烷的所有微生物，而无论通常使 用的分类可能是什么。然而，这些微生物中，通常被分类为细菌和古细菌的那些是优选 的。如果外源的细菌和古细菌被用于本文描述的方法中，那么其他微生物诸如真菌、酵 母、霉菌及类似物也能够被使用。
如本文所使用的，术语“厌氧微生物”是指能够在具有比对流层空气少的游离 氧(例如，按摩尔计，少于约18%的游离氧)的大气中生存和生长的微生物。厌氧微生 物包括能够在游离氧浓度按摩尔计少于约10%、或按摩尔计少于约5%、或按摩尔计少 于约2%、或按摩尔计少于约0.5%的大气中发挥功能的生物体。
如本文所使用的，术语“兼性厌氧菌”是指能够在具有高浓度或低浓度的游离 氧的环境中代谢或生长的微生物。
烃转化为甲烷需要产甲烷生物的积极参与。如本文所使用的，“产甲烷生 物”是指从代谢过程中生成甲烷的专性或兼性厌氧微生物。样品内产甲烷生物的存在指示原位甲烷地层的高可能性。产甲烷生物通常被分为四个主要的微生物组甲烷杆 菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌属(MethanomicrolDacteria)及亲缘菌、甲烷火菌目 (Methanopyrales)和甲烷球菌目(Methanococcales)。所有的产甲烷微生物被认为使用相同的生化元件来合成甲烷。产甲烷作用伴随由含金属的酶催化的一系列化学反应。一个 途径是通过一次加一个氢原子来将CO2还原成CH4(CC)2-还原的甲烷生成)。另一个途 径是乙酸盐和单碳化合物(除甲烷外)发酵成甲烷(乙酸发酵，或乙酸分解的产甲烷作 用)。在所有已知的产甲烷途径中的最后步骤是使用称为甲基还原酶的酶将甲基还原成 甲烷。由于甲基还原酶的存在对所有产甲烷生物而言是常见的，因此它是产甲烷的微生 物的确定的特征。用于鉴定产甲烷生物的存在的优选方法是直接测试生成甲基还原酶需 要的产甲烷生物基因。可选择地，产甲烷生物的存在能够通过使用本领域熟练的技术人 员已知的技术(一般来说本文指的是16S分类法)比较回收的16S rDNA与古细菌的16S rDNA文库来确定。
产甲烷生物的类别除其他之外包括甲烷杆菌目、甲烷微菌目、甲烷火菌目、 甲烷球菌目、及鬃毛甲烷菌属(Methanosaeta)(例如，嗜热鬃毛甲烷菌(Methanosaeta thermophila))。 产甲烷生物的具体实例包括热自参甲烷杆菌(Methanobacter thermoautotorophicus)和沃氏甲烷杆菌(Methanobacter wolfeii)。产甲烷生物也可通过醇 (例如，甲醇)、胺(例如，甲胺)、硫醇(例如，甲烷硫醇)、和/或硫化物(例如， 二甲基硫化物)的代谢转化生成甲烷。这些产甲烷生物的实例包括来自以下属的产甲 烷生物甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)(例如，巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、西西里甲烷八叠球菌 (Methanosarcina siciliae)、食酸甲烧八叠球菌(Methanosarcina acidovorans)、马氏甲烧 W叠球菌(Methanosarcina mazeii)、弗里西亚甲烧叠球菌(Methanosarcinafrisius))； 甲烷叶菌属(例如，孟买甲烷叶菌(Methanolobus bombavensis)、丁达尔甲烷叶菌 (Methanolobus tindarius)、火山甲烷叶菌(Methanolobus vulcani)、泰洛氏甲烷叶菌 (Methanolobus taylorii)、俄勒冈甲烷叶菌(Methanolobus oregonensis))；甲烷嗜盐菌 属(Methanohalophilus)(例如，马氏甲烷嗜盐菌(Methanohalophilus mahii)、嗜甲基甲 烷嗜盐菌(Methanohalophiluseuhalobius)；拟甲烷球菌属(Methanococcoides)(例如， 甲基拟甲烧球菌(Methanococcoides methylutens)、布氏拟甲烧球菌(Methanococcoides burtonii))；和/或地烷烃菌属(Methanosalsus)(例如，朱丽娜盐地烷烃菌(Methanosalsus zhiKnaeae))。它们也可能是来自甲烷球形菌属(例如，显示将甲醇代谢成甲烷的斯氏甲 烧球形菌(Methanosphaerastadtmanae)和兔甲烧球形菌(Methanosphaeracuniculi))的产甲 烷生物。它们还可能是来自甲烷食甲基菌属(Methanomethylovoran)(例如，显示出将甲 醇、二甲基硫化物、甲烷硫醇、一甲胺、二甲胺和三甲胺代谢成甲烷的荷兰甲烷食甲基 菌(Methanomethylovoranshollandica))的产甲烧生物。
如本文描述的，本发明的一个特征是从多种环境样品中获得的微生物群落适合 于使用如本文提供的基因组工具来研究；另外，微生物种群在实验室能够使用本发明的 方法来培养和任选地分离和/或富集。通过在基因组水平应用这些方法，并通过具体地 表征烃到甲烷的转化涉及的微生物的酶谱，有可能形成对微生物群落的新陈代谢的根本 性理解，以及更具体地，对地层水和煤层中煤的产甲烷性降解的根本性理解。这样，我们就能够阐明每个种群的生态小环境并最终研制能够产生增加生物甲烷的生成的刺激剂 禾口 /或DMA。
根据本发明的方法鉴定了在含烃地层环境中存在的微生物(本土微生物)、和/ 或在这样的微生物中存在的酶，并之后对其进行刺激或调节以便将烃转化成甲烷。在地 层中天然存在的微生物是优选的，因为已知它们能够在地层环境中存活并茁壮生长。然 而，本发明不限于本土微生物的使用。适合于在地下地层中生长的外源微生物可被鉴 定，或其中的酶可被鉴定，并且在实行本发明的工艺之前、期间或之后这样的微生物或 这样的酶可通过已知的注射技术被引入至地层。例如，如果地层仅含有期望的三组分聚 生体的两种微生物、或仅含有由烃到甲烷的酶途径的三种期望的酶功能中的两种，那么 的缺失的微生物、酶、或这样的微生物或酶的刺激剂可被注射入地层。微生物，本土的 或外源的，也可以是重组修饰的或合成的生物体。
宏基因组和核酸分析
在本发明中提出一种用于提高甲烷生成的新方法和可能的范例。这包括对基因 组和宏基因组(自然界最基本的生物实体)的描述。通过表征在甲烷生成位点上总群落 的基因组，也称为宏基因组，有可能得到对微生物的甲烷生成(包括利用的底物和产生 的中间产物和产物)的基本的理解。而且，通过最终导致指向甲烷的能量级联的电子传 递，不同的种群之间的相互作用和协同效应能够被阐明。与基因组结果相结合的培养数 据暗示地下的微生物种群以及由此气体的生成能够通过介入来刺激，所述介入包括导致 甲烷的生成增加的补充的底物、反应物或生长因子和/或特定的微生物接种。本发明的 方法和自其获取的结果代表了地下微生物学结合分离菌株的宏基因组学、微生物培养和 基因组分析的首次研究。结果显示为了形成综合的生态系统理解这些学科的相互依赖是 必要的。
如本文所使用的，术语“宏基因组”或“宏基因组学”是指来自环境样品、代 表在该样品中存在的所有微生物谱的遗传物质以及这种遗传物质的分析。宏基因组学在 本领域也被称为“群体基因组学”或“环境基因组学”。通常，宏基因组学包含核酸测 序和从环境回收的生物体种群的总DNA的分析，例如，回收自一个样品中的所有微生物 的混合的DNA而不必培养微生物种群自身的单个成员的菌株。
—般而言，首先分离来自整个微生物群落的DNA，即宏基因组，并且之后使用 基因特异性引物(通常是16S通用引物)和PCR技术扩增。接着，通过若干技术纯化片 段，并且之后将其连接到分子载体(例如，质粒DNA)中，并且作为克隆过程的一部分转 化到细菌(通常是大肠杆菌)中以产生大量分离的DNA片段。个别细菌克隆的培养物用 于分离个别克隆(重组的质粒DNA)，并且之后使用靶特异性引物对这些克隆测序。之 后将得到的DNA序列与分子基因数据库中已知菌株的DNA序列相比较。在大多数情况 下，如果与具有已知生理特征和生态特征的已知微生物有接近的匹配，那么能够推断出 微生物的身份。
通常，通过本领域已知的任何方法将DNA与环境DNA分离，并且之后将其剪 切成用于构建DNA克隆文库的片段。克隆文库可以是小的插入片段文库或中等插入片段 (2-15 的插入片段大小)的文库或大插入片段的细菌人工染色体(BAC)文库或F黏粒 (fosmid)文库(高达150kb的插入片段大小)，这些文库可以用随机或靶向方式测序。
宏基因组的进一步分析包括确定系统发生多样性是不依赖培养物的16S rRNA分 析(被称为16S分类法)以及还包括鉴定宏基因组中感兴趣的基因的序列分析。在随机 测序方法中，随机选择克隆并进行末端测序，并且得到的序列通过匹配重叠序列而被组 装成较大的连续片段(“毗连序列群”)。得到的数据是不同长度的毗连序列群以及较 短的未组装的片段。完整测序的“参考”基因组的可用性可协助紧密相关的基因组的组 装过程。在完整测序的“参考”基因组不存在时，毗连序列群可以基于它们的G+C含 量、密码子使用、序列范围、短n-mer(核苷酸频率)、以及允许它们被划分到能够被视 作“种”的组的其他参数而被指定为各种“Mn”。之后使用多种方法从这些序列数据 预测编码序列(CDS，基因)。经常在随机测序方法中，鉴定的基因可能不归属于特定的 微生物物种(即，无分类学或系统发生学的隶属)，虽然如此，这些基因代表总体微生物 群落的能力并可能揭示它们的环境的特征。在“靶向”测序方法中，对于期望基因的存 在(例如，通过PCR扩增)或基因功能的存在(通过功能测定)首先筛选克隆。对靶向 的大插入片段的克隆进行整体测序允许恢复完整操纵子的可能性，例如，那些编码代谢 途径的操纵子。
常见的方法是靶向具有提供系统发生信息的基因(诸如16S rRNA)的F黏粒。 在称为“系统发生的锚定(phylogenetic anchoring)”的该方法中，如果检测16S rRNA基因，那么整体上对F黏粒插入片段测序，由此允许我们将基因组DNA序列指定为具体的 种系型。该方法有助于将推测的功能基因(从侧翼插入片段序列预测的)纳入种系发生 (rRNA)。拥有过程特异性基因或生物标记物基因的F黏粒(例如，对于在正研究的环境 中可能占优势的过程，像甲烷氧化或脱氮)也可被靶向测序以便扩展关于这些过程的途 径的信息。通过联合随机方法和靶向方法，感兴趣的基因(例如，来自未知种系型的16S rRNA基因)或从随机测序阶段鉴定的新颖基因可用于筛选和靶向用于测序的其他克隆， 或者可用于鉴定连接的克隆并扩展基因组范围。
在一个具体的比较分析中，从宏基因组和/或其中代表性的微生物鉴定的基 因能够与已知的蛋白家族比较以确定编码烃到甲烷的转化涉及的途径中的酶的基因产 物的存在。例如，Pfam数据库是蛋白质家族的大集合，每一个蛋白质家族由多重序 列比对和隐马尔可夫模型(HMM)代表。蛋白质一般由一个或多个通常称为结构域的 功能区域组成。结构域的不同组合产生在自然界中发现的范围多样的蛋白。因此鉴 定蛋白内存在的结构域能够提供对它们的功能的洞察。见，Pfam蛋白家族数据库 R.D.Finn, J.Tate, J.Mistry, P.C.Coggill, J.S.Sammut, H.R.Hotz, G.Ceric，K.Forslund， S.R.Eddy, E.L.Sonnhammer 禾口 A.Bateman, Nucleic Acids Research (2008) Database Issue 36 D281-D2880通过将基因组信息与Pfam数据库比较，本文提供的方法提供在宏基因 组、微生物个体菌株、DMA、或其任意组合中存在的酶的功能的概貌。
刺激剂的鉴定
如本文所使用的，术语“刺激剂”是指能够在含烃地层中用于增加或刺激甲烷 的生物源生成的任何因子。优选地，刺激剂对于在烃到甲烷的转化涉及的途径中包含的 酶来说是底物、反应物或辅因子。在某些情况下，刺激剂被加入以调节在含烃地层的现 存微生物中存在的酶(通过任何方法增加、降低或调节)。在某些情况下，刺激剂可以是 酶自身、微生物(例如，表达酶或另一种蛋白以调节相关的酶的微生物、或通过重组或合成产生的这样的微生物)、或限定的微生物聚集体。在任何情况下，刺激剂的功能是通 过增加微生物的活性水平或生长水平来促进现有的生产，或通过一种方法增加、降低或 调节在烃到甲烷的转化涉及的途径中包含的酶的酶活性以便优化甲烷从含烃地层的最后 生成。
刺激剂可提供在含烃环境中并非最佳表现或起作用的任何酶的提高、替代或加 入。目标是由烃到甲烷的途径的优化和/或完成。一般地这需要酶的表现或表达能够 将烃转化成诸如氢气、二氧化碳、乙酸盐、甲酸盐、甲醇、甲胺或其他任何产甲烷的底 物的酶和产甲烷的酶的微生物的表现。酶的总的范畴包括能够水解低阶煤、煤解聚、厌 氧或需氧降解多环芳烃、同型产乙酸和产甲烷(包括氢营养的或CO2还原的和乙酸分解 的)的酶，以及为实现烃到甲烷的转化的这些酶的任意组合。提供这样的功能的酶可包 括，例如，过氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚 酶、氧化酶、固氮酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶、还原酶、歧化酶、加 氧酶、单加氧酶、双加氧酶、过氧化氢酶、氢化酶和羧化酶。
刺激剂的实例包括冷冻干燥的微生物，诸如产甲烷生物、互养生物(syntroph)、 发酵微生物和/或水解微生物；或者可具有包含如氮、磷、钾、维生素、痕量金属、酵 母提取物、含硫化合物、含氮化合物、含磷化合物、微量元素、电子受体、电子供体、 卤素、金属、醇、有机酸、烷、烯、炔、芳香化合物、胺、醚、醛、酮、硫醇、乙酸 盐、芳香烃和气体的这样的化合物的化学性质的刺激剂、底物、反应物或辅因子。
一旦酶通过本发明的方法鉴定，则该酶的合适的底物、反应物或辅因子能够被 鉴定。
具体的刺激剂包括，例如，酵母提取物、NH4C1、NaNO3> K2HPO4^辅酶Μ、 Ρ04、减去磷酸盐的维生素混合物、痕量金属、02、H2,含磷化合物、乳酸、矿物改良剂 (诸如氯化物、铵、磷酸盐、钠、钾、镁和钙)、金属改良剂(诸如Mn、Fe、Co、Zn、 Cu、Ni、Se、W或Mo)、维生素改良剂(诸如吡哆醇(pyridoxime)、硫胺素、核黄素、 钙、泛酸、硫辛酸(thioctia acid)、对氨基苯甲酸、烟酸、维生素B12、生物素、叶酸和 巯基庚烷磺酸(mecaptoheptanesulfonic acid)、丙酮酸、烷基醇、甲醇、乙醇、2-丙醇、 2，3 丁二醇、香子兰酸盐(vanillate)、甘氨酸、半胱氨酸、甲酸盐、乙醇胺以及3，4， 5-三甲氧基苯甲酸酯、水改良剂、甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、private、NaCL,纤维素、 矿物质溶液、肉桂酸、苯甲酸、DNG、alasan,肥料组分、壳多糖、壳聚糖、氯酸盐、高 氯酸盐、以及它们的任何组合。
刺激剂的掺入增加甲烷生成
本发明的方法和工艺能够容易地被用于现场应用和从任何含烃地层(诸如煤) 原位或异位甲烷生成的提高。有若干能够用于原位甲烷生成的本领域已知的注射技术的 方法或组合。由本发明的方法鉴定的刺激剂、DMA或微生物能够被直接注入地层的裂 隙中。裂隙定位、目前原位应力的方向、储库(煤和/或页岩)几何学以及局部结构是 要考虑的因素。例如，在煤床中有两个主要的网络构造(称为割理)，名为面割理(face cleat)系统和端割理(butt cleat)系统。面割理经常是在侧向上更连续的和更易渗透的，但 是端割理(其与面割理形成邻接关系)的连续性和渗透性较低。在煤层气矿井的刺激期 间，次生裂隙(induced fracture)与允许更多地使用储库的原生面割理(primary face cleat)15交叉。然而，当目前原位应力的方向于垂直面割理时，则应力的压力关闭面割理，由此 降低渗透率，但是与此同时原位压力增加了端割理系统的渗透率。在这些状况下，次生 裂隙垂直于端割理方向，提供了更好地使用储库中的天然裂隙系统的机会。注射矿井和 生产油井的几何学、以及无论是否水平的隔室(cell)被用于通向储库，主要依据于局部地 质条件和水文条件。
如在常规油井和煤气井中的煤层气的水力劈裂刺激的目的是产生与天然存在的 储库的裂隙网络相连接的次生裂隙网络。由本发明的方法鉴定的刺激剂、DMA或微生物 能够在压力下被引入天然存在的裂隙和人工次生裂隙中以驱使混合物进入深入储库中的 天然存在的裂隙中以使生物转化率和效力最大化。在储库的劈裂刺激期间，可将砂支撑 剂(sandpropant)和多种化学物质通过钻机在高压下泵入地层。
可以在劈裂刺激的同时和/或在水力劈裂产生之后将刺激剂、DMA或微生物注 入储库中。当地下厌氧状态被重建时，预期大多数原位微生物应用发生在劈裂刺激和完 井液的移除之后。然而，在原位微生物和劈裂的同时刺激下，在无氧状况或低氧状况下 刺激流体的使用是优选的，以使在储库中的厌氧状况被维持、或在刺激后能够被容易地 获取。在同时刺激的过程中需氧菌的注入将导致氧气的快速消耗并返回到厌氧状况。
在一些情况下，改变煤、碳质页岩或富含有机物的页岩用于生物转化的预处理 流体可与劈裂流体一起使用。然而，用于促进有机物的原位生物转化的优选的方法是在 水力劈裂刺激和随后的矿井冲洗之后在压力和厌氧条件下注入刺激剂、DMA或微生物。
如图16中所描绘那样，可以通过将地层水再引入至地下来引入由本发明的方法 鉴定的刺激剂、DMA或微生物。简言之，将甲烷和地层水从矿井套管(well casing) 1泵 入隔离池2 (也被称为分离罐)以便从水中移出气体。地层水被存储在储池3中，从储池 3中地层水能够被推进到固结地点或被引导再注入至地下。之后刺激剂、DMA或微生物 会被加至制备池4并与回收的地层水相混合。之后可使用压气机5或加压系统将地层水 中的刺激剂、DMA或微生物引入至地下。
在地层水中存在的原位溶解氧可能不被煤层中的微生物得到并因此变成增加甲 烷生成的限制因素。刺激剂、DMA或微生物的引入、或气体、液体、凝胶或固体的输送 能够提供适合于增加甲烷的环境，包括与氧捆绑的能够有氧降解烃的菌株。例如，在一 个示例性实施方案中，由合适的本土菌株(诸如假单胞菌属)以每毫升IO7个细胞的细胞 数目组成的接种物能够与由可被用作营养素的有机底物(诸如甘油)组成的凝胶相混合， 所述营养素通过能够被产甲烷生物使用的代谢产物(包括氢气)的发酵和分泌来刺激生 长。一旦凝胶被同化，它将缓慢释放最适的量的氧，这些氧进而将被具有需氧降解烃能 力的菌株使用。这些改良剂和结果产生的新陈代谢将刺激电子流向甲烷，生成与同一煤 层的未被干预的对照矿井相比更高的量和产量。这对具有需氧或厌氧生长能力的菌株是 尤其有利的，并能够使它们的新陈代谢适应于烃的降解。在一个独立的实施方案中，具 有高浓度溶解氧的地层水被注入矿井中以便分配加氧酶催化反应所需的一些氧气。能够 通过用机械系统(诸如推进器(impeller))充气或其他机制将氧气溶解在地层水中。可选 地，能够使用中间机制将氧气引入至厌氧环境。例如，氯酸盐能够被用作产生氧气释放 的电子受体，所述氧气释放是通过在宏基因组分析中均存在的酶氯酸盐还原酶和亚氯酸 盐歧化酶进行的。
在可选的实施方案中，基于颗粒的方法能够用于在分散(fracing)过程中分配刺 激剂、DMA或微生物(总称为介入剂)。目标是引入这些介入剂以便产生甲烷生成的可 持续增加。改进的递送系统将介入剂注入深达矿井裂纹中并确保按时间释放的部署。例 如，矿井介入剂可被配制为在分散过程中使用的砂粒上的按时间释放的包衣或者配制为 随时间缓慢溶解的硬颗粒；大小被考虑为与在分散工艺中使用的砂粒大致相同，并能够 在加至胍尔豆胶溶液(称为支撑剂)之前被一起混合。在任一种形式中，一旦支撑剂和颗 粒被泵入矿井中并被加压，包覆的砂粒或与砂混合的硬颗粒在矿井裂隙中被注入压力， 保持它们开放以利于气体或油的释放。因为以不同于一些药剂的时间释放的方式配制介 入剂，所以化合物和/或微生物将缓慢溶解，并分散到周围的地层水中以及分散到推测 其中粘附细菌定居的煤割理(或在油的情况下为细岩石裂隙)中。以这种方式，溶解的 介入剂持续地刺激煤到甲烷的生物源转化。制剂能够被制成经小时、天、周或月的时间 释放介入剂以便优化甲烷刺激工艺。包衣或颗粒能够在不存在氧气的情况下制备以便于 维持苛性厌氧微生物的活力，或者它们也能够包含刺激甲烷生成的气体。
提供下列实施例来图示、但不限制本发明。
实施例1
来自煤层气矿井的生成甲烷的微生物的取样和富集
自位于美国科罗拉多州的圣胡安煤田的煤层气矿井中的储池收集200L体积的地 层水并且自隔离池收集20L体积的地层水。之后用Imm至45 μ m的一系列无菌筛过滤 水样以移除与地层水一起的大块的煤和油。然后将子样品转移到IL无菌瓶中并使用便携 式罐和玻璃吸管用N2喷洗。之后用丁基胶塞(butyl stopper)密封无菌瓶并用于接种。
将由矿物基质和作为碳源的粗煤组成的培养基分配至具有5ml培养物和0. 作 为唯一碳源的煤的Hungate导管。
用于产甲烷富集物和纯培养物的培养基组成
每IL无菌制备的水
NH4Cl 0.5g
KH2PO4 0.75g
K2HPO4 1.5g
商品化(ATCC)维生素和微量元素溶液各IOmL
以Iatm灭菌15-30分钟，并然后从储液中加入
酵母提取物0.05%终浓度
Na2Sx9H20 3mM 终浓度
半胱氨酸-HCl 3mM终浓度
以Iatm灭菌15-30分钟，并然后从储液中加入
用于产甲烷的适当的碳源和能量源
气体混合物CO2 H2/20 80 高达 2atm
在一些培养物中，使用由硝酸钠(IOmM)、硫酸钠(IOmM)和磷酸铁(IOmM)组 成的电子受体的混合物来刺激厌氧呼吸和厌氧生长。通过将所有组分分配到厌氧培养室 中来无氧地制备培养基，厌氧培养室具有5% H2、5% CO2并被用N2平衡的气氛。其他 的培养物包括高压灭菌煤的使用。培养基的制备中不使用还原剂，诸如硫化钠或半胱氨17酸。通过用注射器和先前用N2冲洗三次的针从IL样品瓶无氧地收集Iml样品而在现场 直接接种样品。在30°C孵育接种的管并将其运输到实验室。生长几周之后，用显微镜监 测样品的生长并且通过气相色谱法测量甲烷的生成。选择富集物在作为唯一碳源的煤上 生长的能力和它们的甲烷生成。在不含电子受体的培养物中检测到最高甲烷浓度。在连 续转移原代富集物六次后，甲烷的生成貌似是可再现的和可拓展的，一致地产生3%的顶 部空间(head space)。随后将选择用于进行表征的群落转移至血清瓶中并且在30°C下在 10天和30天之间在顶部空间中以约3%持续产生甲烷。实施例2来自煤层气矿井的微生物群落和富集的生成甲烷的微生物群落的表征用从地层水和富集物中存在的煤中有效地分离核酸的优化的方法从地层水样中 提取总群落DNA。基因组文库使用多重方法从储池水样构建以评估潜在的偏倚并有效地 捕获总的微生物群体，包括细菌、古细菌和真核生物。先前对储池的基因组分析揭示了 与诸如土壤或表层海洋水的环境相比相对较低的复杂性。值得注意地，不存在真核细胞 是令人震惊的。在基因组数据中有对应于变形菌门(Proteobacteria)、弓形杆菌属和产金 菌门(Chrysiogenes)的两种主要的细胞系谱，它们的基因组可以由群落DNA重新组装。 它们的代谢可能与油和其他烃的降解及亚砷酸盐的呼吸有关。DNA的制备

将筛选至大小小于45 μ m的水用孔径为3 μ m、0.8 μ m和0.1 μ m的一系列串联 连接的膜过滤。从滤器装置收集膜，在-20°C下与Tris-EDTA缓冲液一起冷冻并运输到 实验室。如下从膜中提取DNA。将滤器在过量体积的裂解缓冲液(50mM NaCL 50mM Tris pH 8.0、50mM EDTA、5% SDS> 4%聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(8000)、0.5M葡萄糖、200mM β-巯基乙醇、IOmM腈脒、IOmM抗坏血酸、20 μ g/ml 二苯甲酰胺和100 μ g/ml酵母 tRNA)中在旋转轮上以室温浸泡45分钟。自每个样品收集上清液并且通过向每个样品加 入五个1/8”和一个3/8”不锈钢珠以及Ig 0.5mm玻璃珠并在Geno/Grinder 2000中以每 分钟1500冲程(stroke)振荡样品4分钟来破碎细胞。将氯化钠加入至每个样品达0.8M， 一次用酚_氯仿、一次用氯仿萃取样品并将其在异丙醇中沉淀。作为过滤的替代，首先通过在4°C以10,OOOrpm离心30分钟来沉淀地层水，将 上清液移入新的容器，细胞/碎片团粒悬浮在裂解缓冲液并且用如上述的相同方式纯化 DNA。通过下列步骤从上清液中回收残余的生物物质加入聚乙二醇800达10%，在 4°C孵育过夜并之后在4°C以10,OOOrpm离心30分钟，将团粒悬浮于裂解缓冲液并重复上 述的纯化实验方案。将从纯化获取的DNA溶解在少量的IOmM Tris pH 8.0、ImM EDTA 中并通过光谱法和凝胶电泳分析。基因组文库的制备通过使用装备有标准剪切组件的Genomic Solutions GeneMachines HydroShear将
来自上述微生物库的宏基因组DNA剪切至I-Skb的平均大小来构建基因组文库。使用本 领域已知的标准程序将DNA在琼脂糖凝胶上按大小选择、接合到DNA衔接子并连接到 中等拷贝(medium-copy)的大肠杆菌克隆载体。通过电穿孔法将连接产物转化至大肠杆 菌，挑取随机克隆，使其在Iml培养物中生长并提取质粒DNA。使用Sanger法对每个克隆双向测序。序列分析地层水(储池)的分类学多样性通过比较16S基因序列来分析，该16S基因序列直接地来自宏基因组(来自环境文库的序列)的或者通过由用于宏基因组文库构建的 DNA样品来扩增16S基因序列。这些分析揭示群落由古细菌和细菌组成而无真核细胞存 在。之后将单个的宏基因组读数进行专有生物信息注释流水线(bioinformatic annotation pipeline)，该生物信息注释流水线首先鉴定所有大于50个氨基酸的开放阅读框 (ORF)。为指定每个ORF的推定的功能，首先将它们针对多重序列比对的现有收集物进 行PFAM、TIGRFAM和SUPERFAM家族分析并使用HMMER软件进行用于相应的蛋白 家族的隐马尔科夫模型(Hidden Markov model)分析。另外，针对GenBank中的非冗余 蛋白数据库，使用BLASTp来比较从宏基因组鉴定的蛋白。之后检索自这个流水线产生 的注释并且进行宏基因组储池、生成甲烷的富集培养物和分离的菌株之间的比较。分析 揭示了大量的需要氧的基因诸如双加氧酶(硝基丙烷、植烷酰辅酶A、甲苯、联苯基2， 3_ 二醇及双萜类化合物)和单加氧酶(P450、烷、氨和2，4-二氯)。与需氧酶一起的 还有大量帮助包括抵抗氧的酶，诸如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、玉红氧还蛋白、和 硫氧还蛋白。使用细菌域和古细菌域(后者包含产甲烷生物)的16S基因序列从分类学上分析 生成甲烷的富集物。在培养的第10天和30天通过下列步骤来分析群落扩增来自群落 的这种片段，通过将16S片段克隆至载体创建16S片段的文库，将它们转化到大肠杆菌中 并如上所述对克隆的片段测序。之后将这些序列与公开的数据库相比较以查看最相近的 培养亲缘菌。如在图2A中显示的，在10天之后细菌的多样性占优势的是假单胞菌属、 脱硫单胞菌属、暗杆菌属、脱硫弧菌属相关的生物体，并且在第10天或30天螺旋体属、 丹毒丝菌属、索氏菌属、梭菌属、无胆甾原体属和磁螺菌属丰富程度次之。如在图2B中 显示的，在第10天古细菌群体中占优势的是产甲烷生物甲烷叶菌属，并且在第30天，出 现了甲烷卵圆形菌属和未表征的泉古菌门。图3图示了如通过来自宏基因组的RecA基因 序列分析的那样在代表性的地层水样品中的细菌多样性。井口样品_细菌的16S分类法的代表网球菌属(Dictyoglomus)浮霉状菌科(Planctomycetaceae)红色杆菌科(Rubrobacteraceae)热脱硫弧菌属(Thermodesulfovibrio)梭菌目(Clostridiales)拟杆菌目(Bacteroidales)Thermacetogenium热袍菌属(Thermotoga)积物热微杆菌属(Thermosediminibacter)变形菌纲(Deltaproteobacteria)共养单胞菌属(Syntrophomonas)
拟杆菌门(Bacteroidetes)拟杆菌目(Bacteroidales)热脱硫L菌门(Termodesulfovibrio)磁杆菌属(Magnetobacterium)鼠孢菌属(Sporomusa)脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)热袍菌属(Thermotoga)梭菌目(Clostridiales)硫磺单胞菌属(Sulfurospirillum)Proteiniphilum粪热杆菌属(Coprothermobacter)厌氧弯曲菌属(Anaerosinus)固氮弧菌属(Azospira)Ceillonellaceae硝化螺旋菌门(Nitrospiracaea)热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)Ruminococcaceae梭菌属(Clostridia)Therminocola消化球菌科(Peptococcaceae)梭菌目(Clostridiales)变形菌门(Proteobacteria)青枯菌属(Ralstonia)Ruminococcaceae拟杆菌(Bactersidales)丙酸杆菌禾斗(Propionibacteriaceae)丝杆菌(Niastella)沙雷氏菌(Serratia)热脱硫弧菌属(Thermodesulfovibrio)丝杆菌(Niastella)金黄杆菌属(Chryseobacterium)史密斯氏菌属(Smithella)Y —变形菌纲(Gammaproteobacteria)磁杆菌属(Magnetobacterium)Proteiniphilum螺旋体科(Spirochaetaceae)古细菌的16S分类法的代表-产甲烷作用热变形菌纲(Thermoprotei) 甲烧丝菌属(Methanothrix)
甲烷泡菌属(Methanofollis)甲烧杆菌属(Methanobacterium)甲烷微菌目(Methanomicrobiales)甲烧粒菌属(Methanocorpusculum)除硫球菌目(Desulfurococcales)菌株的分离 使用功能富集物和环境样品通过环境微生物的分室培养(compartmentalized cultivation) (EMCC,如在 PCT/US2008/057919，W02008/116187 中描述的)或标准方法 诸如琼脂管混菌法(agar shake)进行单个菌株的分离。EMCC法通过将细胞悬液包封入凝 胶微滴(GMD)并在30°C有氧培养而进行。细胞形成菌落，将菌落分选到无菌培养基上 以用于继代培养。之后通过16S分析所得的细胞培养物以鉴定独特的菌株。后一方法包 括熔化的琼脂，在该熔化的琼脂上施加来自系列稀释物的细胞悬液。之后将管密封并用 风尤02或压:02替代顶部空间并培养直至细胞开始形成菌落，挑取菌落并继代培养。之 后将选择的分离菌株厌氧培养，它们中的一些具有有氧或厌氧生长的能力。为分离来自生成甲烷的富集物的单个菌株，然后将100 μ 1的样品稀释并接种到 具有琼脂和煤的Hungate管以形成菌落并提供对特定的系谱的分离。另外，将富集物包封 并且有氧地培养以用于形成小菌落，用高速细胞分选仪将这些小菌落排列到96孔板上。 这些分离的努力产生了之后使用16S基因序列鉴定的菌株(如在图2Α和2Β中显示的)。 从这种最初的生成甲烷的富集物中，培养了假单胞菌属、脱硫单胞菌属、暗杆菌属、脱 硫弧菌属、索氏菌属、无胆甾原体属和短小甲烷卵圆形菌(Methanocalculuspumilus)的 单个菌株。之后单个菌株能够在功能富集培养物中被重构成群落作为限定的微生物聚集 体。一些分离的菌株还被用于基因组测序以便鉴定酶的降解中涉及的基因和途径。例 如，假单胞菌属菌株显示出一些PAH降解涉及的加氧酶，诸如3-苯丙酸双加氧酶、烷磺 酸单加氧酶和儿茶酚2，3-双加氧酶亦在其中。分离的细胞培养物-16S分类法
权利要求
1.一种鉴定在含烃地层中增加甲烷的生物源生成的刺激剂的方法，所述方法包括(a)从来源于含烃地层环境的一种或多种微生物中获得核酸序列；(b)确定所述核酸序列的一种或多种基因产物的存在，其中所述基因产物是在烃到甲 烷的转化中涉及的途径中的酶；以及(c)鉴定当提供给所述含烃地层中的一种或多种微生物时增加甲烷生成的所述酶的底 物、反应物或辅因子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种微生物通过根据在作为唯一碳源的 煤上生长的能力的筛选而被富集。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(C)包括以多于一种浓度体外测试一种或多种 底物、反应物或辅因子以在包含从所述含烃地层分离的至少一种微生物的培养系统中监 测和优化甲烷的生成，而且其中所述培养系统提供煤作为唯一的碳源。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种微生物是能够将烃转化成选自由氢、 二氧化碳、乙酸盐、甲酸盐、甲醇、甲胺和产甲烷的底物组成的组的产物的细菌物种或 古细菌物种；产甲烷的细菌物种；或产甲烷的古细菌物种。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种微生物是选自由假单胞菌属、弓形杆 菌属、脱硫单胞菌属、暗杆菌属、脱硫弧菌属、螺旋体属、丹毒丝菌属、索氏菌属、梭 菌属、无胆甾原体属、磁螺菌属和硫磺单胞菌属组成的属的组的细菌物种；或是选自由 甲烷叶菌属、甲烷卵圆形菌属和泉古菌门的成员组成的组的古细菌物种。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(C)包括以多于一种浓度体外测试一种或多种 底物、反应物或辅因子以在包含限定的微生物聚集体的培养系统中监测和优化甲烷的生 成；其中所述限定的微生物聚集体将来自含烃地层的微生物单菌株的培养物与另一种微 生物单菌株的至少一种其他的限定的培养物相组合，使得所述限定的微生物聚集体的成 员协同作用以生成甲烷；并且此外其中所述培养系统提供煤作为唯一的碳源。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述限定的微生物聚集体包括选自由以下组成的属 的组的至少两种微生物物种假单胞菌属、弓形杆菌属、脱硫单胞菌属、暗杆菌属、脱 硫弧菌属、螺旋体属、丹毒丝菌属、索氏菌属、梭菌属、无胆甾原体属、磁螺菌属、硫 磺单胞菌属；甲烷叶菌属、甲烷卵圆形菌属和泉古菌门的成员。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述含烃地层选自由煤、泥煤、褐煤、油页岩、油 地层、传统的黑油、粘性油、油砂和焦油砂组成的组。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述酶选自由过氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、 漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶、氧化酶、固氮酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚 糖酶、普鲁兰酶、还原酶、歧化酶、加氧酶、单加氧酶、双加氧酶、过氧化氢酶、氢化 酶和羧化酶组成的组。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述酶选自由加氧酶、单加氧酶和双加氧酶组成 的组。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述底物、反应物或辅因子选自由含硫化合物、 含氮化合物、含磷化合物、微量元素、电子受体、电子供体、卤素、金属、醇、有机 酸、烷、烯、炔、芳香化合物、胺、醚、醛、酮、硫醇、乙酸盐、芳香烃和气体组成的组。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述底物、反应物或辅因子是氧。
13.一种用于在含烃地层中提高甲烷的生物源生成的方法，所述方法包括将由权利要 求1所述的方法鉴定的刺激剂引入所述含烃地层中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法包括将氧引入所述含烃地层中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述含烃地层是煤。
16.—种用于在含烃地层中增加甲烷的生物源生成的方法，所述方法包括调节选自 由过氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶、氧化 酶、固氮酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶、还原酶、歧化酶、加氧酶、单 加氧酶、双加氧酶、过氧化氢酶、氢化酶和羧化酶组成的组的酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述酶在所述含烃地层中的现存微生物中存在。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述酶被引入所述含烃地层中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述酶通过将表达所述酶的微生物引入所述含 烃地层中而被引入。
20.根据权利要求19所述的方法，其中表达所述酶的所述微生物是通过修饰来源于所 述含烃地层的微生物而制备的重组的微生物。
21.根据权利要求19所述的方法，其中表达所述酶的所述微生物是合成的微生物。
22.—种鉴定用于煤到甲烷的转化的限定的微生物聚集体的方法，所述方法包括(a)从来源于煤环境的一种或多种微生物获得核酸序列；(b)确定所述核酸序列的一种或多种基因产物的存在，其中所述基因产物是在煤到甲 烷的转化中涉及的途径中的酶；(C)制备来自所述煤环境的所述一种或多种微生物的单菌株的培养物，其中所述微生 物的单菌株含有所述一种或多种基因产物；以及(d)将所述培养的微生物单菌株与另一种微生物单菌株的至少一种其他的限定的培养 物相组合以提供限定的微生物聚集体；其中所述限定的微生物聚集体的成员协同作用以生成甲烷。
23.—种限定的微生物聚集体，其由权利要求22所述的方法鉴定，用于煤到甲烷的转化。
24.如权利要求22所述的方法，所述方法还包括(e)提供底物、反应物或辅因子给增加甲烷生成的所述限定的微生物聚集体。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述限定的微生物聚集体包括选自由以下组成的 属的组的至少两种微生物物种假单胞菌属、弓形杆菌属、脱硫单胞菌属、暗杆菌属、 脱硫弧菌属、螺旋体属、丹毒丝菌属、索氏菌属、梭菌属、无胆甾原体属、磁螺菌属、 硫磺单胞菌属；甲烷叶菌属、甲烷卵圆形菌属和泉古菌门的成员。
26.—种用于增加甲烷从煤的生物源生成的方法，所述方法包括将由权利要求22所述 的方法鉴定的限定的微生物聚集体引入煤床中。
27.—种用于增加甲烷从煤的生物源生成的方法，所述方法包括将由权利要求22所述 的方法鉴定的限定的微生物聚集体连同所述底物、反应物或辅因子一起引入煤床中。
全文摘要
本发明描述了鉴定在含烃地层中用于甲烷的生物源生成的刺激剂的方法。方法包括用于确定基因产物(即是在烃到甲烷的转化涉及的多种途径中的酶)的微生物核酸序列信息的使用。由本发明的方法鉴定的酶和刺激剂能够例如通过添加至煤层和煤层气井在用于提高生物源甲烷的生成的工艺中使用。
文档编号E21B43/22GK102027195SQ200980116909
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月12日 优先权日2008年5月12日
发明者E·J·马瑟, G·V·托莱多, J·C·文特尔, T·H·理查德森, U·斯汀吉尔 申请人:合成基因组股份有限公司