基因检测芯片、检测装置及检测方法

专利名称：基因检测芯片、检测装置及检测方法
技术领域：
本发明涉及用于检测基因的芯片，检测装置及检测方法，所述检测芯片，检测装置及检测方法，能够检测并分析基因碱基序列，除此之外，还有基因异常情况如DNA中的一个碱基置换SNP(人类遗传密码的变种)、多个碱基置换，占突变，基因缺失等。
背景技术：
所谓一个碱基置换SNP一般认为是在人的DNA碱基序列中1000bp到2000bp中有一个碱基的变化。不管是正常人还是病人，认为有从十万到数百万的SNP，人们正期待着SNP成为分析病因及预防疾病的有效标记。
所谓多个碱基置换是在基因碱基序列中有多个碱基变化。
所谓点突变是在已知基因中碱基序列中的一个碱基变化，由此可以发现翻译出的蛋白质的机能异常，有时成为疾病的原因。
所谓基因的易位是指碱基序列的顺序有一部分逆转，有时成为疾病的原因。
所谓基因的缺失是指一部分碱基序列欠缺。有时成为疾病的原因。
所谓基因的扩增是指一部分碱基序列重复。有时成为疾病的原因。
所谓三联体重复是三个碱基对重复延长。有时成为疾病的原因。
作为检测、分析基因DNA的碱基序列差异的手段，采用DNA测序法(碱基序列测定法)、PCR-SSCP(聚合酶链反应—单股链构象多态性(双脱氧链终止法)、等位基因特异杂交法、DNA芯片法等方法。
DNA测序法有Maxam-Gilbert(化学降解法)和Sanger-coulson法。现在主要使用Maxam-Gilbert(化学降解法)。在用PCR(聚合酶链反应)法扩增分析人的DNA区域之后，使用在PCR法中使用的引物或在扩增DNA内已设定的引物进行测序，决定该区域内DNA的序列。
PCR-SSCP法是用PCR法扩增分析的人的基因的区域后，由于热变性形成单链，将其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，由此使PCR法扩增的双链DNA的每个链形成二次结构(分子内氢键)。由于一个碱基序列的不同，所形成的二次结构(分子内氢键)不同，使得电泳距离不同，从而检测出基因的一个碱基置换SNP和点突变等。
等位基因特异杂交法是用PCR法扩增想要分析的区域后，在膜(尼龙过滤膜)区域内作成20个碱基程度的PCR产物或寡聚核苷酸探针，在此，将用放射性同位素32P等标记的DNA样品(被检DNA)杂交。调节其温度等杂交条件，用放射性同位素的强度差检测基因中的一个碱基SNP和点突变。
DNA芯片法在原理方面与等位基因特异杂交法几乎相同。它是将20个碱基程度的PCR产物或寡聚核苷酸探针排列在固定相(基盘上)，使其与荧光标记的DNA样品(被检DNA)杂交。通过调节温度等杂交条件，根据荧光强度的差别检测人基因中的一个碱基置换SNP等。
在等位基因特异杂交法中的杂交场合，由于使用放射性同位素标记DNA，所以放射性同位素的处理和管理需要较多的费用是一个问题。另外，在DNA芯片法的场合，使用荧光素标记，由于荧光素是大分子结构，在足够的频率下，荧光不能捕捉到DNA。荧光标记探针的荧光强度不高，更使得荧光褪色及玻璃等基盘有荧光(背景部分的荧光)成为问题。
为了解决这些问题，作为检测DNA杂交的形成、检测双链DNA的简单、高敏感度的好方法，将DNA探针固定在电极上，让该DNA探针在有嵌入化合物的情况下与DNA样品反应，用电化学方式检测双链DNA和杂交形成体，该方法已被公开。(参照特开平9-288080号公报及1996年第57届分析化学研讨会论文集P137-138)但是，基因中的一个碱基置换SNP和基因突变等的数量非常大，例如为了制作一个人的15KB密度(分辨率)的一个碱基置换SNP图，必须至少鉴定二百万的一个碱基置换SNP。另外，与已知疾病有关的基因点突变的数量也极多。采用现有的方法笼统地分析一个碱基置换和点突变在现实中几乎是不可能的。
本发明的目的就是解决上述现有的问题，以多个DNA样品为检测对象可以进行检测、分析大量的基因，即可以进行高处理的能力(高速、大量)的处理，而且可以提供高敏感度地检测和分析基因的鉴定装置。总之，本发明是特开平9-288080号公报记载的、根据电化学进行双链DNA的检测和杂交形成体的检测的原理，力图实现大量、高敏感度地检测、分析基因的装置。
而且本发明是力图实现在实际检测等操作中操作简单、容易作业的基因检测的方法、检测装置及检测芯片的发明。

发明内容
为了解决上述课题，本发明提供用于基因检测的芯片。其特征为有多个作为测定极的柱电极，并在所述柱电极和所述柱电极的配极的通用电极之间加电压，能够检测出电流。
本发明由于使用矩阵状排列的柱电极，可以同时分析大量的基因。
另外，具有可以在柱的前端和侧面固定基因、可以大量获得固定面积的优点。
另外，具有如下优点即，在平面电极上分注基因的场合，平面电极的表面有凹凸，不能均一固定，与此相比，将柱电极插入含有基因的液体中固定，即使柱电极的表面有凹凸，也能均一地固定一定量的基因。由于能固定一定量的基因，在定量分析方面精度、灵敏度高。
而且，本发明不必将含基因的液体分注，具有操作简便的优点。
由于本发明可以在用杂交法检测固定在柱电极上的基因探针和DNA样品后除去DNA样品，再次使另外的DNA样品杂交，所以能反复使用芯片。或者进行除去基因探针的处理，再次将另外的基因探针固定在柱电极上，因而可以反复将芯片用于不同的检测目的。
本发明的检测芯片也可以有所述柱电极的配极的与所述柱电极不接触的通用电极。
本发明中的检测芯片也可以容纳所述柱电极，同时具有能填充DNA样品的凹部。
在所述柱电极上也可以分别固定具有不同基因序列的基因。
在所述柱电极上也可以固定有不同基因序列的多个PCR产物，寡聚核苷酸、信使RNA、互补DNA，PNA(peptidic nucleic acid)，或LNA(lockednucleic acid)。
与本发明有关的其它的检测芯片也可以在所述柱电极上分别固定具有相同基因序列的基因。
在所述柱电极上也可以固定具有相同基因序列的PCR产物，寡聚核苷酸、信使RNA、互补DNA、PNA，或LNA。(locked nucleic acid LLC商标)该检测芯片在能够分别容纳所述柱电极的同时，还有可以填充DNA样品的多个凹部，也可以在这些凹部中分别填充不同的DNA样品。
所述检测基因的芯片对检测诸如基因的碱基序列、一个碱基置换SNP、多个碱基置换、点突变、易位、缺失、扩增或三联核糖醇是有用的。
所述电极也可以在其表面镀金。
所述电极也可以在其部分表面用树脂涂覆。
所述树脂也可以是PEEK(聚醚醚酮)或PTFE(聚四氟乙烯)。
所述用于检测基因的芯片有支撑柱电极的支撑部件构成，所述柱电极也可以突出设置在该支撑部件上。
此处所谓“突出设置”是指柱电极从以支撑部件为基座的支撑部件上突出设置。
所述柱电极也可以通过点电极突出设置在所述支撑部件上。
所谓“点电极”是指在支撑部件上的点上配置的电极。
所述用于检测基因的芯片有支撑柱电极的支撑部件而形成，所述柱电极的一端也可以镶嵌在该支撑部件上。
此处所谓“镶嵌”是指使柱电极的一端与设在支撑部件上的凹部嵌合，柱电极从支撑部件突出来。
所述支撑部件也可以是电路基板。
所述柱电极也可以使接触或镶嵌在所述支撑部件上的端部用环氧树脂或聚四氟乙烯包覆固定于支撑部件上。
在所述柱电极上只使不是接触或镶嵌在所述支撑部件上的端部的一端部固定基因，也可以在整个柱电极固定基因。
由于在柱电极表面所定的范围作了树脂涂层，也可以仅在没有涂覆的露出部分固定基因。
在所述用于检测基因芯片的内部存在空隙，所述柱电极也可以向该空隙内突出地设置在所述支撑部件上，所述通用电极的一部分或全部在该空隙内露出。
在芯片上也可以设置通向该空隙内的注入口，使得能够向该空隙内注入、排出基因样品和电解质等。
所述用于检测基因芯片具有主体部和可以与主体部结合的框架部。所述主体部在其内侧面有所述柱电极，所述框架部在与该主体部结合后其内侧面可以容纳柱电极，同时也可以有能够填充DNA样品的凹部。
所述主体部和所述框架部也可以自由拆装。
作为使主体部和框架部拆装自由地结合的结构，可以适当采用诸如在主体部或框架部中的任何一方设置凸部，在另一方设置凹部，该凸部和凹部可以形成扣合结构；用夹子、夹板等将两者夹住的结构；使一方相对另一方滑动、同时嵌合的结构；用磁铁使两部分相互吸着的结构等众所周知的方法。
为了解决上述问题，本发明提供一种用于检测基因的一碱基置换SNP和点突变的芯片，该芯片具有相互拆装自由的主体部和框架部，其特征在于，所述主体部在其内侧面有多个柱电极测定极呈矩阵状排列、并突出；所述框架部在其内侧面上安装有所述主体部时可以收纳所述多个柱电极，同时有能够填充DNA样品的凹部，在所述凹部内配有不与所述柱电极相接触的配极作为通用电极，所述柱电极固定有不同基因序列而生成的PCR产物或寡聚核苷酸；在所述通用电极和所述柱电极之间加电压，能够检测出电流。
另外，在本发明中所谓矩阵状是指多个柱电极相互平行地从规定的面上突出排列的状态。
所述柱电极以各种矩阵状排列，分别被插入由不同基因序列而成的PCR产物或寡聚核苷酸的收容部，这样也可以作为固定由不同基因序列而成的PCR产物或寡聚核苷酸的部件。
所述用于检测的芯片也可以用于基因诊断。使用本发明的检测用芯片进行的基因诊断，有时可以诊断是否具有涉及肌营养不良、血友病、苯丙酮酸尿症等单一基因病和糖尿病、癌、高血压、心肌梗塞、肥胖症等多因素基因病的基因；有时可以诊断发病前的基因，从而成为选择适当的治疗方法和药物的判断依据。
另外，本发明为了解决上述问题，提供所述基因检测用芯片和有能装入及取出该检测用芯片的测定装置的检测基因的装置。
所述检测用芯片也可以采用辉锑铁元素作为控制温度的手段控制温度。
而且本发明为了解决所述问题，提供了一种检测方法，使用所述基因检测芯片进行检测，其特征在于，在所述凹部内填充DNA样品或由DNA样品扩增形成的DNA，进行杂交形成双链，之后从所述凹部中除去所述DNA样品或由DNA样品扩增形成的DNA，经洗净后在所述凹部内填充含有电化学活性分子的电解质，使所述双链与所述电化学活性分子结合，之后在所述通用电极和所述柱电极之间加电压，检测流经的电流值。
或者说提供一种检测方法，使用所述基因检测芯片进行检测，其特征在于，在所述凹部内填充DNA样品或由DNA样品扩增形成的DNA和含有电化学活性分子的电解质，进行杂交形成双链，使所述双链与所述电化学活性分子键合，之后在所述通用电极和所述柱电极之间加电压，检测流经的电流值。
这样，用所述芯片进行杂交后使其与电化学活性分子键合或在电化学活性分子存在的情况下进行杂交，由此可以利用极简便的操作、以高精度和高灵敏度同时分析大量的基因。
在所述检测方法中也可以在控制温度的同时，进行所述双链与所述电化学活性分子的键合。
所述包含电化学活性分子的电解质也可以是二茂铁、邻苯二酚胺、金属联吡啶络合物、金属菲络合物、生物睾丸酮(ピオロ-ゲン)或把引入这些化合物的窝边型嵌入化合物作为有效成份。
特别优选二茂铁窝边型嵌入化合物。
所述包含电化学活性分子的电解质除上述外，也可将乙啡啶、溴化乙锭、吖啶、氨基吖啶、吖啶橙、二氨基吖啶、多诺霉素、D放线菌素、给体霉菌体(ド-ノマィシン)、丝裂霉素C、三(菲绕啉)锌络合物、三(菲绕啉)钌络合物、三(菲绕啉)钴络合物、二(菲绕啉)锌络合物、二(菲绕啉)钌络合物、二(菲绕啉)钴络合物、二吡啶粗铂络合物、粗铂络合物、菲绕啉粗铂络合物、三(二吡啶)锌络合物、三(二吡啶)钌络合物、三(二吡啶)钴络合物、二(联吡啶)锌络合物、二(联吡啶)钌络合物、二(联吡啶)钴络合物作为有效成份。


图1为说明本发明的检测基因装置的整体结构的立体图。
图2为说明本发明的检测基因芯片的整体结构的立体图。
图3(a)是图2(c)的A-A剖面图、图3(b)是图3(a)主要部分的放大图，图3(c)～图3(e)表示在电路基板上设置柱电极的各种结构。
图4是本发明相关的检测基因装置及检测用芯片的电极、配线等结构的说明图。
图5是图2的检测芯片的剖面图及主要部分的放大图。
图6是说明本发明相关的检测基因芯片使用状态的立体图。
图7是实验例3的测定结果。
图8是实验例4的测定结果。
具体实施例方式
以下参照附图，对与本发明相关的基因检测方法、检测装置和检测用芯片的实施例进行说明。附图只不过是本发明的一个实施例，不仅限于此。
在图1中涉及本发明的基因检测装置1由检测芯片2、有能插入检测芯片2的入口29的、能够检测分析杂交形成的双链DNA的测定装置3和微机35组成。
图2是检测用芯片2的结构示意图，图2(a)是表示检测用芯片2整体的立体图，该芯片呈卡状或盒状。在图2(b)中如分解的立体图所示，检测芯片2是由陶瓷和合成树脂等形成的框架4和装在该框架上的、能拆装的主体部5构成。
使主体部5对于框架4能开合自由地结合的结构，可以依靠例如在框架4和主体部5的触接面上各自形成能相互弹性地嵌合的凹凸。在本实施例中如图2(b)、(c)、图3(a)、图5(a)中所示，在主体部5和框架4上在避开柱电极排列的位置上，分别设置凸部6和凹部7，使之可以拆装。
使框架4和主体部5互相开合自由地结合的这种结构适宜采用诸如将两者或用夹子、夹板等固定，或用磁铁使它们互相吸引等公认的方法。
在框架4的中央处形成矩形的凹部8。在这个凹部8的周围附设封条9。这个凹部8如后所述能填充溶液(DNA样品、窝边式嵌合化合物、清洗液等)，通过将主体部5安装在框架4上进行封装。另外，将主体部5从框架4上拆卸，能迅速地进行凹部8内溶液的交换、混合及清洗等。
另一方面，在主体部5上，如图2(c)所示，在与框架4的凹部8相对应的区域均匀地突出设置有多个柱电极10。将主体部装在框架4上时，柱电极10突出的长度是插入凹部8内的长度。
图3(a)是图2(c)的A-A剖面图，表示主体部5的结构和柱电极10的突出设置状态。主体部5由在内侧壁11和外侧壁12之间设有电路基板13构成。电路基板13的端部露出，在该露出部分设置有柱电极用的接线端子20和通用电极用的接线端子(在图4中表示的27)。另外在电路基板13上形成包含配线(在图4中表示的21、22、23)等的电路。
如图3(a)，图3(b)所示，柱电极10构成从电路基板13贯通内侧壁11并突出出来。
柱电极10如图3(c)所示，也可以构成从外侧壁12贯通电路基板13和内侧壁11并突出出来。
柱电极10如图3(d)所示，也可以作成如下结构，主体部5插在基座14上设置电路基板13，在其上突出设置柱电极10。
或者如图3(e)所示，预先在电路基板13上真空镀敷多个点电极15，形成多个点电极15，在点电极15上也可以以电接触状态突出设置柱电极10。
如图6(b)放大图所示，在柱电极10的表面固定在PCR产物和寡聚核苷酸5’末端巯基化地导入SH基的SH化寡聚核苷酸16。PCR产物是双链DNA，在链的5’末端使其巯基化。导入SH基的这一寡聚核苷酸具有含20～50碱基的长度，通过导入其基端的巯基固定在柱电极10上。
该寡聚核苷酸的固定如图6(a)所示，可以靠把柱电极10插入有与柱电极10相同的间隔排列的DNA凹坑18的微量反应板17的各凹坑18内，同时对种类不同的DNA进行修饰。柱电极10的表面镀金，在镀金层上通过SH基固定SH化的寡聚核苷酸16的固定方法是众所周知的。
有关在柱电极的表面镀金前的预处理方法和SH-金结合的问题记载如(C.D.Bain)J.Am.Chem.Soc.111，P321，(1989)，和(JJ.Gooding)Anal.Chem.70，P2396，(1998)，而且用(C.D.Bain)J.Am.Chem.Soc，111，P321，(1989)上记载的方法等进行基因探针的清除。
多数柱电极10设置在电路基板13上，电也成为电路基板的一部分。并且如图2(c)所示，在主体部5的前端并列设置有接线端子20、27。
如图4(a)、图3(a)、图3(b)所示，柱电极10分别连接在电路基板上的配线21上。该配线21的另一端与接线端子20各自独立连接。
图4表示基因的电检测电路。如图4(a)所示，对于柱电极10的配线21也可以分别对应柱电极10一根根地连接，分别接在接线端子20上。如图4(b)所示，如设置有由薄膜晶体管组成的开关元件的有源矩阵型的薄膜晶体管液晶显示装置等的矩阵电极那样，在由大量的纵横导线22、23组成的矩阵配线的交叉部，各自矩阵配线的导线22、23和柱电极10也可以通过FET场效应晶体管24连接。当作成这样结构，纵横导线22、23扫描、选择的薄膜晶体管接通，特定的柱电极就可以电连接在接线端子上。
在本实施例中进一步具有图4所示的通用电极25。图4所示的通用电极是用于彻底说明电路结构，模式化记载的。实际上优选通用电极配置在凹部8。例如如图5(a)所示，通用电极25作为柱电极10的配极配置在凹部8的底面的一部分(例如周边等处)或底面的全部靠近凹部8的底面的四周等处。而且通用电极25设置在不与柱电极10接触的位置上。当在框架4上安装主体部5时，通用电极20如图5(b)中放大图所示，作成与主体部5的通用电极用的端子26接触的结构。而且这个通用电极用的端子26通过配线28接在通用电极用的接线端子27上。
另外，每个柱电极10和通用电极25即配极之间的电流值，在凹部8内的空间中填充后述的电解质溶液的情况下，以配线连接电解质溶液形成的参照电极(图中未显示)的值作为基准测定，从而在测定中得到正确的电流值，也可以作成如上的结构。
在测定装置的检测芯片入口(图1中的29)的内部，如图4(c)所示，连接通用电极的接线端子27和各柱电极的接线端子20，在通用电极的接线端子27和各柱电极的接线端子20之间配置有加电压电路30。
而且在通用电极的接线端子27和各柱电极的接线端子20之间加电压E时，使其结构能用设置在电路30上的检测器31检测、测定流经通用电极25和各柱电极10之间的电流。
另外，为了有选择地连接柱电极10的接线端子20，从入口29插入检测芯片2时，在测定装置3上设置有与各柱电极的接线端子20连接的接收端子32和在电路30上有选择地与接收端子32连接的扫描端子33。
根据这个检测出的电流测定的数据，用接在检测器31上的A-D变换器34等数字化，用微机35进行分析、鉴定DNA样品进行数据分析。
另外，在测定装置3上装备有由辉锑铁元素组成的温度控制装置(图中未显示)。用这个温度控制装置可以控制后述的杂交的温度条件。
对于由以上结构组成的本发明相关的检测装置1的作用进行说明。图6(a)为微量反应板17，其上的收容部18呈矩阵状排列，并与柱电极10保持相等距离。在该微量反应板17上的各收容部18内容纳种类相同或不同的DNA。
而且如图6(a)中所示，将检测用芯片2的主体部5的多个柱电极10分别插入收容部18。由此，如图6(b)表示的部分放大图，在各自的柱电极10上能够修饰种类相同或不同的DNA。
另一方面，在框架4的凹部8内注入DNA样品溶液进行填充，之后在这个凹部8内插入已修饰所述DNA的大量的柱电极10，将主体部5在框架4上凸部与凹部扣合安装。这样在凹部8内用封条9密封，通用电极25与主体部5的通用电极端子26接触。
另外DNA样品是用DNA分解酶或超声波处理分解从生物材料中提取的DNA得到的，或者由特定的基因利用PCR法(聚合酶链反应法)扩增的DNA。这些DNA样品在杂交之前先进行热处理使之变性。
在固定于柱电极上面的PCR产物或寡聚核苷酸的DNA(单链形态)上添加DNA样品(单链形态)，互补碱基序列的PCR产物或寡聚核苷酸的DNA和DNA样品可以杂交。
在杂交时，将检测用芯片2装入测定装置3内的入口29，用装在测定装置3内的由辉锑铁元素组成的温度控制装置控制杂交的温度条件。
进行杂交后，将检测用芯片2从测定装置3中取出，再将主体部5从框架4卸下，之后除去凹部8内的DNA样品溶液，在凹部8内注入清洗液，将没有进行杂交的DNA样品冲洗干净。
进行这样的清洗后，在凹部8内填充含有电化学活性分子的电解质溶液，把主体部5安装在框架4上。电化学活性分子具有改变杂交形成的双链DNA的电阻值等电性的机能。对此在特开平9-288080号公报中有详细说明。
在测定装置3上再次插入进行了这样处理的检测用芯片2，将检测芯片的通用电极用接线端子27和各柱电极用的接线端子20接在测定装置的接收端子32上，通过选择开关接在电压回路30上。在通用电极25和各柱电极10之间加上弱电压，在杂交形成的双链DNA和被连接的柱电极10上有微弱电流流过电压回路30和通用电极25。通过测定装置3内的辉锑铁元素控制温度，测定不同温度下的电流值。
在测定装置3中如图4(c)所示，能够对于各柱电极用的接线端子20及接收端子32转换扫描端子33(转换可以自动或手动，因为其结构不是本发明的要点，故省略说明。)，由此，电流顺次流过杂交后的双链DNA，用检测器31检测。
该检测结果用A-D变换器34变换成数字数据，作为测定数据用微机35存储在存储器等中。用该测定数据进行DNA样品的鉴定和分析。例如根据与预先储备的各类DNA数据进行比较，能够分析和鉴定DNA样品。
下面将说明本发明相关的基因的电化学检测装置的实验例。
(实验例1)在基因P53的第72密码子中表示的，一个碱基置换SNP检测的实验例。将具有以下两种相当于多型现象(遗传的多型性)的碱基序列的寡聚核苷酸分别对准柱电极10，使之固定。
P53Pro(第72密码子为Pro)P53Arg(第72密码子为Arg)对此，将DNA以及用该DNA扩增形成PCR产生物热变性后进行杂交反应，其中所述DNA是从正常人末梢血中提取的，P53第72密码子为pro，而其中所述扩增的PCR产物为包含密码子72的片断，该密码子存在于P53外显示4中。
从末稍血提取的DNAP53Pro的电流变化(％)52％P53Arg的电流变化(％)15％PCR产物P53Pro的电流变化(％)65％P53Arg的电流变化(％)13％进一步将DNA以及用该DNA扩增的PCR产物同样热变性后进行杂交，其中所述DNA是从正常人末梢血中提取的，P53第72密码子为Arg，而其中所述扩增的PCR产物为包含密码子72的片断，该密码子存在于P53外显示4中。
从末稍血提取的DNAP53Pro的电流变化(％)46％P53Arg的电流变化(％)17％PCR产物
P53Pro的电流变化(％)53％P53Arg的电流变化(％)11％可以认为在完全配对的碱基序列和错配的碱基序列中这些电流变化有显著的差别。
(实验例2)说明表示根据碱基置换的数量测定的电流值不同，能测定错配的量的实验例。将dT20，dT10dAdT9，dT8dA4dT8，dAdT19，dA3dT17，dT19dA，dT17dA3等七种寡聚核苷酸分别对准柱电极10使之固定，在此对dT20进行杂交反应。
在用于测定这些的电解质溶液(0.1M AcOH-AcOK(pH5.6)，0.1MKCI，0.05mM NFc)中，在20度时测定了470mV(Ag/AgCI参照电极基准)的杂交前后的电流值变化。
表1表示这一测定结果。
表1

在表1中电流变化大致随着错配碱基量而变化。特别是在末端部存在错配的情况下，可以看到比Tm值大的变化。在现有的SSCP中用这样的系列是检测不出的，而本方法初步明确。
(实验例3)表示对于mRNA表达量的定量的实验例。将在大肠菌乳来于操纵子上的Lacz基因上存在的唯一序列40个大小(设计为非高级结构)的寡聚核苷酸5’末端导入巯基的物质各自固定在柱电极10上(HS-ml60fmol)。
另外，将来自含有不同mRNA表达量的大肠菌的mRNA提取液放入不同的孔内。这个微量滴定板上的孔里浸着事先调制过的柱电极10，在2×SSC、室温、一小时的条件下进行杂交反应。在用于测定这些的电解质溶液(0.1M AcOH-AcOK(pH5.6)，0.1M KCI，0.05mM NFc)中，在20度时测定了470mV(Ag/AgCI参照电极基准)的杂交前后的电流值变化。
得到的测定结果如图7所示。由图7可知直到mRNA量达到60fmol，随着mRNA量的增加，电流变化△i(％)呈直线增加。
这样，本实施例说明了可以用fmol对mRNA的表达量进行定量。
实验例4表示检测基因的实验例。将来自爪蟾属的卵细胞细胞色素C的用于基因检测DNA探针(5’-HS-AAGGTTGATTACTGGAATGGGGACCTGTTA-3’)分别固定在柱电极10上，将包含不同DNA量的目的基因(与DNA探针互补的DNA)溶液放入微量滴定板上的不同孔内。这个微量滴定板的孔中浸没着事先调制过的柱电极10，在2×SSC、室温、一小时的条件下进行原位杂交反应。在用于测定这些的电解质溶液(0.1M AcOH-AcOK(pH5.6)，0.1MKCI，0.05mM NFc)中，在20度时测定了470mV(Ag/AgCI参照电极基准)的杂交前后的电流值变化。
得到的结果如图8所示。由图8可知能够检测数十～数百fmol的目的基因。另一方面，不含细胞色素C的DNA样品的电流变化几乎观察不到。
以上是本发明相关的基因的检测方法、检测装置及检测用芯片的实施例。但本发明并不特别限于这些实施例，在权利要求书中的技术事项的范围内有各种各样的实施方式。
产业上利用的可能性本发明相关的基因的检测方法、检测装置及检测芯片具有如上所述的结构，因此能够以高灵敏度、高速大量、简便地进行检测和基因。
这样一种高灵敏度、高速大量处理本发明的检测装置在生物学和医学领域中有助于分析基因与性状的关系。通过本发明基因的碱基序列、一个碱基置换SNP、多个碱基置换、点突变、易位、缺失、扩增或三联核糖醇的检测分析装置分析药物代谢酶、抗癌基因等特定的基因，也可用于基因诊断。
例如本发明相关的检测装置能高灵敏度、高速大量地处理，所以能用于收集有关日本人基因的数据，鉴定与发病有关的基因，对预测预防未来的疾病可以起到重要的作用。
另外，根据诊断基因也可以对选择适当的治疗方法或副作用小的药物起作用。
利用疾病的基因分析结果也可以不必反复进行临床实验就能开发新药。
本发明由能使检测用芯片相互拆装自由的主体部和框架部构成，在框架部上形成了能填充DNA样品溶液等的凹部，通过极简单的操作就能将DNA样品、窝边式夹层等的溶液填充或取出，同时能用清洗液简单地冲洗凹的内部。
在本发明中作为检测用芯片的测定极，在主体部内侧突出设置有排列成矩阵状的柱电极，所以将柱电极插入装有不同DNA的微量反应板上的收容部内，由此可以同时一次修饰(固定)种类不同的DNA。
权利要求
1.一种用于检测基因的芯片，具有多个柱电极作为测定极，其特征在于，在所述柱电极和所述柱电极的对极的通用电极之间加电压，能检测出电流。
2.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于还具有所述柱电极的对极，即通用电极，该电极不与所述柱电极接触。
3.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，还具有能够容纳所述柱电极的同时有可以填充DNA样品的凹部。
4.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，在所述柱电极上分别固定有具有不同基因序列的基因。
5.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，在所述柱电极上固定有具有不同DNA序列的多个PCR产物、寡聚核苷酸、mRNA、cDNA、PNA(肽核酸(peptidic nucleic acid))或LNA(locked nucleic acid；ProligoLLC商标)。
6.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，在所述柱电极上分别固定有具有相同基因序列的基因。
7.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，在所述柱电极上固定有具有相同基因序列的PCR产物、寡聚核苷酸、mRNA、cDNA、PNA(肽核酸(peptidic nucleic acid))或LNA(locked nucleic acid；Proligo LLC商标)。
8.如权利要求6所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，还具有能够各自容纳所述柱电极同时可以填充DNA样品的多个凹部，在该多个凹部中可以分别填充不同的DNA样品。
9.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，用于检测基因的碱基序列、一个碱基置换SNP，多个碱基置换、点突变、易位、缺失、扩增或三联核糖醇。
10.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，所述柱电极在其表面镀金而形成。
11.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于所述柱电极其部分表面用树脂涂覆而形成。
12.如权利要求11所述的用于检测基因的芯片，其特征在于所述树脂是PEEK或PTFE。
13.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，还具有支撑柱电极的支撑部件，所述柱电极突出设置于该支撑部件上。
14.如权利要求13所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，所述柱电极通过点电极突出设置于所述支撑部件上。
15.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，还具有支撑柱电极的支撑部件，所述柱电极的一端镶嵌在该支撑部件上。
16.如权利要求13所述的用于检测基因的芯片，所述支撑部件为电路基板。
17.如权利要求13所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，所述柱电极接触或镶嵌在所述支撑部件的端部，由环氧树脂或PTFE包覆并固定在支撑部件上。
18.如权利要求13所述的用于检测基因的芯片，其特征在于在所述柱电极中，只在不与所述支撑部件接触或嵌合的端部固定基因而形成。
19.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于在所述柱电极中，在整个柱电极上固定有基因。
20.如权利要求13所述的用于检测基因的芯片，其特征在于其内部有空隙，所述柱电极设于所述支撑部件上向该空隙内突出，所述通用电极的一部分或全部露出在该空隙内。
21.如权利要求1所述的用于检测基因的芯片，其特征在于具有主体部和能与该主体部结合的框架部，所述主体部在其内侧面具有所述柱电极，所述框架部在其内侧面具有当与该主体部结合时，能容纳所述柱电极同时可以填充DNA样品的凹部。
22.如权利要求21所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，所述主体部和所述框架部是装拆自由的。
23.一种用于检测基因的一个碱基置换SNP和点突变的芯片，具有装拆自由的主体部和框架部，其特征在于所述主体部具有在其内侧面矩阵状排列突出的作为测定极的多个柱电极，所述框架部在其内侧面具有当安装入所述主体部时可以接收所述多个柱电极同时可以填充DNA样品的凹部，在所述凹部中设置有不与所述柱电极接触而配置的对极，即，通用电极，所述柱电极固定有由不同的基因序列组成的PCR产物或寡聚核苷酸，在所述通用电极和所述柱电极之间加电压，能检测出电流。
24.如权利要求23所述的用于检测基因的芯片，其特征在于所述柱电极各自呈矩阵状排列有多个，通过插入收容不同基因序列组成的PCR产物或寡聚核苷酸的各收容部，所述不同基因序列形成的PCR产物或寡聚核苷被固定。
25.如权利要求1～24中的任一项所述的用于检测基因的芯片，其用于基因诊断。
26.一种用于检测基因的装置，具有权利要求1～24中的任一项所述的用于检测基因的芯片及能够插入和取出该检测芯片的测定装置。
27.如权利要求26所述的用于检测基因的装置，其特征在于能用辉锑铁元素控制所述基因检测芯片的温度。
28.一种检测方法，使用权利要求1～24中的任一项所述的用于检测基因的芯片，其特征在于在所述凹部内填充DNA样品或由DNA样品扩增而成的DNA，使其进行杂交，形成双链，然后，从所述凹部中清除、洗净所述DNA样品或由DNA样品扩增而成的DNA，之后在所述凹部内填充含有电化学活性分子的电解质，使所述双链键合所述电化学活性分子，然后在所述通用电极和所述柱电极之间加电压，检测流过的电流值。
29.一种检测方法，使用权利要求1～24中的任一项所述的用于检测基因的芯片，其特征在于，在所述凹部内填充DNA样品或由DNA样品基因扩增而成的DNA和含有电化学活性分子的电解质，使之进行杂交，形成双链，同时使所述双链与所述电化学活性分子键合，然后在所述通用电极和所述柱电极之间加电压，检测流过的电流值。
30.如权利要求28所述的检测方法，其特征在于控制温度的同时，使所述双链与所述电化学活性分子键合。
31.如权利要求28所述的检测方法，其特征在于，含有所述电化学活性分子的电解质以二茂铁、邻苯二酚胺、金属联吡啶络合物、金属络合物、生物睾丸酮或导入这些化合物的窝边型嵌入化合物作为有效成份。
32.一种基因诊断的方法，其特征在于，使用了权利要求1～24中的任一项所述的用于检测基因的芯片。
全文摘要
检测芯片2由能够互相拆装的主体部5和框架4构成。在主体部5的内侧突出多个矩阵状的柱电极10。在这个柱电极10上固定着由不同基因序列组成的寡聚核苷酸。框架4的凹部8内配置有共同电极,不与此柱电极10接触。在凹部8处加入DNA样品,在通用电极和柱电极10之间加电压,通过检测电流检测杂交的双链DNA,从而可以完成分析工作。
文档编号G01N27/403GK1341211SQ00803998
公开日2002年3月20日 申请日期2000年10月20日 优先权日1999年10月20日
发明者竹中繁织, 内田和彦, 宫原孝俊 申请人:竹中繁织, 内田和彦, 宫原孝俊