专利名称：相位/光强复合型生物分子相互作用实时检测方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及用来实现检测两个以上生物分子如蛋白质-蛋白质、受体-配体、核酸-蛋白质、生物-蛋白质和核酸-核酸等之间相互作用状况的方法及用该方法的设备。
利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)原理，构建生物分子相互作用实时检测分析系统，实现对生物分子相互作用的监测和分析，有两条技术途径一条是基于SPR原理的光强检测方法，即通过探测生物分子相互作用时引起反射光的光强变化，获取有关生物信息。瑞典发玛西亚生物技术有限公司(Pharmacia Biatech)的BIAtite和Biacore 1000，2000，3000等系列产品就是采用这种方法，其检测原理如
图1所示，由半导体激光器1发出的激光以临界角透过棱镜2、垫补层3(其作用是消除棱镜2与玻璃基片4之间的气隙)和玻璃基片4，射到玻璃基片4与透明生物传感层6的界面上，产生反射，反射光的强度基本上等于入射光的强度。但是，在玻璃基片4上镀一层50nm厚的金膜5之后，入射光的一部分能量就会和金膜表面的自由电子作用，激起共振，沿共振波传播方向衰减，从而引起反射光的强度在一特定的角度方向上大大减弱，甚至消失，反射光消失时光的入射角度称为共振角。共振角随传感层表面的折射率发生变化，折射率又随从样品槽7中流过的样品里的生物分子与传感层上固定的生物分子作用情况发生变化，即随生物分子相互作用的强弱、多少和快慢而变化。反射光由光电探测器8接收，转换成电信号，而后由计算机读入处理，可从中得到有关生物信息。另一条是基于SPR原理的相位检测法，即通过探测生物分子相互作用时引起的反射光的相位变化，获取有关生物信息。本发明人的“生物分子相互作用实时相位检测分析方法及其系统”(申请号99107780.6)就是采用这种方法，其检测原理如图2所示。由横向塞曼激光器9发出的“尾光”通过检偏器19后被光电探测器18接收，转换成电信号，作为参考信号输入双向差动数字鉴相相位卡20。由横向塞曼激光器输出端发出的激光从梯形棱镜10的一个腰面射入，射到底面与金膜11的界面上，金膜11下覆盖耦联层12和配体分子13，入射光从该界面反射，透过另一腰面后又通过检偏器16，被光电探测器17接收，转换成电信号，作为测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡20。相位卡20对输入的参考信号与测量信号进行差动数字鉴相，得到相位差数据，由计算机21读入，进行基于相位的处理和分析，获得有关生物信息。
上述这两种方法都可以进行检测生物分子间的相互作用，分析分子间如何结合和分离，强度多少和速度是多少，是否有空间异位效应等。光强检测法是通过探测光强的变化来反映传感层表面折射率的变化情况，即生物分子相互作用的强弱、多少和快慢情况，折射率变化与作用状况对应，结构简单，但光源光强会波动，光强是直流信号，处理电路会有直流漂移，它们都影响测量精度，且分辨率有限，要提高分辨率会导致电路太复杂。相位检测法是通过探测相位变化来反映传感层表面引起的光程变化，即生物分子相互作用的强弱，多少和速率的状况，光程(相位)变化与作用状况对应。同时，相位信号是交流信号，比前者稳定。可是，这两种方法都存在不足，前者对结合的强弱和变化最为敏感，后者对结合的速率与多少更为敏感。因此，在面对不同的生物分子相互作用时，两种不同的方法都有可能丢失一些很有意义的生物信息。
本发明的目的在于克服上述每种方法的局限性，提供一种新的生物分子相互作用实时检测方法及其用于该方法的生物分子相互作用实时检测系统。使其同时具有上述两种方法的优点，即不仅可以通过检测反射光的光强变化，而且可以通过检测反射光的相位变化，由此得到生物分子之间的多种信息，更重要的是得到生物分子的结构与功能之间的关系及其功能特征等。而且具有灵敏度高，结构简单，容易实现的优点。
本发明提出一种采用相位/光强复合型测量的生物分子相互作用实时检测方法，包括以下步骤1)由横向塞曼激光器全反射端透过的“尾光”，通过检偏器后被光电探测器接收，转换成电信号，作为相位检测的参考信号输入差动数字鉴相相位卡；2)由横向塞曼激光器输出端发出的激光从等腰梯形/三角形棱镜的一个腰面射入，射到该棱镜的底面与与镀在其底面的覆盖有生物传感层的金膜的界面上，入射光从该界面反射后透过该棱镜的另一个腰面，射到析光镜上，一部分反射，另一部分透过；3)该反射部分被光电探测器接收，转换成电信号，作为光强检测法信号输入前置处理电路，该透过部分在通过检偏器后被光电探测器接收，转换成电信号，作为相位检测的测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡；4)所说的前置处理电路对输入信号进行处理，得到数字光强变化数据，所说的相位卡对输入的测量与参考两路信号进行处理，得到数字相位变化数据，两种数据由计算机读入，用预先编制的软件分别进行基于光强和相位的处理和分析，更进一步对两种数据进行综合分析和比较。
本发明提出一种采用上述检测方法的生物分子相互作用实时相位/光强复合检测分析系统，由生物传感单元、输样单元和信号处理单元三大部分组成，其特征在于，所说的生物传感单元由等腰梯形/三角形棱镜和镀在其底面的金膜、覆盖在金膜上的生物传感层，以及置于其下的样品槽构成的传感器的核心部件；置于该棱镜一侧的横向塞曼激光器及设置在该激光器的全反射端的检偏器、探测器构成参考臂，置于该棱镜另一侧的输出光轴上的析光镜，置于析光镜的透射光路上的检偏器和一个光电探测器及置于析光镜的反射光路上的另一个光电探测器构成测量臂，所说的射到析光镜上的光，一部分反射后被探测器接收，转换成光强法检测信号，另一部分透过，经检偏器后被光电探测器接收，转换成相位检测的测量信号；所说的信号处理单元由双向差动数字鉴相相位卡、前置处理电路、计算机及存储在其中的预先编制的软件组成。
本发明所说的横向塞曼激光器的频差可在30～500KHz之间，所说的梯形棱镜底面镀的金膜厚度可在30～50nm之间，所说的生物传感层可由依次覆盖在该金膜上的共价固定的嗜水性高分子基体层和配体生物分子层构成；所说的梯形棱镜与光电探测器之间的检偏器，横向塞曼激光器与光电探测器之间的检偏器可安装在与光轴成45°夹角的位置上，所说的析光镜是相位/光强复合型生物分子相互作用实时检测的关键元件，它将激光器发出的光分成两路，实现一路检测光强变化，而另一路检测相位变化，并置于反射光路中梯形棱镜与检偏器之间与光轴成22.5°夹角的位置上。
上述系统中的双向差动数字鉴相相位卡，是在现场可编程阵列器件中，通过编程实现的一块电路板；所说的前置处理电路是由一片12位A/D和一片双向存储体器件组成的一块电路板；这两块电路板插入计算机的通用插槽中。
本发明的方法及其用于该方法的系统的工作原理为由横向塞曼激光器的全反射面透过的“尾光”经检偏器后被光电探测器接收，转换成电信号，作为相位检测的参考信号输入双向差动数字鉴相相位卡。由横向塞曼激光器的输出端发出的激光从梯形棱镜10的一个腰面上射入，射到底面与金膜的表面上，金膜上覆盖耦联层，耦联层上耦联配体。入射光从该界面反射，透过另一腰面射到析光镜上，一部分反射后被光电探测器按收，转换成电信号，输入前置处理电路，经处理后得到数字光强变化数据，另一部分透过析光镜，经过检偏器后被光电探测器接收，转换成电信号，作为相位检测的测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡。相位卡对输入的测量与参考两路信号进行差动数字鉴相，得到数字相位差数据。样品从样品槽中流过，受体与配体结合，结合的强度、多少和速度不一，前置处理电路得到的数字光强变化数据和相位卡得到的数字相位差数据随之变。计算机实时从前置处理电路中读取光强变化数据和从相位卡中读取相位差数据，可分别进行基于光强和相位的数据处理和分析，对两种数据进行综合分析和比较，得到生物分子相互作用的各种信息，甚至还可能发现新的信息。
本发明的突出特点在于其一，它能同时通过探测发生在金膜表面上的生物分子相互作用时引起反射光的相位和光强变化，经鉴相处理得到数字相位差数据，和经前置处理电路后得到数字光强度变化数据，再由计算机读入这两种数据。
其二，本发明用预先编制的软件首次同时进行基于相位和光强的处理分析；更重要的是对这两种数据进行综合分析和比较，得到比较全面的有关生物信息。例如比较光强和相位变化曲线的上升或下降的斜率以及高度，得到空间耦联结构变化和信号传导特征，尤其是得到生物分子的结构、功能之间的关系及其功能特征等。
其三，本发明仅采用一光学元件析光镜，将激光器发出的光分成两路，一路检测光强变化，而另一路检测相位变化，实现了相位/光强复合型生物分子相互作用实时检测，具有灵敏度高，结构简单，容易实现的优点。
其四，本发明可以实现实时检测生物分子的相互作用，得到生物分子间如何结合和解离，结合和解离的强度和速度大小，是否存在空间异位效应等住处，而且可进行综合分析，得到空间耦联结构变化，信号传导特征、抗原决定族图示分析以及结构与功能关系等许多信息。
附图简要说明图1为已有的一种光强检测法生物分子相互作用检测原理示意图。
图2为已知的一种相位检测法生物分子相互作用检测原理示意图。
图3为本发明的相位/光强复合型生物分子相互作用检测系统示意图。
图4为本发明的计算机进行相位和光强信号综合分析的流程图。
下面结合附图，对采用本发明的SPR相位/光强检测方法的生物分子相互作用实时检测分析系统的实施例进行说明。
本实施例由基于相位/光强检测的SPR生物传感单元、取样单元和信号处理单元三大部分组成，如图3所示。其中，相位/光强检测SPR生物传感单元包括横向塞曼激光器9、检偏器16、19，探测器17、18、23，析光镜22，由梯形棱镜10和镀在其底面上的金膜11、覆盖在金膜11上的耦联层12和耦联在耦联层上的配体13，以及置于其下的样品槽15构成的传感器的核心部件，输样单元包括通过单向阀20、22相连的选样器25，输样器27；信号处理单元包括前置处理电路24、双向差动数字鉴相相位卡20和计算机21。
本实施例的工作原理为选样器25在计算机控制下选定所需的样品，打开阀门26。接着，输样器27在计算机的控制下将样品吸入。样品吸入后，阀门26关闭，阀门28打开，输样器27缓缓将样品输送到样品槽中(选样器25和输样器27作为本发明人的前一申请专利内容，这里不赘述)。由横向塞曼激光器9输出端发出的激光透过梯形棱镜10的一个腰面，射到梯形棱镜10的底面与金膜11的界面上，并从该界面反射，透过梯形棱镜10的另一腰面，射到析光镜22上。入射光一部分经析光镜22反射后被光电探测器23接收，转换成电信号，另一部分透过析光镜22，又通过检偏器16后被光电探测器17接收，转换成电信号。当样品流过样品槽15，样品中的受体分子14与传感层上的配体分子13结合，反射光的光强和相位都发生变化，探测器23探测光强变化，输入前置处理电路24实时处理，得到数字光强变化数据，探测器16探测相位变化，作为相位检测的测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡20。由横向塞曼激光器9的全反射面透过的“尾光”经检偏器19后被光电探测器18接收，转换成电信号，作为相位检测的参考信号输入到双向差动数字鉴相相位卡20。相位卡20实时对同时到达的测量信号和参考信号进行处理，得到数字相位差数据。
计算机21读入数字光强变化数据和数字相位差数据，可由预先编制并存储在计算机中的软件程序分别进行处理和分析，更进一步对两种数据进行综合分析和比较。其处理步骤如图4所示，包括1)计算机读取相位与光强处理数据或对应曲线的数据；2)先比较结合速率或曲线上升斜率；3)接着比较平衡状态或曲线平衡的幅值；4)再比较解脱速率或曲线下降斜率；5)还要综合分析比较结果；6)最后给出所对应的生物学意义。
通过分析，可以得到更详细的生物分子间如何结合和解离，结合和解离的强度和速度是多少，是否存在空间异位效应，空间耦联的结构变化，信号传导特征以及结构与功能关系等许多生物信息，还可能获得未发现的信息，可用以指导新的探索。
权利要求
1.一种相位/光强复合型生物分子相互作用实时检测方法，包括以下步骤1)由横向塞曼激光器全反射端透过的“尾光”，通过检偏器后被光电探测器接收，转换成电信号，作为相位检测的参考信号输入差动数字鉴相相位卡；2)由横向塞曼激光器输出端发出的激光从等腰梯形/三角形棱镜的一个腰面射入，射到该棱镜的底面与镀在其底面的覆盖有生物传感层的金膜的界面上，入射光从该界面反射后透过该棱镜的另一个腰面，射到析光镜上，一部分反射，另一部分透过；3)该反射部分被光电探测器接收，转换成电信号，作为光强检测法信号输入前置处理电路，该透过部分在通过检偏器后被光电探测器接收，转换成电信号，作为相位检测的测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡；4)所说的前置处理电路对输入信号进行处理，得到数字光强变化数据，所说的相位卡对输入的测量与参考两路信号进行处理，得到数字相位变化数据，两种数据由计算机读入，用预先编制的软件分别进行基于光强和相位的处理和分析，更进一步对两种数据进行综合分析和比较。
2.一种采用如权利要求1所述的检测方法的检测分析系统，由生物传感单元、输样单元和信号处理单元三大部分组成，所说的生物传感单元由等腰梯形/三角形梭镜和镀在其底面的金膜、覆盖在金膜上的生物传感层，以及置于其下的样品槽构成的传感器的核心部件；其特征在于，置于该棱镜一侧的横向塞曼激光器及设置在该激光器的全反射端的检偏器、探测器构成参考臂，置于该棱镜另一侧的输出光轴上的析光镜，置于析光镜的透射光路上的检偏器和一个光电探测器及置于析光镜的反射光路上的另一个光电探测器构成测量臂，所说的射到析光镜上的光，一部分反射后被探测器接收，转换成光强法检测信号，另一部分透过，经检偏器后被光电探测器接收，转换成相位检测的测量信号；所说的信号处理单元由双向差动数字鉴相相位卡、前置处理电路、计算机及存储在其中的预先编制的软件组成。
3.如权利要求2所述的的检测分析系统，其特征在于，所说的横向塞曼激光器的频差在30～500KHz之间。
4.如权利要求2所述的的检测分析系统，其特征在于，所说的梯形棱镜底面镀的金膜厚度在30～50nm之间。
5.如权利要求2所述的的检测分析系统，其特征在于，所说的生物传感层可由依次覆盖在该金膜上的共价固定的嗜水性高分子基体层和配体生物分子层构成。
6.如权利要求2所述的的检测分析系统，其特征在于，所说的梯形棱镜与光电探测器之间的检偏器，横向塞曼激光器与光电探测器之间的检偏器安装在与光轴成45°夹角的位置上。
7.如权利要求2所述的的检测分析系统，其特征在于，所说的析光镜置于反射光路中梯形棱镜与检偏器之间与光轴成22.5°夹角的位置上。
8.如权利要求2所述的的检测分析系统，其特征在于，上述系统中的双向差动数字鉴相相位卡，是在现场可编程阵列器件中，通过编程实现的一块电路板；所说的前置处理电路是由一片12位A/D和一片双向存储体器件组成的一块电路板；这两块电路板插入计算机的通用插槽中。
全文摘要
本发明属于生物技术领域,由生物传感单元、输样单元和信号处理单元三大部分组成,其特点是采用一光学元件析光镜,将激光器发出的光分成两路,一路检测光强变化,而另一路检测相位变化,实现了相位/光强复合型生物分子相互作用实时检测,由此得到生物分子之间的多种信息,尤其是得到生物分子的结构、功能之间的关系及其功能特征等。而且具有灵敏度高,结构简单,容易实现的优点。
文档编号G01N21/17GK1272624SQ0010913
公开日2000年11月8日 申请日期2000年6月9日 优先权日2000年6月9日
发明者余兴龙 申请人:清华大学