专利名称：一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术，尤其涉及一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法。
羊胎盘中含有近百种促进机体组织细胞代谢和修复的有效成份，随着近年来生物制药技术的进步，获得较纯的羊胎盘内的蛋白和多肽组分已成为可能，然而目前所采用的传统提取方法为从食品工艺中衍生过来的方法，(如中国专利申请号98101188和98115761所述)，不仅仅过于粗糙，提取的所谓的羊胎素实际上是羊胎盘中所有的结构蛋白质和功能蛋白质及多糖的混合物，具有免疫原性，根本不能药用，同时由于酶降解、蛋白质变性、温度变化等因素的影响，所提取的物质生物活性差、专一性弱只用于美容化妆等行业，可以说用现有的方法提取羊胎素，不仅提取不到羊胎素而且浪费了大量的宝贵的羊胎盘资源。
本发明的目的就是为了克服现有羊胎素提取方法的缺陷，而提供的一种具有纯度高、匀一性好、生物活性强和得率多、成本低等特点的一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法。
实现本发明目的的技术方案是一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特点是，包括抽提和盐析、超滤和脱盐、透析和浓缩、以及羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析(以下简称CM-SephadexC50柱层析)四个步骤；所述的抽提和盐析的步骤包括将新鲜或冷冻的羊胎剪除胎膜和大血管，洗净残余的血块，切碎，再在组织捣碎机中反复捣碎，制成匀浆；将该匀浆在冰浴中搅拌，弃沉淀，取上清液再搅拌，盐析沉淀，即得到含有羊胎素的粗提物；所述的超滤和脱盐的步骤包括先在截留值为30000千道尔顿～4000道尔顿的过滤机中初滤，再在摄氏0-15度的低温条件下采用截留值为100道尔顿～800道尔顿的过滤机进行分级超滤和脱盐；所述的透析和浓缩的步骤包括将粗提物用少量冷去离子水溶解后，再彻底透析；收集透析液并浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度；所述的CM-SephadexC50柱层析步骤包括将羊胎素粗提物浓缩液透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的CM-SephedexC50(2.5×50cm)柱进行洗脱，得到第一个蛋白峰；待该蛋白峰下降至基线位置时，再递次用上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰和第三个蛋白峰；分别收集上述CMF1、CMF2和CMF3组份，分别命名为羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待测其蛋白质浓度和生物活性。
上述一种新的提取纯化羊胎素工艺，其中，所述的将羊胎盘制成匀浆的要求是在1℃～6℃的条件下，每公斤组织块加入含0.5mmol/L苯甲基璜酰氟(以下简称PMSF)的0.15mol/L硫酸铵溶液2L，在组织捣碎机中反复捣碎3分钟，制成匀浆。
上述一种新的提取纯化羊胎素工艺，其中，所述的透析是将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值＜4000的透析袋内，在1℃-4℃下不断搅拌，对水彻底透析。
一种检测羊胎素生物学活性的方法，其特点是，包括分子量测定和氨基酸组成分析两大步骤；所述的分子量测定是采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳法，其步骤为将标准蛋白和待测蛋白样品加入等体积的样品缓冲液中混匀后，加热，然后按预定顺序电泳；当样品开始进入上层胶中时，逐渐被浓缩；当染料前沿进入分离胶时，并达到分离胶底部时，剥胶并标记；脱色后测量从分离胶起始处到标记染料区带及蛋白区带中心位置的距离；然后以标准蛋白分子量对数为纵坐标，以相对迁移率(Rm)为横坐标，在半对数坐标纸上作出标准曲线；根据待测蛋白的Rm值在标准曲线上算出其对应的分子量。
所述的氨基酸组成分析方法在基酸自动分析仪上进行。
所述的羊胎素组份生物活性的测定采用氚-胸腺嘧啶核苷(以下简称3H-TdR)掺入法进行，其步骤为取成纤维细胞经0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于培养板上，24小时后换培养液，置于37℃，5％CO2饱和湿度条件下继续培养；次日加入倍比稀释的羊胎素不同组份，同条件下继续培养。48小时后结束培养，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多头细胞搜集器收集细胞于玻璃纤维滤片上，水洗后固定，再烘干，置闪烁液中，通过仪器测各样品管的cpm值；再以含羊胎素组份的蛋白质浓度为横坐标，以每孔的cpm数为纵坐标，描记3H-TdR掺入曲线，其中一个活性单位(ED50)定义为最大刺激活性一半时所需的羊胎素组份的含量。
上述方法，其中，所述的缓冲液由10％聚乙酰胺12-烷基磺酰钠(以下简称SDS)、1％硫基乙醇、0.01mol/LPH7.8磷酸钠构成。
上述方法，其中，所述的电泳的电泳体系是浓缩胶浓度为3％，PH6.8，分离胶浓度为15％，PH8.8。
上述方法，其中，所述的浓缩时间约为40分钟-50分钟。
上述方法，其中 上述方法，其中，所述的闪烁液为0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液。
由于本发明采用了以上的技术方案，采用现代生物技术提取纯化羊胎盘蛋白组分，明显的优于目前公开材料所报道的方法，用该方法所获得的羊胎素具有纯度高、匀一性好、生物活性强和得率多、成本低等特点，有极大的实用价值。
本发明通过使用现代生物制药技术，提取纯化羊胎盘组分1，组份2和组份3，分别命名为羊胎素1，羊胎素2，羊胎素3。并进一步建立检测其生物活性的方法。为进一步开发和利用羊胎素提供了一条可行的途径。
下面结合实施例和附图进一步说明本发明的特征和优点。
图1是本发明羊胎素的分离纯化的流程图。
本发明主要包括使用硫酸胺盐抽提，盐析沉淀，低温离心，低温超滤，阳离子交换层析等方法进行分离纯化羊胎素和建立羊胎素活性检测方法两方面的内容。
羊胎素的分离纯化的流程见图1。
羊胎素的分离纯化的步骤是(1)抽提和盐析将新鲜或冷冻的羊胎剪除胎膜和大血管，用生理盐水洗净残余的血块，绞碎，称湿重，在4℃条件下，每kg组织块加入含0.5mmol/LPMSF的0.15mol/L硫酸铵溶液2L，用DS-l型组织捣碎机反复捣碎3分钟，制成匀浆。用6mol/LHCL将匀浆液的PH调至4.5，冰浴中机械搅拌2小时，然后7500rpm/min离心60分钟，弃沉淀，上清液用lmol/LNaOH调节PH至6.0，该上清液在不断搅拌下缓慢加入固体(NH4)2SO4粉230g/L，盐析沉淀。次日7500rpm/min，离心60分钟，弃沉淀，所得上清液再加入固体硫酸铵粉300g/L，盐析沉淀，7500rpm/min，离心60分钟，弃上清液，所得到的沉淀即为含有羊胎素的粗提物。超滤超滤装置的选择根据条件可选用浅道系统超滤装置或封闭系统有搅拌装置或中空纤维系统超滤装置，其中以中空纤维超滤装置效率最佳。为降低投资成本本方法选用了中国科学院上海原子核研究所生产的SINR的板框式超滤设备。
超滤膜的选择膜的选择主要包括两个方面，一方面是膜截留值分子量的选择，主要根据被处理的物质的分子量大小和要求达到得分离效果来选择膜，如被分离的物质的分子量为25000KD，要达到90％的分离效果，则可选择膜截留值为20000KD，如要达到100％的分离效果可选择截留值为10000KD或更小的膜。另一方面选择分离效果比较好滤出速度又比较快的膜。本方法选择了中科院上海原子核所研制的超滤膜，先选用截留值为4000道尔顿，纯水流量为30-40升/平方米/小时的SPK高分子合金无菌超滤膜，然后再选用截留值为600道尔顿的SPK高分子合金无菌超滤膜，在0-10度的低温条件下进行分级超滤和脱盐，获得了极佳的分离效果(可用色谱分析法测定分离物的纯度)。透析和浓缩将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值＜4000的透析袋内，在4℃下不断搅拌，对水彻底透析；收集透析液并浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度。CM-SephadexC50柱层析将羊胎素粗提物浓缩液20-40ml，对0.1mol/LPH6.0PBS透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的CM-SephedexC50(2.5×50cm)柱，在核酸蛋白检测仪和记录仪的监测下进行洗脱，流速为50ml/hr，可得到第一个蛋白峰(CMF1)，待蛋白峰下降至基线位置时，再递次用含0.15mol/LNaCL和0.6mol/LNaCL的上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰(CMF2)和第三个蛋白峰(CMF3)。分别收集上述CMF1、CMF2和CMF3组份，分别命名为羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待测其蛋白质浓度和生物活性。
上述3个组份经生物活性检测发现对3T3细胞有很强的促细胞分裂活性，其中含0.6mol/1NaCL的缓冲液洗脱物CM3d的生物活性最高。1kg羊胎盘经上述步骤纯化后可得到的羊胎素、羊胎素、羊胎素3，产率分别为400～450mg、200～250mg、和40～60mg。
本发明羊胎素生物学检测的方法包括分子量测定、氨基酸组成分析、羊胎素组份生物活性的测定采用3H-TdR掺入法1.分子量测定采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳(SodiumDodeySulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE)法测定分子量将标准蛋白和待测蛋白样品加入等体积的样品缓冲液中(10％SDS-1％硫基乙醇-0.01mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液)混匀后，在沸水中加热3分钟，然后按预定顺序加入同一电泳体系(浓缩胶浓度为3％，PH6.8，分离胶浓度为15％，PH8.8)中电泳，上槽正极，下槽负极。电压调至50V(约8V/CM)，样品开始进入上层胶中，逐渐被浓缩(约40-50分钟)。当染料前沿进入分离胶(下层)时，电压调至120V，继续电泳，直至溴酚兰达到分离胶底部，调电压至零，切断电源。剥胶并标记。将整块分离胶浸没在0.25％考马斯亮蓝R250溶液中染色5小时。取出凝胶，用水漂洗数次后放入脱色液中脱色。脱色后测量从分离胶起始处到染料区带及蛋白区带中心位置的距离。然后以标准蛋白分子量对数为纵坐标，以相对迁移率(Rm)为横坐标，在半对数坐标纸上作出标准曲线。根据待测蛋白的Rm值在标准曲线上算出其对应的分子量。 2.氨基酸组成分析在日立835-50型氨基酸自动分析仪上进行(分析前处理6NHCL，110℃，20小时水解，样品浓度0.6ml/ml)，由中科院生化所协助完成。
3.羊胎素组份生物活性的测定(3H-TdR掺入法)取3T3成纤维细胞，0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，用含10％小牛血清的培养液按2×104/mm3密度接种于96孔培养板上，24小时后换含0.5％小牛血清的DMEM培养液，置于37℃，5％CO2饱和湿度条件下继续培养。次日加入倍比稀释的羊胎素不同组份，同条件下继续培养。48小时后，每孔加含3H-TdR的DMEM液50μl(1μci)，继续培养4小时后结束培养，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多头细胞搜集器收集细胞于玻璃纤维滤片上，蒸馏水洗6次后，5％三氯醋酸固定，60-80℃烘干1小时，置闪烁液(0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液)中，自动液闪计数仪测各样品管的cpm值。以含羊胎素组份的蛋白质浓度为横坐标，以每孔的cpm数为纵坐标，描记3H-TdR掺入曲线，其中一个活性单位(ED50)定义为最大刺激活性一半时所需的羊胎素组份的含量。
含不同羊胎素的提取物对3T3细胞活性的影响见图5。
当在无血清的培养液中加入10ng/ml的羊胎素3后(见图9)，微血管内皮细胞CMEC和动脉血管平滑细胞ASMC的CPM值分别从2459±268.90和1699.4±203.96增加到4807.0±326.72和3260.4±268.67，增加的百分比分别为95.47％和91.90％，差异极显著(P＜0.01)。
本发明羊胎素含有较多的免疫球蛋白、活性多糖、生长激素、细胞活性因子，是一种具有高度生物活性的促进细胞代谢和防止衰老的生物活性物质。研究证明其对促进表皮细胞增殖、延缓细胞凋亡、增加细胞传代等生物学特点使其具有极高的潜在应用价值，并能刺激肝细胞再生，具有增强免疫功能、提高机体的抵抗力、以及美容和延缓衰老的作用，目前羊胎素的组合物在香港市场的售价已达500港币/ml。本发明羊胎素除具有上述作用外，还可能对所有中胚层来源的细胞都具有促增殖和分裂作用，因此，它能对生殖系统、造血系统、心血管系统、神经和内分泌系统产生广泛的影响，可进一步开发出如增加脑细胞活力、增强记忆力、改善老年人思维的生物制剂和增强造血机能、促进心肌细胞和肝细胞修复的新型生物药物。
权利要求
1.一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特征在于，包括抽提和盐析、超滤和脱盐、透析和浓缩、以及羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析四个步骤；所述的抽提和盐析的步骤包括将新鲜或冷冻的羊胎剪除胎膜和大血管，洗净残余的血块，切碎，再在组织捣碎机中反复捣碎，制成匀浆；将该匀浆在冰浴中搅拌，弃沉淀，取上清液再搅拌，盐析沉淀，即得到含有羊胎素的粗提物；所述的超滤和脱盐的步骤包括先在截留值为30000千道尔顿～4000道尔顿的过滤机中初滤，再在摄氏0-15度的低温条件下采用截留值为100道尔顿～800道尔顿的超滤器进行分级超滤和脱盐；所述的透析和浓缩的步骤包括将粗提物用少量冷去离子水溶解后，再彻底透析；收集透析液并浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度；所述的羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析步骤包括将羊胎素粗提物浓缩液透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析柱进行洗脱，得到第一个蛋白峰；待该蛋白峰下降至基线位置时，再递次用上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰和第三个蛋白峰；分别收集上述CMF1、CMF2和CMF3组份，分别命名为羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待测其蛋白质浓度和生物活性。
2.根据权利要求1所述的一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特征在于，所述的将羊胎盘制成匀浆的要求是在1℃～6℃的条件下，每公斤组织块加入含0.5mmol/L苯甲基璜酰氟的0.15mol/L硫酸铵溶液2L，在组织捣碎机中反复捣碎3分钟，制成匀浆。
3.根据权利要求1所述的一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特征在于，所述的透析是将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值＜4000的透析袋内，在1℃-4℃下不断搅拌，对水彻底透析。
4.一种检测羊胎素生物学活性的方法，其特征在于，包括分子量测定和氨基酸组成分析两大步骤；所述的分子量测定是采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳法，其步骤为将标准蛋白和待测蛋白样品加入等体积的样品缓冲液中混匀后，加热，然后按预定顺序电泳；当样品开始进入上层胶中时，逐渐被浓缩；当染料前沿进入分离胶时，并达到分离胶底部时，剥胶并标记；脱色后测量从分离胶起始处到标记染料区带及蛋白区带中心位置的距离；然后以标准蛋白分子量对数为纵坐标，以相对迁移率(Rm)为横坐标，在半对数坐标纸上作出标准曲线；根据待测蛋白的Rm值在标准曲线上算出其对应的分子量。所述的氨基酸组成分析方法在基酸自动分析仪上进行。所述的羊胎素组份生物活性的测定采用氚-胸腺嘧啶核苷掺入法进行，其步骤为取成纤维细胞经0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于培养板上，24小时后换培养液，置于37℃，5％CO2饱和湿度条件下继续培养；次日加入倍比稀释的羊胎素不同组份，同条件下继续培养。48小时后结束培养，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多头细胞搜集器收集细胞于玻璃纤维滤片上，水洗后固定，再烘干，置闪烁液中，通过仪器测各样品管的cpm值；再以含羊胎素组份的蛋白质浓度为横坐标，以每孔的cpm数为纵坐标，描记氚-胸腺嘧啶核苷掺入曲线，其中一个活性单位(ED50)定义为最大刺激活性一半时所需的羊胎素组份的含量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液由10％聚乙酰胺12-烷基磺酰钠、1％硫基乙醇、0.01mol/LPH7.8磷酸钠构成。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的电泳的电泳体系是浓缩胶浓度为3％，PH6.8，分离胶浓度为15％，PH8.8。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的浓缩时间约为40分钟-50分钟。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的闪烁液为0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液。
全文摘要
本发明公开了一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法,采用现代生物技术提取纯化羊胎盘蛋白组份,主要包括采用匀浆、盐沉淀(硫酸胺盐或氯化钠盐)、低温离心、低温超滤、葡聚糖层析、核酸蛋白检测和氨基酸组成分析等步骤,用该方法所获得的羊胎素具有纯度高、匀一性好、生物活性强和得率多、成本低等优点,有极大的实用价值。
文档编号G01N27/26GK1333294SQ00119440
公开日2002年1月30日 申请日期2000年7月11日 优先权日2000年7月11日
发明者张建军 申请人:张建军