专利名称：光度型表面等离激元共振生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及表面等离激元共振生物传感器的设计。
生物传感器是一种生物分子识别机制与感受器材相结合而成的仪器，它利用生物学的检测和识别机制作用于靶分子，结合物理化学的传感技术把生物识别转换为有用的输出信号。由于生物传感器在生物分子结构和功能分析上的重要作用，生物传感技术在近二十年得到了迅速的发展。
表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)生物传感技术是在80年代中后期才发展起来的一门新兴技术，它通过将生物大分子相互作用的信号转变成光信号，再把光信号转变为电信号，并由计算机进行数据的采集和分析处理，以实现实时监测生物大分子之间相互作用的目的。其工作原理如
图1所示在两种不同折射率物质的界面如玻璃和水，从光密物质11(如玻璃)射向光疏物质12(如水)的光会部分反射和部分折射。当入射光角度大于某一临界值时，折射光消失，即发生全反射。尽管如此，在光疏物质中仍存在一种非均匀的沿界面方向传播的电磁场，其振幅在界面法向以指数衰减，称为衰减波(evanescent wave)。
如果在两种物质之间覆盖上一层金属薄膜13，使用单色p-偏振光(其电矢量与入射光平面平行)，在特定的入射角θ，即θ满足n0(ω/c)sinθ＝(ω/c){εr’/(εr’+1)}1/2...................(1)(ω为激光角频率，c为真空中的光速，n0为棱镜的折射率，εr’为金属相对电介常数的实部)时，衰减波会与金属表面传播的一种由金属自由电子气集体振荡产生的电荷密度波—(surface plasma wave，SPW)耦合，入射光的能量将部分耦合到表面等离子波中去，在全反射区域产生一个明显的衰减峰，此现象被称作表面等离激元共振(surface plasmon resonance，SPR)，产生衰减峰的入射角称为SPR角。
SPR角与多种因素有关。其一是衰减波传播的介质折射率，即非光照一侧介质的折射率。在SPR生物传感器用于生物大分子相互作用研究的过程中，固定其它影响因素，通过观测生物大分子吸附到金属膜表面以及溶液中的大分子与表面大分子相互作用引起介质折射率变化而产生的SPR角度变化，可得到吸附量的变化信息。如图2所示，图中，曲线a为加样前光强～SPR角关系，曲线b为加样后光强～SPR角关系，光强变化ΔA对应一定的SPR角变化ΔθSPR。SPR谱谱峰峰位θSPR对金属膜表面的光学折射率变化非常敏感，对于波长为670nm的红光，Phizichy等人用放射性标记不同分子量的蛋白质分子，测量了蛋白质在金膜表面吸附造成的谱峰位移，并且测量金膜表面吸附蛋白质的密度，得出谱峰位移与金膜表面吸附的蛋白密度有线性关系。
传统的SPR生物传感器基于上述原理，实验时先在金属表面固定受体分子，观测由于样品池中配体与固定受体的相互作用引起的SPR角位移，这种仪器可称为角度型SPR生物传感器。1984年瑞典Pharmacia公司开始进行角度型SPR生物传感器的商品化研制工作，1986年成立了专门的生物传感器公司来推动该项目的实施，并于1990年推出了第一台商用SPR生物传感仪--BIAcore。该仪器包括加样在内的全部测量分析过程都由计算机程序控制自动完成。我国的角度型SPR生物传感器的研制工作起步稍晚，清华大学物理系的陈皓明教授等人在80年代末研制了一台角度型SPR仪，并于1990年交由生物系的隋森芳教授使用。
上述角度型SPR生物传感器由主机31、主控制箱32、电机驱动电源33和计算机34四部分构成，如图3所示，各部分组成及工作原理分别说明如下主机包括底座311、大小两个转盘312和313、分别带动大小转盘转动的电机314和315，激光器316和光电池317。
电机驱动电源33给主机电机314和315供电并通过输出信号控制其转动；主控制箱32给激光器316供电并且接收和放大光电池317的输出电信号；计算机34对电源信号进行控制并且对进行测量结果分析处理。
激光器发出的激光透过三棱镜318，经紧贴在棱镜一侧的敏感膜反射后由光电池接收。测量时，计算机输出信号控制小转盘转动，激光入射角发生变化；大转盘以小转盘二倍的角速度转动，以保证反射光总是打在光电池上。光电池输出的信号由计算机处理，得到反射光强随激光入射角的变化曲线SPR曲线。SPR曲线经二次拟合后得到SPR角，由SPR角的变化得到敏感芯片表面生物分子相互作用情况。
实践证明，角度型SPR生物传感器具有所需样品少，检测速度快，精度高，样品不需标记，实时检测等优点，因此它在生物大分子相互作用研究中得到越来越广泛的应用。然而，高精度角度型SPR生物传感器需要沉重的底座和精密的转盘、电机，这使仪器过于笨重和昂贵，一般只适用于实验室研究，很难在临床检测中推广使用。
本发明的目的是为克服角度型SPR生物传感器的缺点，研制了一种新型光度型SPR生物传感器，该仪器采用固定入射光角度，利用检测反射光光强的变化来探测敏感芯片上生物大分子相互作用的信息。具有体积小，重量轻，使用方便，便于携带等优点，非常便于SPR检测技术在临床上推广使用。
其工作原理简述如下当敏感芯片表面的生物大分子相互作用引起金膜表面的介质折射率发生改变时，SPR角会发生一定的位移。如果激光器的入射光角度不随测量过程发生变化，而是固定在适当位置，介质折射率变化会导致反射光光强发生明显变化。本光度型SPR生物传感器通过光电池采集反射光强信号并输入计算机处理，由光强变化得到敏感芯片表面生物大分子相互作用情况。
本发明的特点体积小(整个机身部分尺寸大约为10×20×10cm3，远小于实验室用SPR生物传感器)，重量轻不足1kg，远远低于角度型SPR生物传感器近100kg，因而具有使用方便，便于携带等优点，这些都非常便于SPR检测技术在临床上推广使用。
附图简要说明图1为SPR生物传感技术工作原理示意图。
图2为光强随SPR角变化曲线示意图。
图3为已有的角度型SPR生物传感器组成示意图。
图4为本发明的光度型SPR生物传感器总体构成示意图。
图5为本发明的光度型SPR生物传感器主机结构示意图。
图6为本发明的电机已复位信号发生电路原理图。
图7为本发明的电机复位控制电路原理图。
图8为本发明的电路复位及预热脉冲发生电路原理图。
图9为本发明的电机通断电控制电路原理图。
图10为本发明的LOGO连线示意图。
图11为本发明的信号采集电路原理图。
图12为本发明的扫描结果(选用样品为小牛血清白蛋白BSA)。
图13为本发明的测量结果(选用样品为小牛血清白蛋白BSA)。
本发明设计的一种光度型SPR生物传感器的实施例结合各附图详细说明如下本发明的光度型SPR生物传感器组成结构如图4所示，它由主机41，控制电路42和计算机43三部分组成，各部分的实施例分别说明如下一、本发明主机包括光学单元，机械单元和进样单元三部分。
1、光学单元实施例由HL6711G半导体激光器411，其波长为λ＝670mm，等腰直角三棱镜412，其折射率为n＝1.8和2CR33光电池413组成。
激光器411发出的p-偏振光，经棱镜的一侧入射，经紧贴在棱镜底面与样品池底侧的敏感膜敏感芯片414反射后到达紧贴在棱镜另一侧的光电池413上，光电池把采集到的光强转换为电信号输出。
2、机械单元包括机身，直流电机，摇臂415和其它固定件。
机身由平台417、支柱418、机身底座419构成；平台417通过支柱418被固定在机身底座419上，平台上放有棱镜412，棱镜底面上固定着样品池，激光束从一个侧面入射，在另一个侧面出射，并被光电池接受。
固定件包括激光器、光电池、样品池和电机的常规固定附件。光电池的固定件要注意散热，本实施例选用大面积的传热良导体铝块420。激光器固定在由直流电机驱动的摇臂上，激光器通过摇臂的转动可调节其入射到棱镜的角度，以适应不同的样品。
本实施例采用瑞士MINIMOTOR公司生产的带有编码器(Encoder)的直流电机，6它包括编码器，电机和减速箱三部分。
编码器型号为03A5，有一个转盘与电机相连，可随电机同时转动，转盘上有一些等角度间隔的缝隙(本型号为15线)，在转盘的两侧分别有一个发光二极管和一个光控三极管。
编码器的一个周期电机转动1/15周＝24°，而实际输出的转动角度只有24°的1/17386，即实际的分辨本领约是0.0014°，保证了测量的精度。
编码器的输出是准正弦波，需要经施密特触发器转换为方波，才便于计算机处理。在本实施例中选用了TTL结构的六施密特反相器74LS14，该片子的两个阈值约是0.9V和1.2V。在+5V供电下准正弦波的电压范围约是0-2.7V，故可直接将编码器的输出连到反相器的输入上，反相器的输出就是整形后的方波。
电机型号为2233，直流供电，额定电压12V，转速与供电电压及负载力矩有关。实际选择供电电压5V，通过计算负载力矩设计转速为1o/sec。
精密减速箱型号为22/2，减速比为173861，即电机转动17386周，减速箱的输出转动1周。
3、进样单元包括进样泵，进样管道，样品池416三部分，均可采用常规技术手段实现。
进样泵的实施例采用微量注射泵，进样管道为极细的透明塑料管，样品池材料为聚四氟乙烯，样品池容积只有50μl，顶端有进样口和出样口与管道相连。
二、本发明的控制电路主要包括电机控制电路和信号采集电路。
电机控制电路控制电机的转动，本实施例分为电机已复位信号发生电路如图6所示，电机复位控制电路如图7所示，电路复位及预热脉冲发生电路如图8所示，电机通断电控制电路图8所示和SIEMENS公司的LOGO！通用逻辑控制模块如图9所示。信号采集电路主要是一个运算放大电路如图10所示。
1、电机控制电路临床检测用SPR生物传感器的控制是通过计算机进行的，控制电路实际是计算机和主机之间的接口。计算机发出的控制信号通过电路对电机进行各种操作。另外，电路还包括一始状态D触发器输出低电平，第一个脉冲使输出翻转成高电平，指示电机应处于通电状态，再来脉冲使输出翻回低电平，指示电机停止。另有一路电平信号指示电机是正转还是反转。
使用D触发器的清零(复位)功能，还可方便地实现电路复位，在电路出现问题时可随时手动将电路复位到初始状态。
对电机的操作即控制其正转或反转，对于单个直流电机，就是控制给它正向供电还是反向供电。本发明中采用有光电隔离继电器的可编程逻辑控制器(Programmable Logic Controller，PLC)，以增强抗干扰能力。
本实施例采用SIEMENS公司的LOGO！系列通用逻辑控制模块，这种逻辑控制模块与通常的PLC相比，完成开关量的控制非常方便，而且功能齐全(计时器，计数器等)；有操作按钮和显示面板，模块化的编程方式使参数改变简单灵活，无须懂得梯形图(PLC的编程方法)；集成程度高，体积仅为72×90×55mm3，价格低，特别适合于小型机器如阀门、电机的控制。其型号为LOGO！24R，24V直流供电，6位数字量输入和4位继电器输出。可通过一个或多个数字输入量的逻辑组合(与或非、延时等)控制输出继电器开关的通断。
选用LOGO！后，控制电路的设计大大得到简化，只需将计算机的控制信号(包括计算机输出的电机通、断电信号，复位信号，指示电机正转还是反转的电平信号，光电开关的电机复位信号等)经过适当处理，就可输入LOGO！中，由它来控制了。所谓适当处理，包括利用D触发器将脉冲转化为电平，经过跟随器以增加带负载能力，电阻分压进行电平匹配等。
控制电路的各电路单元分别说明如下电机已复位信号发生电路如图6所示复位信号是确定电机到达复位或初始位置的控制信号。电路中采用一个光耦，即发光二极管B2和光控三极管T。平时电机不在初始位置时，B2的光照射到T上使T导通，X点为低电平，输出给LOGO！和PC的复位信号为低电平。当电机转动到起始位置时，固定在摇臂上的一个挡板将光耦的光挡住，三极管T截止，这时给出的复位信号为高电平，指示电机已复位。用两种复位电压信号分别给LOGO！和PC是因为两者接收的数字信号的电平不同。PC是一般的TTL电平，5V是高电平，LOGO！则认为15V到24V的电压为高电平，这部分电路采用24V供电也正是为了给LOGO！提供足够高的电平信号。后加的运放目的是增加带负载的能力。
电机复位控制电路如图7所示这部分电路是将PC发出的电机复位信号由脉冲转换为电平提供。计算机发出的复位脉冲由A2输入给一个比较器，从TTL电平转换为18V CMOS电平，经过一个跟随器后，再通过一个或门进入D触发器进行转换。或门的另一个输入是R25和R13组成的分压电路，用于手动复位功能，按动开关K1产生手动复位脉冲输出给或门，不管是计算机发出的复位脉冲还是手动发出的脉冲，都可经过或门输出给D触发器。D触发器的置位端S接地，即不进行置位，复位端R接或门的输出，当电机复位后，就将D触发器清零恢复初始状态。
电路复位及预热脉冲发生电路如图8所示是一个给整个电路复位的脉冲发生电路。当电路加电时，电容C1开始充电，并输入连接成比较器的两个运放，由于两个比较器的比较电压不同，连法不同，则输出在不同时间产生不同方向的跳变(一个由高到低，一个由低到高)，经过一个或门后输出一个负向的脉冲，再经另一个比较器后反相成为一个正向脉冲。这个脉冲用来清除D触发器使电路复位。由于电路一加电时就会产生这个脉冲，所以也用这个脉冲来作为预热的信号，因为激光器需要预热一段时间才能稳定工作。把这个脉冲输给LOGO！，由它来进行预热的延时控制，延时的时间可以方便的在LOGO！上进行设置。
在延时期间为了避免电路工作，LOGO！利用这个脉冲控制图9中的开关K3，使其断开，这样计算机发出的电机转动信号就不能到达D触发器。只有当预热结束时，LOGO！控制开关K3闭合，电路才能正常工作。不过在这期间，电机的复位操作还是可以进行的。
图8中的开关K2是手动的电路复位及预热按钮。当按下K2时，C1通过一个小电阻快速放电，当松开按钮以后，所发生的情况就如同电路刚加电时一样。这个按钮可以在电路工作不正常时将电路复位到初始状态，但是还要等一段预热的时间才能开始工作。
当计算机发出电机转或停(由发送的顺序区别)的脉冲时，就通过这个电路来将信号传递给LOGO！，由LOGO！根据逻辑关系控制继电器的开关。这部分电路与电机复位的控制电路(图7)很相似，主要功能一是完成从脉冲信号向电平的转换，二是将信号由TTL电平转换为CMOS电平，以与LOGO！的电平相匹配。
电机通断电控制电路如图9所示图中开关K3的作用前面提到过，它在电路预热期间防止误发信号导致电机动作。这个开关不象K1和K2是面板上的按钮，它是LOGO！的一路继电器输出，因为预热的时间控制是由LOGO！来完成的。30k的电阻是后加的，如果没有，在预热期间K3是断开的，D触发器的时钟输入端CP就处于悬空状态，这就会引起错误的输出；加上电阻使CP在预热时一直处于低电平，不会发生错误翻转，预热过后就可以由运放的输出来决定电平高低了。
以上控制电路的几部分是电路的主体，主要用于计算机控制信号的转换以及一些手动操作的功能。前面说过，仪器中有不少地方需要直流供电，电路板的其余部分就是一些直流稳压电源。其中包括给LOGO！供电的+24V电源，给各种CMOS芯片供电的+18V电源以及给激光器和电机供电的±5V电源。这些电源都使用78，79系列的集成稳压块，且加适当的散热片以防止过热。其中7824给LOGO！供电，由于LOGO！的工作电流比较大，消耗功率比较高，所以7824的散热片要做得更大一些。这里有一点要提及，给电机供电之所以要做±5V两个电源，是因为LOGO！24R的继电器输出不够用了。用单电源给电机供电还能让电压换向，至少要用4个单独的开关。不过LOGO！的新型号增加了输入输出端的个数，价格也不贵很多。
在改用直流电机后，又附加了一些器件以适应直流的要求。直流电机要求计算机有一路信号指示电机是正转还是反转，这个信号也要经过一个比较器转换电平后再输给LOGO！；电机编码器的输出信号要经过74LS14整形后才能输给计算机；光电池的电压信号也要经过一个运放放大后才能输入到A/D板去，这三个片子电路板上最初是没有的。调试电路时，还增加了一些小电容滤波，抑制毛刺干扰，不过这与直流无关。
LOGO连线如图10所示在各种信号经过电平转换输入到LOGO！后，逻辑控制的问题就交由它来处理。图中显示了LOGO！24R的各个输入输出引线。其中L接+24V直流，供给LOGO！工作电压，N是地。I1～I6是6个数字输入端，输入小于5V时认为是0，高于15V认为是1。其中I1～I4所对应的D1～D4就是前面电路中所标的四个信号。I5作为进样器的控制，I6是指示电机正转还是反转的控制信号。Q1～Q4是四个继电器开关输出，通过I1～I6的逻辑关系控制这四路开关的状态。其中Q2串联在进样器上用作它的控制，Q3在预热时用于禁止电路动作。当加电或按动手动电路复位按钮时，I4有一个脉冲输入，LOGO！接收到这个脉冲后，延迟一段时间(预热期)再将Q3接通，使电路能够工作。Q1和Q4用作对电机的转动控制，同时只能有一路接通，分别给电机提供+5V和-5V直流电，电机正转或反转。当有电机转动信号I3＝1(电机转)和方向信号I6＝1(正转)时，Q1闭合，Q4断开，提供+5V电压，电机正向转动；当I3＝1且I6＝0(反转)或者有使电机复位的信号I2时，Q1断开，Q4闭合，提供-5V电压，电机反转。
为了防止Q1和FQ4同时闭合使电源短路，要求程序在进行换向控制时，先断开当前闭合的开关，让两个开关都处于断开状态，使电机停转(这个时间要求足够长，以便电机能停下来，使惯性充分体现，这样程序中的修正才会准确)，然后再闭合另一个开关，使电机换向。为确保不发生短路，在Q4闭合的逻辑关系中，加入了Q1的反这一项，使Q1和Q4不能同时为1。
以上介绍了控制电路的设计，包括各部分电路和LOGO！的作用。通过电路可以控制SPR仪的动作，完成测量SPR谱的整个过程。
2、信号采集与放大电路信号的发送和数据的采集都要依靠计算机进行控制，本实施例硬件上使用一块A/D板来实现，如图11所示。
由中国大恒公司生产的AC1057型50kHZ多功能12位A/D板适用于IBM PC及兼容机；具有16路单端输入，可设置成单极性的0～10V输入或双极性的-5V～+5V输入；输入开关选择放大器，可对输入信号进行G＝1，2，10倍的增益；转换精度可达千分之一(G＝1，2)或千分之二(G＝10)；自带8255芯片能进行24路可编程数字I/O，可方便地构成廉价模拟信号采样系统。
光电池的电压信号经放大后由A/D采样读入，电机的控制信号(正反转，停止，复位)由8255端口输出控制电路，电机编码器的输出脉冲及电机回到初始状态的复位信号也由8255的端口读入计算机。
三、计算机计算机分硬件和软件两部分。本实施例硬件包括IBM PC兼容机和AC1057型50Khz多功能12位A/D板(中国大恒公司)。软件用Visual Basic语言编写。
应用光度型SPR生物传感器检测时，计算机发出的信号通过电机控制电路使电机停留在恰当的位置，激光入射角在测量过程中保持不变。激光束经敏感芯片反射后由固定在棱镜另一侧的光电池接收，光强信号转换为电信号输出，通过放大电路放大，经A/D板转换为数字信号，最后输入计算机进行处理。
软件所控制的SPR生物传感器的具体分为两步1.定位激光器。由于不同敏感芯片之间存在一定的差异，每次测量时使反射光强变化最大的θ0都有所不同。为了得到最佳测量效果，每次测量前都要与敏感芯片相适应的θ0。如果把θSPR对应的反射光强认为是零，SPR曲线峰谷差为ΔA0；则5％ΔA0反射光强对应的入射角小于θSPR为θ0。执行软件菜单中“扫描”命令，电机逆时针旋转复位，当激光器摇臂与光电开关K相碰时，电机停止复位，此位置即是扫描起始点。稍后电机顺时针方向旋转，扫描开始。扫描结果得到反射光随时间变化曲线，即通常的SPR扫描曲线图12，由曲线可以计算得到θ0。扫描规定角度后电机反转回到扫描起始点，然后电机顺时针方向旋转使入射角至θ0。电机先反转至其始位置，可以最大限度减少电机转动惯性带来的误差。
2.测量。执行菜单中的“测量”命令，可以得到规定时间范围内的反射光强变化。在此时间范围内，先加入缓冲液得到基线的位置，然后加入待测样品，由光强变化大小确定样品浓度。
采用本实施例进行的生物大分子与敏感膜相互作用实验，其中敏感膜选用普通金膜，待测样品选用小牛血清白蛋白BSA，扫描和测量结果分别如图12和图13所示。图12中符号“+”对应入射角度为θ0，图13中箭头所指位置代表加入BSA，其前面一段为基线。反射光强在BSA加入后有一个明显上升，说明仪器对于生物大分子与敏感膜相互作用引起敏感膜表面折射率变化有较高的测量灵敏度。
权利要求
1.一种光度型表面等离激元共振生物传感器，包括主机，控制电路和计算机三部分组成，其特征在于，所说的主机包括由棱镜，紧贴在棱镜底侧的敏感膜敏感芯片，置于该棱镜一侧的半导体激光器，紧贴在棱镜另一侧的光电池组成的光学单元；由进样泵，进样管道，样品池组成的进样单元及由固定该棱镜、敏感膜敏感芯片、光电池和样品池的机身，固定该激光器的摇臂和驱动该摇臂的直流电机构成的机械单元；所说的控制电路由与该电机和计算机相连的控制电机工作的电机控制电路和与该光电池和计算机相连的信号采集电路；所说的计算机储存有对电机进行控制和对光电信号进行处理的软件程序。
全文摘要
本发明属于生物技术领域,包括主机,控制电路和计算机三部分组成,主机包括由棱镜,敏感膜敏感芯片,半导体激光器组成的光学单元;由进样泵,进样管道,样品池组成的进样单元及由机身,摇臂和直流电机构成的机械单元;控制电路由电机控制电路和信号采集电路组成;所说的计算机储存有对电机进行控制和对光电信号进行处理的软件程序。本发明具有体积小,重量轻,使用方便,便于携带等优点,非常便于SPR检测技术在临床上推广使用。
文档编号G01N33/50GK1278062SQ0010943
公开日2000年12月27日 申请日期2000年6月23日 优先权日2000年6月23日
发明者隋森芳 申请人:清华大学, 山东滨州东力电气集团总公司