专利名称：一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的方法和试剂。
乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)存在于乙肝病毒丹氏颗粒(Dane颗粒)的核心和乙型肝炎患者的肝细胞核内，是乙型肝炎病毒直接复制指标。由于血清内极少有游离HBcAg，故用常规方法不能检出。有人曾公开了一种检测乙肝病毒核心抗原的方法，将乙肝病毒表面抗体和乙肝病毒核心抗体同时包被到微孔板(例如聚苯乙烯微孔板)上，乙肝病毒表面抗体与乙肝病毒氏颗粒表面抗原结合，然后在微孔板上加入裂解剂，乙肝病毒氏颗粒壳裂解，暴露出乙肝病毒核心抗原，游离的乙肝病毒核心抗原被微孔板上的乙肝病毒核心抗体所吸附，再在微孔板中加入过氧化物酶标记的乙肝病毒核心抗体，过氧化物酶与加入的底物反应，最终达到检测乙肝病毒核心抗原的目的。上述方法，在包被抗体方面，采用的是针对HBsAg和HBcAg的免疫球蛋白即多抗包被，凡本专业的技术人员都知道，多抗作为包被抗体，其抗体效价低、特异性差，在实验过程中常常易产生很重的本底，其检测结果的灵敏底低，且操作流程长。另外，上述方法用多抗包被，捕获血清中乙肝病毒颗料的能力有限，很难达到实际临床检验的要求。
本发明的目的的就是针对上述现有技术存在的问题，提供一种能达到实际临床检验要求、操作流程较短、适合各基层医疗单位使用的直接检测乙肝病毒核心核原的方法和试剂。
本发明的技术方案是一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的方法，包括以下步骤将单克隆表面抗体MC-抗-HBs和单克隆核心抗体MC-抗-HBc同时包被于固相载体上，洗涤、拍干后，加入待检血清，然后加入促进剂抗-HBs，洗涤后加入裂解剂NP-40溶液，洗涤后加入酶标记物HRP-抗-HBc，洗涤后加入底物显色液显色，加终止液终止反应，比色判定结果。
上述HRP-抗-HBc的工作浓度为1∶300～1500，MC-抗-HBc的工作浓度为1∶300～3000，MC-抗-HBs的工作浓度为1∶200～1000，促进剂抗-HBs0.3～400mg/ml，裂解剂NP-40溶液由1～9％NP-40、0.05～1.5％巯基乙醇、0.05～1.0M pH7.5Tris缓冲液组成。
本发明还提供了一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的试剂，主要组成为具有单克隆表面抗体和单克隆核心抗体双抗体包被的微孔板；促进剂抗-HBs；裂解剂NP-40溶液；酶标记核心抗体HRP-抗-HBc。
上述试剂中MC-抗-HBc的工作浓渡为1∶300～3000；MC-抗-HBs的工作浓度为1∶200～1000；HRP-抗-HBc的工作浓度为1∶300～1500；促进剂抗-HBs为0.3～400mg/ml；裂解剂NP-40溶液由1～9％NP-40、0.05～15％巯基乙醇、0.05～1.0M pH7.5的Tris缓冲液组成。
本发明由于采用单克隆抗体包被，其单克隆抗体不但效价高、特异性好，而且实验过程中，本底干净，检测灵敏度高。而且本发明中使用的促进剂抗-HBs，是利用促进剂中所含生物活性物质与预先包被在固相上的单克隆表明抗体一起，与乙肝病毒Dane颗粒形成一种特殊的免疫复合物，从而最大限度固相乙肝病毒颗粒，使裂解后的HBsAg释放量相应增多，进而使本发明的核心抗原阳性检出率显著提高。本发明人对临床164例乙肝e抗原阳性患者血清进行核心抗原检测，结果，加入促进剂抗-HBs检出核心抗原阳性120例，阳性检出率73.2％，不加促进剂检出核心抗原阳性44例，阳性检出率26.8％。本发明用于检测血清乙肝病毒核心抗原与HBV-DNA探针阳性符合率为91.4％接近分子生物学的HBV-DNA探针水平，达到实际临床检验要求，而且由于本发明操作简单，快速、实用性强，适合各基层医疗单位使用。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
乙型肝炎的Dane颗粒内含有HBcAg，Dane颗粒的外被是HBsAg，血清中如有Dane颗粒，经裂解剂裂解可使HBcAg暴露游离。根据抗原抗体复合物的形成及乙肝病毒抗原至少有两个能与抗体结合的位点，将MC-抗-HBs、MC-抗-HBc同时包被于固相载体(微孔板)上，可使样品中的HBsAg与载体上的抗-HBs形成固相HBsAg·抗-HBs免疫复合物，该复合物的HBsAg若具有Dane颗粒，在微孔板内经裂解剂裂解，HBcAg即释放于孔内并与原来固相于孔内的抗-HBc结合，形成固相HBcAg抗-HBc免疫复合物，该复合物的HBcAg可与加入的抗-HBc酶标记物结合，形成双抗体夹心。加入底物显色液可进行比色判定结果。但由于以上形成HBsAg·抗-HBs免疫复合物有限，使得裂解后的HBcAg释放量较少，其阳性检出率较低。本发明经过数千次实验探索，以抗-HBs作为促进剂，可以使血清中的HBsAg和载体上的固相化MC-抗-HBs形成更多的免疫复合物，使裂解后的HBcAg释放量也相应增多，从而使检出率大大提高，检测结果接近分子生物学的HBV-DNA探针水平。
实施例包被双抗体按常规方法将MC-抗-HBs和MC-抗-HBc同时包被于固相载体(聚氯乙烯微孔板或聚苯乙烯微孔板)上，MC-抗-HBc的工作浓度为1∶300～3000，MC-抗-HBs的工作浓度为1∶200～1000；用洗涤液洗涤3次，3分钟/次，拍干；将待检样本加入双抗体包被微孔板内，加入量100μl/孔，37℃下1小时；加促进剂0.3～400mg/ml的抗-HBs50μl/孔，置微型振荡器振荡1分钟，37℃置l小时；用洗涤液洗涤(同前)，加入l～9％NP-40、0.05～1.5％巯基乙醇、0.05～1.0M、PH7.5Tris缓冲液组成的裂解剂100μl/孔，37℃1小时；用洗涤液洗涤(同前)，加酶标记物HRP-抗-HBc(工作浓度1∶300～1500)100μl/孔，37℃1小时，用洗涤液洗4次，3分钟/次，拍干；每孔加l00μl底物显色液，振荡1分钟，室温5～20分钟；加2mol/L H2SO450μl/孔终止反应，比色判定结果。
上述洗涤液可采用1.0ml 25％吐温-20临用前洗入500ml 0.85～0.9％的生理盐水内。
上述底物缓冲液可按常规配制。
上述促进剂也可以采用抗-HBs和MC-抗-HBs的混合物。
本发明操作流程短，简便快速，本底干净，阴性、阳性反差明显，可与乙肝“二对半”同步检测，实用性强，便于临床推广运用。
本发明的试剂主要组成为具有单克隆表面抗体和单克隆核心抗体双抗体包被的微孔板(按常规方法将MC-抗-HBc和MC-抗-HBs包被于固相载体上，MC-抗-HBc的工作浓度为1∶300～3000，MC-抗-HBs的工作浓度为1∶200～1000)，0.3～400mg/ml的促进剂抗-HBs，由1～9％NP-40、0.05～1.5％巯基乙醇、0.05～1.0MPH7.5的Tris缓冲液组成的裂解剂，工作浓度为l∶300～1500的酶标记核心抗体HRP-抗-HBc。
权利要求
1.一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的方法，包括以下步骤将单克隆表面抗体MC-抗-HBs和单克隆核心抗体MC-抗-HBc同时包被于固相载体上，洗涤、拍干后，加入待检血清，然后加入促进剂抗-HBs，洗涤后加入裂解剂NP-40溶液，洗涤后加入酶标记物HRP-抗-HBc，洗涤后加入底物显色液显色，加终止液终止反应，比色判定结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是HRP-抗-HBc的工作浓度为1∶300～1500，MC-抗-HBc的工作浓度为1∶300～3000，MC-抗-HBs的工作浓度为1∶200～1000，促进剂抗-HBs为0.3～400mg/ml，裂解剂NP-40溶液由1～9％NP-40，0.05～1.5％巯基乙醇，0.05～1.0M PH7.5Tris缓冲液组成。
3.一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的试剂，主要组成为具有单克隆表面抗体和单克隆核心抗体双抗体包被的微孔板；促进剂抗-HBs；裂解剂NP-40溶液；酶标记核心抗体HRP-抗-HBc。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征是MC-抗-HBc的工作浓度为1∶300～3000；MC-抗-HBs的工作浓度为1∶200～1000；HRP-抗-HBc的工作浓度为1∶300～1500；促进剂抗-HBs为0.3～400mg/ml；裂解剂NP-40溶液由1～9％NP-40、0.05～1.5％巯基乙醇、0.05～1.0M PH7.5的Tris缓冲液组成。
全文摘要
本发明涉及一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原的方法和试剂,试剂主要组成为:具有MC－抗－HBc和MC－抗－HBs的双抗体包被载体、促进剂、裂解剂和HRP－抗－HBc。将待检样本加入双抗体包被载体内,加入促进剂、裂解剂、HRP－抗－HBc,加入底物显色,加终止液终止反应,比色判定结果。本发明与HBV－DNA探针阳性符合率为91.4%,达到实际临床检验要求,而且由于本发明操作简单、快速、实用性强,适合各基层医疗单位使用。
文档编号G01N33/53GK1352392SQ0013113
公开日2002年6月5日 申请日期2000年11月9日 优先权日2000年11月9日
发明者胡蔡香 申请人:武汉市第七医院