专利名称：测定全血样品中白细胞个数的方法
背景技术：
发明领域本申请涉及测定全血样品中白细胞个数的方法。具体来讲，本发明涉及测定全血样品中白细胞个数的方法，该方法包括将全血样品与表面活性剂混合得到混合物；使混合物静置足够时间以便溶解全血样品中所含的白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；测量混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度；并根据释放的髓过氧化物酶的浓度确定全血样品中白细胞的个数。通过本发明测定白细胞个数的方法，可容易而又快速地完成对全血样品中白细胞个数和/或嗜中性白细胞个数的确定，而无需从全血样品中分离血细胞。此外，通过本发明的测定方法，除可测定全血样品中白细胞的个数外还可测量同一全血样品中包含的C-反应性蛋白的浓度，从而能迅速、容易而又低成本地诊断感染性疾病的存在与不存在和炎症严重程度。
现有技术近年来，在对患者进行诊断的初始步骤中，将测定全血样品中的白细胞个数和全血样品中所含的C-反应性蛋白的浓度(下文常简称为℃RP”)作为判断患者是否具有细菌性感染性疾病的检测项目。在这一点上，为使医生能够采取适当的措施例如抗生素给药，希望发展一项快速、简单而又廉价地产生结果的检测技术。
通常，利用商业可得的全自动血细胞计数装置可实现对白细胞个数的测定，血细胞计数装置是基于孔隙阻抗方法，并以COULTERCOUNTERTM(由美国COULTER ELECTRONICS有限公司制造并销售)为代表。然而，不能利用该装置测定作为血浆蛋白CRP的浓度。
近年来，有一种能测定白细胞个数和CRP浓度的装置打入市场，在Yasuo YAMAO，Hiroshi OKUNARI和Henri CHAMPEIXReadout，16，11-15(1998)中描述了该装置，在该装置中可根据乳液浊度免疫测定法赋予基于孔隙阻抗法的血细胞计数装置CRP测定功能。在利用该装置的情况下，其步骤如下首先溶解全血样品中的红细胞，然后，通过孔隙阻抗法测定白细胞个数，接着，通过以下方法实现CRP测定含有溶解的血细胞的全血样品与具有与之结合的抗-CRP抗体的乳液小球反应预定时间，然后由乳液浊度免疫测定法测定CRP浓度。即，在利用上述装置时，基于不同原理实现白细胞个数测定和CRP浓度测定，从而完成测定需要完全不同的操作。因此，利用上述装置的传统方法具有如下缺点需要非常麻烦的操作，测定使用若干试剂，由此导致成本增加。另外，装置的维护保养需要很多时间和较高费用。由于这些缺点，几乎在所有的医疗机构内还没有引入自动血细胞计数装置，这些医疗机构有提供初级保健的责任，例如执业医师、普通医院，因此，这不能完全满足医疗保健的需要。
作为解决上述问题的手段，想得到一种基于同一原理测定白细胞个数和CRP浓度的方法。具体来讲，想得到这样一种方法针对一份全血样品，可通过免疫方法既测定白细胞个数又测定CRP浓度。通过测量白细胞中特有的蛋白质可实现白细胞个数的免疫测定。
通常已知的是，当出现细菌感染或炎症时，血液中嗜中性白细胞的数量增加，嗜中性白细胞在所有类型的白细胞中占比率最高。因此，通过测定嗜中性白细胞的个数可检测到白细胞个数的增加与减少，从而可判断细菌感染性疾病的存在与不存在和炎症的严重程度。
作为测量组织发炎处嗜中性白细胞个数或测量全血样品中白细胞个数或粒细胞个数的方法的例子，可提到在Peter P.Bradley，DennisA.Priebat，Robert D.Christensen and Gerald RothsteinJ.Invest.Dermatol.，78，206-209(1982)中描述的方法。该方法叙述如下。首先，通过利用Ficoll试剂将嗜中性白细胞从全血样品中分离出来，或获得受感染的皮肤组织。所获得的嗜中性白细胞或所获得的感染皮肤组织在含0.5％溴化十六烷基三甲铵(HTAB)的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)中进行均质化，然后进行超声波处理以提取髓过氧化物酶，接着测定所提取的髓过氧化物酶的酶活性。
在Rita Cramer，、Maria Rosa Soranzo、Pietro Dri，RenzoMenegazzi、Anna Pitotti、Giuliano Zabucehi和PierluigiPatriarcaJournal of immunological Methods，70，119-125(1984)中公开了另一种方法。该方法叙述如下。将葡聚糖(Mw 200,000)作为抗凝血剂加到含ACD(acid citrate dextrose)溶液的血液中获得混合物。从所获得的混合物中去除红细胞。接着，往所得物中加入Ficoll试剂，并通过离心作用将粒细胞从所获混合物中分离出来。然后，将2×104个粒性白细胞与含13mM邻甲氧基苯酚和0.02％溴化十六烷基三甲铵的0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)混合。加入1μmol的H2O2，测量过氧化物酶的活性。
W.M.Kuebler，、C.Abels、L.Schuerer和A.E.GoetzInt.J.Microcirc.，16，89-97(1996)公开了下面的方法。利用Ficoll试剂将多形核白细胞从全血中分离出来。用含0.5％HTAB的50mM磷酸钾缓冲溶液(PH6.0)溶解所得的白细胞，然后测定所得细胞溶解混合物中的髓过氧化物酶的酶活性。此外，上述现有技术的文献中也公开了这样一种方法，在该方法中将大鼠脑组织或家兔肺组织在1ml的0.02M磷酸钾缓冲溶液(PH7.4)中均质化，用冰块对其进行冷却，然后加入1ml的0.02M磷酸钾缓冲溶液(PH7.4)，在4℃下以2000rpm将所得产物离心15分钟，获得含上清液的离心产物。接着，测定上清液中髓过氧化物酶的酶活性。此外，在60℃下将离心产物的剩余物培养2小时，然后用50mM含0.5％HTAB的磷酸钾缓冲溶液(PH6.0)将其均质化，然后经超声处理，在4℃下以20000rpm将反应产物离心15分钟以获得上清液。接着，测定上清液中髓过氧化物酶的酶活性。
国际申请公开第WO93/01306号公开了下面的方法。将预定量的血液置于冲洗器内放置的玻璃微纤维过滤器上。向血液内加水，使红细胞溶解而不会破坏粒性白细胞，通过压力冲洗去除血液中的细胞溶解成分，以去除妨碍粒性白细胞个数测定的成分并获得玻璃微纤维过滤器上承载的不溶粒性白细胞。干燥载有不溶粒性白细胞的玻璃微纤维过滤器，将50mM磷酸盐缓冲溶液滴加到玻璃微纤维过滤器上，该缓冲溶液含0.005％的TritonTMX-100、30mM 3-氨基-1，2，4-三唑、0.0005％的H2O2和0.5mg/ml的邻联甲苯胺，从而从粒性白细胞中释放出髓过氧化物酶，并通过染色形成蓝色斑点。对表示粒性白细胞的蓝色斑点进行计数。
日本专利申请特许公开说明书第8-308593号(对应于EP 743519和US专利第5639630号)公开了下面的方法。准备一种溶液，该溶液含有非离子多乙氧基化表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂，其浓度可溶解全血中的红细胞，从而从红细胞中释放出血红蛋白，但它不会破坏白细胞；甲醛或多聚甲醛，它的浓度可使其与白细胞进行化学交联但不会与红细胞交联；糖或糖醇，它们能增强淋巴细胞的可检测性；以及缓冲溶液，其能使反应混合物的pH值位于中性点或中性点附近，具体来讲，pH范围从约6.8到约8.0。将该溶液与全血混合，将所得混合物加热到约60到75℃，以便溶解红细胞并交联白细胞。利用固有过氧化物酶的活性对部分白细胞进行着色，通过利用吸光度或光散射的光电分析测定各类白细胞的细胞个数。
然而，这些方法存在以下问题由于髓过氧化物酶基本上是从皮肤、脑和肺组织中存在的嗜中性白细胞中释放出来的，并要对其进行酶活性的测定，因此必需进行非常麻烦的操作，例如在HTAB存在情况下的均质化处理和离心处理，这也需要大量时间。此外，在测定全血白细胞的个数时，为去除干扰髓过氧化物酶测量的物质必需进行以下操作通过利用Ficoll试剂或类似试剂将白细胞从全血中分离出来。因此，必需执行去除妨碍测量的物质的操作，还必需实现固定白细胞的反应，由此使过程变得很麻烦，且必需使用大量试剂和特定装置。
Akiko GOTO、Ichio UCHIDA、Hitoshi TOMITA“Rinsho Kensa(临床检验)”，40，859-863(1996)和日本专利申请特许公开说明书第8-145993、9-72906、9-196919和11-32793公开了对尿路感染患者的尿液中所含白细胞进行计数的方法。具体来讲，在该方法中用0.05％的TritonTMX-100处理尿样，通过酶免疫测定法测量从尿样所含白细胞中释放出来的髓过氧化物酶(其中95％为嗜中性白细胞)的浓度。
与血液中细胞组分的量相比，尿液中细胞组分的数量非常少。因此在尿液中，妨碍髓过氧化物酶浓度测量的物质量也很少。由于该原因，在上述方法中，在测量从尿样所含嗜中性白细胞中释放出的髓过氧化物酶的浓度前仅用TritonTMX-100处理尿样。然而，全血包含白细胞、红细胞、血小板和血浆蛋白质的混合物，因此，全血是一种包含高浓度的各种生物组分的系统。因此，无法想象这些适合用于尿样的方法能用于全血。
有这样一个研究报告，其中使全血经受溶解处理，由此从全血的嗜中性白细胞中释放出称作“防御素”的肽，测量释放出的防御素浓度，研究防御素、白细胞个数和嗜中性白细胞个数之间的相互关系(见Toshihiko Ihi，Masamitsu Nakazato，Hiroshi Mukae和ShigeruMatsukuraClinical Infection Diseases，25，1134-1140(1997))。然而，上述研究所用的方法中，必需进行麻烦的步骤将1M醋酸加到全血中，借助于Polytron均质器使所得混合物均质化，在4℃下以2000×g将所得产物离心30分钟，从而提取到肽。因此，实践中该方法不能用于医疗服务场所，在该场所需要快速而又简单地测定全血样品中白细胞的个数。
如上所述，在免疫测定从白细胞获得的物质的传统方法中，必需执行麻烦而又耗时的操作，例如从全血中分离白细胞的操作、为从白细胞中充分释放想要的物质而在苛刻条件下对白细胞进行长时间的溶解处理的操作。此外，传统方法具有这样一个问题测定值不一定能与利用血细胞计数装置直接测得的白细胞个数很好地符合。
国际专利申请公开第WO99/46599号(对应于日本专利申请特许公开说明书第11-258231号)(它是在本申请的基础日本专利申请的申请日之后公开的)公开了这样一种方法向全血样品中加入表面活性剂，从而从粒性白细胞中释放固有弹性蛋白酶，通过免疫方法利用α1-抗胰蛋白酶抑制剂测量释放出的弹性蛋白酶，α1-抗胰蛋白酶抑制剂是弹性蛋白酶的抑制剂，基于释放出的弹性蛋白酶浓度测定白细胞个数。然而在该方法中为测量粒性白细胞弹性蛋白酶，必需进行加入α1-抗胰蛋白酶抑制剂的操作。因此，该方法的缺点在于步骤麻烦且成本高。此外，尽管在粒性白细胞弹性蛋白酶与白细胞个数之间存在很好的相关性，但上述文件没有描述该方法可适用于白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的全血样品，即取自不健康人的全血样品。
由此，通过任何一种传统方法都不可能依靠免疫方法快速而又简单地测量白细胞的固有物质，也不可能无需从全血样品中分离出白细胞就能准确测定全血样品中白细胞的个数。此外，通过任何传统方法不可能在测得全血样品中的白细胞个数的同时，快速而又简单地测量同一全血样品中所含CRP的浓度。
发明概述注意到要解决上述问题后，本发明人作了广泛而深入的研究。结果，意外发现通过以下测定方法能达到所述目的将全血样品与表面活性剂混合以有效地溶解白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶，测量释放出的髓过氧化物酶的浓度。具体来讲，出乎意料地发现，通过上述方法测得的髓过氧化物酶浓度表现出与通过传统孔隙-阻抗方法测得的白细胞个数之间的良好相关性，由此可基于髓过氧化物酶浓度测定白细胞个数。此外，还发现，在上述方法中除可测得髓过氧化物酶浓度外还可测得全血样品中所含C-反应性蛋白的浓度。基于这些新发现完成了本发明。
因此，本发明的主要目的是提供一种能快速、简单而又成本低廉地测定全血样品中白细胞个数的方法。
对本领域的技术人员来说，通过下面结合附图的详细描述和所附权利要求将使本发明的上述和其它目的、特征和优点更加清楚。
附图简要说明在附图中
图1是表示HLB值与髓过氧化物酶(MPO)释放量(根据吸光度)之间关系的图2(a)是表示从健康和非健康人体获取的全血样品MPO浓度与全血样品白细胞个数之间相关性的图；图2(b)是表示从健康和非健康人体获取的全血样品的乳铁蛋白(LTF)浓度与全血样品的白细胞个数之间相关性的图；图2(c)是表示从健康和非健康人体获取的全血样品弹性蛋白酶(ELT)浓度与全血样品白细胞个数之间相关性的图；图3(a)是表示从健康和非健康人体获取的全血样品中MPO浓度与全血样品中嗜中性白细胞个数之间相关性的图；图3(b)是表示从健康和非健康人体获取的全血样品中LTF浓度与全血样品中嗜中性白细胞个数之间相关性的图；图3(c)是表示从健康和非健康人体获取的全血样品中ELT浓度与全血样品中嗜中性白细胞个数之间相关性的图；图4(a)是表示从健康人体获取的全血样品中MPO浓度与全血样品白细胞个数之间相关性的图；图4(b)是表示从健康人体获取的全血样品中LTF浓度与全血样品的白细胞个数之间相关性的图；图4(c)是表示从健康人体获取的全血样品中ELT浓度与全血样品的白细胞个数之间相关性的图；图5(a)是表示从非健康人体获取的全血样品中MPO浓度与全血样品的白细胞个数之间相关性的图；图5(b)是表示从非健康人体获取的全血样品中LTF浓度与全血样品的白细胞个数之间相关性的图；图5(c)是表示从非健康人体获取的全血样品中ELT浓度与全血样品白细胞个数之间相关性的图；图6是表示白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的全血样品的MPO浓度与全血样品白细胞个数之间相关性的图。
图7是表示白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的全血样品的MPO浓度与全血样品嗜中性白细胞个数之间相关性的图。
图8(a)是表示基于MPO浓度测得的白细胞个数与通过血细胞计数装置测得的白细胞个数之间相关性的图；图8(b)是表示基于MPO浓度测得的嗜中性白细胞个数与通过血细胞计数装置测得的嗜中性白细胞个数之间相关性的图。
发明的详细描述在本发明中提供了一种测定全血样品中白细胞个数的方法，它包括(a)将全血样品与表面活性剂混合，由此获得混合物；(b)使混合物静置足够时间，以便溶解全血样品中含有的白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；(c)测量释放出的髓过氧化物酶在混合物中的浓度；以及(d)基于释放的髓过氧化物酶浓度测定全血样品中白细胞的个数。
为便于理解本发明，下面列举本发明的基本特征与各优选实施方案。
1.一种测定全血样品中白细胞个数的方法，它包括(a)将全血样品与表面活性剂混合从而获得混合物；(b)使混合物静置足够时间，以便溶解全血样品中包含的白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；(c)测量释放出的髓过氧化物酶在混合物中的浓度；以及(d)基于释放出的髓过氧化物酶浓度测定全血样品中白细胞的个数。
2.根据上面第1项的方法，其中，在步骤(c)中除测量释放出的髓过氧化物酶的浓度外还测定全血样品中所含C-反应性蛋白的浓度。
3.根据上面第1项的方法，其中，在步骤(c)中通过免疫方法测量释放出的髓过氧化物酶的浓度。
4.根据上面第2项的方法，其中，在步骤(c)中通过免疫方法既测量髓过氧化物酶的浓度也测量C-反应性蛋白的浓度。
5.根据上面第3或4项的方法，其中免疫方法为酶免疫测定。
6.根据上面第3或4项的方法，其中免疫方法为光学免疫测定。
7.根据上面第1到6项中任一项的方法，其中表面活性剂为非离子表面活性剂。
8.根据上面第7项的方法，其中非离子表面活性剂的亲水亲油平衡(HLB)值为12到14。
9.根据上面第7项的方法，其中非离子表面活性剂为聚环氧乙烷类化合物，该化合物具有与之结合的饱和或不饱和的烃。
10.根据上面第9项的方法，其中非离子表面活性剂是至少一种从以下物质组成的组中选择的非离子表面活性剂具有聚氧乙烯烷基苯基醚结构的非离子表面活性剂、作为聚环氧乙烷类化合物的非离子表面活性剂(它具有与之结合的不饱和脂肪族烃)以及具有聚氧乙烯烷基醚结构的非离子表面活性剂。
11.根据上面第10项的方法，其中非离子表面活性剂是至少一种从以下物质组成的组中选择的非离子表面活性剂TritonTMX-114、TritonTMX-100、IgepalTMCA630、Nissan Nonion NS-208.5、NissanDispanol TOC、BrijTM97和BrijTM56。
12.根据上面第1到6项中任一项的方法，其中表面活性剂是至少一种从以下物质组成的组中选择的阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基三甲铵、氯化二癸基二甲铵、氯化十二烷基三甲铵、溴化十二烷基三甲铵、氯化十八烷基三甲铵、溴化四癸铵、氯化十二烷基吡啶鎓、氯化十六烷基吡啶鎓、溴化十六烷基吡啶鎓、氯化1-月桂基吡啶鎓和溴化十四烷基三甲铵。
13.根据上面第1到12项中任一项的方法，其中表面活性剂与全血样品的混合量，使得混合物中表面活性剂的浓度范围为0.2到10％(w/v)。
14.根据上面第1到13项中任一项的方法，其中在步骤(b)中使混合物静置不超过1小时。
15.根据上面第1到14项中任一项的方法，其中白细胞个数为嗜中性白细胞的个数。
下面将详细描述本发明。
在本发明中，术语“全血”意指含所有血液组分例如红细胞、白细胞、血小板和血浆的血液。术语“白细胞”包括嗜中性白细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。术语“白细胞的溶解”意指破坏白细胞的细胞膜，由此使细胞内容物释放到细胞外部。
为进一步说明本发明的基本特征，下面将详细描述本发明中所含的技术特征，同时解释本发明是怎样发展起来的。
如Borregaard，N等人在“Granules of the humanneutrophilic polymorphonuclear leukocytes”Blood，89，3503-3251(1997)中所述，嗜中性白细胞内存在的物质例子包括嗜苯胺蓝颗粒(原生颗粒)、特异性颗粒(次生颗粒)、明胶酶颗粒(第三级(tertiary)颗粒)和囊疱内存在的物质。
具体来讲，嗜苯胺蓝颗粒(原生颗粒)中存在的物质例如CD63、CD68、V-型H+ATP酶、酸性-β甘油磷酸酶、酸性粘多糖、α1-抗胰蛋白酶、α1-甘露糖苷酶、薁醇啶(azurocidin)/CAP37/肝磷脂结合蛋白、杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)、β-甘油磷酸酶、β-葡(萄)糖苷酸酶、组织蛋白酶、防御素、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、溶菌酶、髓过氧化物酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、蛋白酶、唾液酸酶和泛激素。
特异性颗粒(次生颗粒)中存在的物质例如CD11b、CD15抗原、CD66、CD67、细胞色素b558、fMLP受体、纤连蛋白受体、G-蛋白α-亚单位、昆布氨酸受体、NB-1抗原、19-KD蛋白、155-KD蛋白、Rap1、Rap2、SCAMP、凝血栓蛋白受体、TNF受体、尿激酶型纤维蛋白溶解原活化子受体、VAMP-2、vitronectin受体、β2-小球蛋白、胶原酶、明胶酶、hCAP-18、组胺酶、肝素酶、乳铁蛋白、溶菌酶、NGAL、尿激酶型的纤维蛋白溶解原活化子受体唾液酶、SGP28与维生素B12结合蛋白。
明胶酶颗粒(第三级颗粒)中存在的物质例如CD11b、细胞色素b558、二酰基甘油脱酰基酶、fMLP受体、SCAMP、尿激酶型纤维蛋白溶解原活化子受体、VAMP-2、V型H+ATP酶、乙酰基转移酶、β2-小球蛋白、明胶酶和溶菌酶。
囊疱中存在的物质例如碱性磷酸酶、补体受体、细胞色素b558、CD11b、CD14、CD16、fMLP受体、SCAMP、尿激酶型纤维蛋白溶解原活化子受体、VAMP-2、V型H+ATP酶、CD10、CD13、CD45、C1q受体、DAF(延迟加速因子)和血浆蛋白(包括tetranectin)。
本发明人考虑到，为测定全血中白细胞个数而测量的物质优选具有这样的特性当用表面活性剂处理全血时，释放出的物质量足够通过酶免疫测定法进行测量，即使存在除感染以外的原生疾病时全血中该物质的数量也不会表现出很大起伏。基于该观点，发明人作了一些研究，结果认为，希望从嗜苯胺蓝颗粒(原生颗粒)或特异性颗粒(次生颗粒)内存在的物质中选择作为为测定全血中白细胞个数而测量的物质，特别希望从髓过氧化物酶(此后一般称为“MPO”)、嗜中性白细胞弹性蛋白酶(此后一般称为“ELT”)和乳铁蛋白(此后一般称为“LTF”)中选择。
此外，本发明人还作了以下研究。从健康人群获取全血样品，每个样品的白细胞个数小于10000个细胞/微升，从不健康人群获取全血样品，其白细胞个数为10000个细胞/微升或更多。单独检测这些全血样品，并分析MPO、ELT和LTF的浓度与白细胞个数之间的相互关系。结果发现，对于从健康人群获得的全血来说，与LTF或ELT浓度与白细胞个数之间关系的相关系数(R)相比，MPO浓度与白细胞个数之间关系的相关系数(R)非常高，具体为R＝0.9336。因此断定，从健康人获得全血样品时，通过测量MPO浓度可获得最精确的白细胞个数测定结果。
此外，对于从不健康人群获得的全血样品来说，注意表示MPO、LTF和ELT中每个的浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率。将从不健康人获得的全血样品中MPO、LTF和ELT每个的浓度对白细胞个数的回归线斜率分别与从健康人获得的全血样品中MPO、LTF和ELT每个浓度对白细胞个数的回归线斜率作比较。比较结果如下。表示不健康人全血样品中MPO浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率为0.0019，该斜率与表示健康人全血样品中MPO浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率(0.0021)接近。与此相反，表示不健康人全血样品中LTF浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率为0.0007，这与表示健康人全血样品中LTF浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率0.0016相差很大，即，这表示，在测定LTF的情况下，基于不健康人全血获得的回归线斜率相当于基于健康人全血获得的回归线斜率的大约1/2.3那么小。此外，表示不健康人全血样品中ELT浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率为0.0031，这与表示健康人全血样品中ELT浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率0.0017相差很大，即，这表示，在测定ELT的情况下，基于不健康人全血获得的回归线斜率相当于基于健康人全血获得的回归线斜率的大约1.8倍那么大。此外，还发现，从患有急性胰腺炎的患者获取全血样品的情况下，ELT浓度要显著高于MPO和LTF的浓度，ELT浓度显示出与表示全血中ELT浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线的很大偏离。因此，存在表示这样一个趋势的测定结果在导致全血白细胞个数升高到10000个细胞/微升或更高的疾病的情况下，固有MPO的数量不会显示出很大变化，但固有LTF的数量会减少，而固有ELT的数量会增加。但是，现在还不能解释该趋势的原因。
为得到对全血中白细胞个数的精确测定，重要的是利用产生以下结果的测定方法基于全血获得的回归线斜率不会因全血是否是白细胞个数小于10000个细胞/微升的健康人全血或白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的不健康人全血而显示任何变化。因此，考虑到本发明人所作的上述研究结果，可以断定，为精确测定全血样品中白细胞的个数，最适合的是测量全血样品中所含髓过氧化物酶的量。
由于上述广泛而深入的研究，本发明人发现髓过氧化物酶的量可作为白细胞个数的指标。基于这些研究完成了本发明。
本发明提供了一种测定全血样品中白细胞个数的方法，其中将全血样品与表面活性剂混和，以溶解白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶，测量释放出的髓过氧化物酶的浓度。具体来讲，本发明提供了一种测定全血样品中白细胞个数的方法，其中(a)将全血样品与表面活性剂混合从而获得混合物；
(b)使混合物静置足够时间，以便溶解全血样品中含有的白细胞，并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；(c)测量混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度；以及(d)基于释放出的髓过氧化物酶的浓度测定全血样品中白细胞的个数。
在本发明的方法中，将全血样品与表面活性剂混和以获得混合物，使获得的混合物静置以溶解全血样品中包含的白细胞、红细胞、血小板等组分。
在本发明中，术语“表面活性剂”意指在一个分子中既具有亲水部分又具有亲油部分的化合物。此处“表面活性剂”除非另行指明都意指水溶性表面活性剂。
通常，表面活性剂粗略分成离子表面活性剂和非离子表面活性剂。在本发明的方法中，可以使用任何一种离子表面活性剂和非离子表面活性剂作为与全血样品混和以溶解白细胞的表面活性剂。
离子表面活性剂可分成阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。
阴离子表面活性剂的例子包括十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基-N-肌氨酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺脱氧胆酸钠。
阳离子表面活性剂的例子包括溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基三甲铵、氯化二癸基二甲铵、溴化二癸基二甲铵、氯化十二烷基三甲铵、溴化十二烷基三甲铵、氯化十八烷基三甲铵、溴化十八烷基三甲铵、溴化四癸铵、氯化十二烷基吡啶鎓、氯化十六烷基吡啶鎓、溴化十六烷基吡啶鎓、氯化1-月桂基吡啶鎓和溴化十四烷基三甲铵。
两性表面活性剂的例子包括3-〔(3-胆胺丙基二甲铵)-1-丙磺酸、3-〔(3-胆胺丙基)二甲铵〕-2-羟基-1-丙磺酸、棕榈酰溶血卵磷脂、十二烷基-N-甜菜碱和十二烷基-β-丙氨酸。
非离子表面活性剂的例子包括辛基葡糖甙、庚基硫代葡糖甙、癸酰基-N-甲葡糖胺、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯环庚基已基醚、聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯的脂肪酸酯、蔗糖的脂肪酸酯和聚氧乙烯山梨醇酯。
对于本发明的方法中使用的表面活性剂，希望表面活性剂能用于从白细胞中释放固有MPO，同时将MPO的变性作用抑制到尽可能低的水平。基于该观点，优选的是表面活性剂为非离子表面活性剂而不是离子表面活性剂，因为离子表面活性剂具有高表面活性。
作为表示表面活性剂特性的一个参数，可提到亲水亲油平衡值(HLB)。HLB值是表面活性剂分子中亲水基团与亲油基团的平衡系数。HLB值的概念是由Griffin提出来的。表面活性剂的HLB值可通过评测表面活性剂的乳化力并进行简单的计算而用实验方法测定(例如参见“Sin-ban Kaimen-Kassei-Zai Handobukku(新版表面活性剂手册)，”由Tokiyuki YOSHIDA、Shin-ichi SHINDO、Tadayoshi OOGAKI和Mikiyoshi YAMANAKA编辑并由日本Koguku Tosho Co.出版(1987))。本发明方法中可以使用的表面活性剂例子的HLB值示出如下
优选的是，本发明的方法中使用的非离子表面活性剂的HLB值为12到14。HLB值为12到14的非离子表面活性剂能显现出使固有MPO从全血样品所含白细胞中释放的高效率。当非离子表面活性剂的HLB值高于14时，非离子表面活性剂明显显示出使固有MPO从全血样品所含白细胞中释放的低效率。另一方面，当非离子表面活性剂的HLB值低于12时，非离子表面活性剂就显示出其在水中溶解性差的性质，从而不仅使从白细胞中释放固有MPO的效率变低，而且表面活性剂的使用也变得困难。此处所提的HLB值除非另行指明都指“HANDBOOK OFINDUSTRIAL SURFACTANTS”第二版(由Michael和Irene Ash编辑并由Gower Publishing Limited出版(1997))中描述的HLB值。
根据从白细胞中有效释放固有MPO的观点，优选的是，非离子表面活性剂是结合有饱和或不饱和烃的聚环氧乙烷类化合物。更为优选的是，非离子表面活性剂选自以下物质构成的组具有聚氧乙烯烷基苯基醚结构的非离子表面活性剂(例如TritonTMX-114(由日本Nacalai Tesque有限公司制造并销售)、TritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)、IgepalTMCA630(以美国SIGMATM牌制造并销售)以及Nissan Nonion NS-208.5(由日本油脂有限公司制造并销售))，结合有不饱和脂肪族烃的聚环氧乙烷类化合物(例如，BrijTM97(以美国SIGMATM牌制造并销售))，以及具有聚氧乙烯烷基醚结构的非离子表面活性剂(例如NissanDispanol TOC(由日本油脂有限公司制造并销售)、BrijTM56(以美国SIGMATM牌制造并销售))。
更为优选的是，非离子表面活性剂为TritonTMX-114，原因是它能显现出从白细胞中释放固有MPO的高活性，并能高度灵敏地测量固有MPO。
有关上述用商品名表示的表面活性剂仅供参考，其CTFA(TheCosmetic，Toiletry and Fragrance Assoc.)命名和/或IUPAC命名概括如下
在本发明的方法中为溶解白细胞并从白细胞中释放固有MPO而采用的表面活性剂可以是阳离子表面活性剂。根据本发明人所作实验的结果，本发明人发现为从白细胞中释放固有MPO，适合选用由以下物质组成的组中的阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基三甲铵、氯化二癸基二甲铵、氯化十二烷基三甲铵、溴化十二烷基三甲铵、氯化十八烷基三甲铵、溴化四癸铵、氯化十二烷基吡啶鎓、氯化十六烷基吡啶鎓、溴化十六烷基吡啶鎓、氯化1-月桂基吡啶鎓和溴化十四烷基三甲铵。
在本发明的方法中，优选的是，将表面活性剂以这样的量与全血样品混和所得混合物中表面活性剂的浓度为0.2％(w/v)或更高。当混合物中表面活性剂的浓度低于0.2％(w/v)时，就不可能获得从白细胞中释放固有MPO的满意效果。另一方面，当混合物中表面活性剂的浓度太高时，不仅由于增加了表面活性剂的用量而使成本增加，而且使混合物的处理变得困难。因此，优选的是将表面活性剂以这样的量与全血样品混和得到的混合物中表面活性剂的浓度是0.2到10％(w/v)，更有利的是从0.2到5.0％(w/v)，进一步有利的是从0.2到2.0％(w/v)。
在本发明的方法中，对将全血样品与表面活性剂混和的方法没有特别的限制，只要混和方法能确保以下操作就可以全血样品与表面活性剂混和从而获得混合物，使混合物静置，以便溶解全血样品中含有的白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶。例如，可通过以下方法进行混和制备表面活性剂的水溶液，将表面活性剂的水溶液加到全血样品中。在该情况下，加入表面活性剂的水溶液后，既可以搅拌也可以不搅拌所得的混合物。或者，也可通过以下方法进行混和将表面活性剂以颗粒形式加到混和容器的内表面上，将全血样品加到混和容器中。同样，在该混和方法中通过混和全血样品与表面活性剂使白细胞溶解并使固有髓过氧化物酶从白细胞中释放出来。同样，在该混和方法中可以搅拌或不搅拌全血样品与表面活性剂的混合物。
在使通过混和全血样品与表面活性剂而得到的混合物静置的步骤中，对混合物的静置时间没有特殊限制，只要时间足以溶解全血样品所含的白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶就可以。然而，在本发明的方法中，优选的是混合物的静置时间不超过1小时。通常静置时间为大约1分钟到1小时。在对患有感染性疾病的患者进行诊断的初始步骤中，由于必需尽可能快地进行适当处置例如给药，因此必需迅速获得白细胞个数的测量结果(以及CRP浓度)。因此，为缩短测定白细胞个数所需的时间，优选的是缩短混合物的静置时间。
在本发明的方法中，对通过混和全血样品与表面活性剂而获得的混合物静置时的温度没有特别限制。然而，由于在水分散体(乳状液)中完成白细胞的溶解和固有髓过氧化物酶从白细胞的释放，因此不希望使上述混合物冷却到混合物凝固的温度。此外，由于MPO抗原性的改变会妨碍MPO的免疫反应，因此也不希望将上述混合物加热到改变MPO抗原性的高温。因此在本发明的方法中，优选的是，通过混和全血样品与表面活性剂而获得的混合物静置时的温度范围为0℃到室温(大约25℃)。此外，鉴于在普通诊所进行感染性疾病诊断的事实，因此更为优选的是上述混合物静置时的温度为室温。
在本发明的方法中，对通过混和全血样品与表面活性剂得到的混合物，除测量释放出的髓过氧化物酶的浓度外，还可以测量全血样品中含有的C-反应性蛋白浓度。对于健康人的CRP值(标准范围)，已经有许多研究者作出了报告；标准范围的报告值实施例如下60.3μg/dl或更少(Yasuko YAMAGISHI等人“Rinsho Byori(ClinicalPathology)”321389-1394，1984)；300μg/dl或更少(Akira NISHIDA“Kitasato Igaku(Kitasato Medicine)”16393-401，1986)；以及4.0到235.3μg/dl(Naoto SHIMETANI“Kitasato Igaku(KitasatoMedicine)”2497-103，1994)。在涉及通过临床检验获得的数据的手册中也描述了健康人的CRP值(标准范围)。例如，在标题为“Rinsho-ni-Yakudatsu Kensa-chi-no Yomikata·Kangaekata(以临床上有用的方式看懂并研究临床检验数据的方法)”、在Kin-ya KAWANO和Osamu NISHIZAKI的监督下编辑并由日本Sogo-Igakusha公司出版的手册(236页，1997)中描述了健康人的CRP值(标准范围)为0.3mg/dl(＝3μg/ml)或更低(尽管依据测定方法会使该值在一定程度上有所不同)。当通过例如炎症或癌症的病害激活单核细胞/巨噬细胞时，单核细胞/巨噬细胞分泌白细胞间介素6、白细胞间介素1、TNF-α等物质，结果，在肝细胞内产生急性期蛋白，该种CRP从而使血液中CRP浓度增加。血液中CRP浓度的增加是非特异性反应。然而，血液中CRP的浓度对病害反应很灵敏，因此CRP浓度是最广泛使用的炎症标记物类型。此外，血液中CRP的浓度会随着癌症发展而增加，因此它也可用作广义上的肿瘤标记物。此外，对于感染性疾病，细菌感染情况下的血液所显现出的CRP浓度要比病毒感染情况下的血液CRP浓度高。因此，除测定白细胞个数外，通过测量CRP浓度可进行更精确的诊断。例如，CRP值与病理状况之间的下述关系是已知的。
在本发明的方法中，对测量从白细胞中释放出的MPO的浓度的方法没有特别限制。可以使用各种方法测量MPO浓度。测量MPO浓度的方法的具体例子包括测量MPO的酶活性、液相色谱和免疫法。然而，由于免疫方法具有很好的测量灵敏性和测量专一性、并也能用于测量CRP浓度，因此优选的是通过免疫方法测量MPO浓度。
在本发明中，术语“免疫方法”包括例如以下方法利用酶活性或放射性作为指标测量抗原或抗体量的方法；通过检测由抗原-抗体反应形成的免疫复合物来测量抗原或抗体量的方法，以及这样一种方法用例如为胶乳小球或胶体金的载体携带抗原或抗体，使载体携带的抗原或抗体与抗体或抗原凝聚，检测凝聚结果以测量抗原-抗体的反应程度，基于抗原-抗体的反应程度测量抗原或抗体的量。
对本发明的方法中所采用的免疫方法类型没有特殊限制。但是，出于安全考虑，不希望使用利用放射性作为指标的免疫方法。
作为免疫方法的具体实施例可提到免疫色谱法(该方法用在测量蛋白质等的量的技术中)；利用96-孔板的酶免疫测定法；以及在国际申请公开第WO91/04491、WO92/14136、WO92/14147、WO92/16826和WO94/03774号中描述的测量方法(美国BioStar的光学免疫测定法)。
下面将通过免疫色谱法对测量MPO浓度的方法作具体说明。通过吸附或化学方法将抗人体的MPO抗体固定到基底薄膜上，其中基底薄膜由纤维素、硝化纤维素或表面经化学改性的纤维素(一种经化学改性的纤维素，它具有阳离子性的官能团或阴离子性的官能团，阳离子性官能团例如氨基或二乙氨乙基，阴离子性官能团例如羧基)。将固定了抗体的基底浸入到含牛血清蛋白或类似物的缓冲溶液中，由此会产生封闭反应，然后将其干燥以获得测量MPO的免疫色谱用芯片。
在制造上述免疫色谱用芯片的过程中，除抗人体MPO抗体以外，当将抗人体CRP抗体固定到基底上时(其中可将两种抗体固定在一块基底的不同位置上或可分别将其固定在并排布置的两块基底上)，就可得到用于测量MPO和CRP的免疫色谱用芯片。
利用胶体金或胶乳小球标记的抗人体MPO抗体(和抗人体CRP抗体)实现对MPO(和CRP)的检测。具体地说，可按照如下方式进行检测。将上述标记好的抗体与含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)相混合，将所得到的混合物滴加到上述免疫色谱用芯片的基底上，然后加入适当的展开缓冲剂，由此滴加的混合物在芯片基底的表面上移动展开。可提前将含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)稀释到适当程度。在所滴加的混合物的移动/展开过程中，通过被固定的抗体捕获标记抗体和MPO(和CRP)的免疫复合物并使其显色。通过评测显色程度或通过利用光学测量装置测量MPO(和CRP)的浓度。
下面，通过利用96-孔板的酶免疫测定法对测量MPO浓度和CRP浓度的方法进行说明。首先，将作为原生抗体的抗人体MPO抗体和抗人体CRP抗体固定到商业可得的作为基底的96-孔板上。另一方面，将含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)稀释2000倍到4000倍，将所得的经稀释的混合物加到上述96-孔板上，由此引起板上固定的抗体与稀释混合物中的MPO和CRP之间的抗原-抗体反应。接着，将抗人体MPO抗体溶液和抗人体CRP抗体溶液(作为次生抗体)加到板上，由此利用次生抗体进行抗原-抗体反应，其中上述溶液中的抗体已经用酶作了标记，这些酶例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。然后将作为HRP底物的含四甲基联苯胺(TMB)和H2O2的溶液或作为碱性磷酸酶底物的含p-硝基苯基磷酸酯的溶液加到其中引起显色。过预定时间后，加入1N硫酸或氢氧化钠溶液以终止反应。通过测量有色反应混合物的吸光度测量MPO浓度和CRP浓度。
可依照Covalciuc KA，Webb KH and Carlson CAJournal ofClinical Micro-biology 123971-3974(1999)的描述实施通过光学免疫测定测量MPO浓度和CRP浓度的方法。具体地说，按照如下方式实施该方法。提供一个硅片。在硅片表面上形成物质的薄膜(例如，聚合物如聚硅氧烷的薄膜或类似金刚石的碳的薄膜)，该物质的折射率与硅片的折射率不同。然后，将作为原生抗体的抗人体MPO抗体和抗人体CRP抗体固定到上述表面有薄膜的硅片表面上。将含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)稀释100倍到200倍，所得的经稀释的混合物与HRP-标记的抗人体MPO抗体溶液和HRP-标记的抗人体CRP抗体溶液混合，将所得到的混合物加到硅片表面上，由此引起硅片上固定的抗体与稀释混合物中的MPO和CRP之间的抗原-抗体反应。接着将“TMB fast”(由美国Kirkegaad&Perry Laboratories有限公司制造并销售)(它是TMB的沉淀基质)加到其中，静置预定时间，由此在硅片表面上形成沉淀层。根据由于硅片表面上形成的沉淀层厚度而造成的干涉色的变化测定MPO浓度和CRP浓度。或者，也可借助于椭球偏光计通过测量硅片表面上形成的沉淀层厚度来测定MPO浓度和CRP浓度。
在本发明的方法中，基于这样测得的MPO浓度，测定全血样品中白细胞的数量。对基于MPO浓度测定白细胞个数的方法没有特殊限制。可采用本技术领域中的通用方法。具体地说，正如本说明书的实施例10所实施的，可由表示MPO浓度与白细胞个数之间相关性的回归线测定白细胞个数。
此外，在本发明的方法中，优选的是通过本发明的方法测定的白细胞个数是嗜中性白细胞的个数。嗜中性白细胞是所有类型的白细胞中比例最高的细胞。已知的是，当出现细菌感染或炎症时血液中嗜中性白细胞的数量会增加。因此，当打算判断细菌感染性疾病存在或不存在或判断炎症的严重程度时，最好测定嗜中性白细胞的数量。如本说明书的实施例7、9和10中所述，当全血样品与表面活性剂混合以溶解白细胞并从白细胞中释放出固有MPO时，释放出的MPO浓度不仅显现出与白细胞个数的良好相关性，而且也显现出与嗜中性白细胞个数的良好相关性。因此通过本发明的方法，可测定嗜中性白细胞个数以及白细胞个数。
本发明的最佳实施方式下面，将参照以下实施例和对比例详细描述本发明，但不应当把它们看作是对本发明范围的限制。
实施例1确定溶解白细胞所需时间的实验在内含10mg EDTA-2K(由日本Dojin Laboratories制造并销售)的试管内采集10ml健康人的全血，将所得内含EDTA的全血样品搅拌均匀，然后从试管内取出1ml全血样品。向从试管内取出的1ml全血样品内加入100μl的含11％TritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)的水溶液，然后将得到的混合物搅拌均匀，在室温下使其静置1分钟，以获得含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)。除了将室温下的静置时间变成5分钟、30分钟和60分钟以溶解全血中含有的白细胞外，重复基本上与上述操作相同的操作。
经过上述时间后，用样品稀释缓冲剂(含0.1％牛血清蛋白和0.2％叠氮化钠的20mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4))将所得含溶解了白细胞的每份混合物(全血样品/表面活性剂)稀释2000倍，该缓冲剂附属于BIOXYTECTMMPO酶免疫测定试剂盒(由美国OXIS International有限公司制造并销售)，然后将所得的经稀释的混合物作为测量髓过氧化物酶(MPO)的样品。
对用于测量MPO的上述样品和标准MPO溶液(它是通过将商品MPO溶解到上述缓冲剂中得到的)，利用BIOXYTECTMMPO酶免疫测定试剂盒(由美国OXIS International有限公司制造并销售)依照使用说明书实现对MPO浓度的测量。
具体地说，对于上述样品的MPO浓度测量，将MPO(由美国ElastinProducts有限公司制造并销售)加到样品中，从而使所加MPO的最后浓度变为5ng/ml或10ng/ml，测量所得到的混合物的MPO浓度。由所得到的MPO浓度值获得每个样品的标准曲线。基于该标准曲线与根据标准MPO溶液获得的标准曲线的关系校正该标准曲线，利用经过校正的每个样品的标准曲线测定全血中的MPO浓度。进行3次测量，获得平均值±标准偏差。结果示于表1中。
表1
由此，可以断定，在用TritonTMX-100处理的情况下，开始处理后的60分钟内MPO从白细胞中的释放可达到令人满意的程度。
实施例2表面活性剂的浓度与MPO的释放量采集10ml健康人的全血，立即与10mgEDTA-2K(由日本DojinLaboratories制造并销售)混合，在从血液采集开始的1小时内对所得含EDTA的全血样品进行下述的各种测量。
通过下面的方法测量髓过氧化物酶的浓度。
将500μl血液加到2-ml Eppendorf管内，向该管内加入500μl表面活性剂浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、4、10或20％(w/v)的表面活性剂水溶液，用Vortex搅拌器搅拌所得混合物2秒种。接着，在冰块上使混合物静置60分钟以溶解白细胞。作为上述的表面活性剂，单独使用下面提到的3种表面活性剂TritonTMX-114(由日本Nacalai Tesque公司制造并销售)、TritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)、IgepalTMCA630(以美国SIGMATM牌制造并销售)。白细胞溶解后，取出100μl的混合物并将其加到内含溶解了1％BSA(商品名“Sigma fraction V”，以美国SIGMATM牌制造并销售)的900μlPBS溶液中。用Vortex搅拌器搅拌所得到的混合物，然后取出10μl混合物并用1％的BSA/PBS溶液稀释2000倍。通过ELISA测量所得的经稀释的混合物。
ELISA的要点叙述如下。将5μg/ml的家兔抗人体髓过氧化物酶抗体(由美国Calbiochem-Novabiochem公司制造并销售)(下文常称为“抗-MPO抗体”)的PBS溶液加到Nunc Immuno Plate(由丹麦NalgeNunc International制造并销售)的孔中，每孔加入量为100μl。密封每个孔中的溶液，并在4℃下使其反应18小时以固定原生抗体。用洗液(0.05％的TweenTM20/PBS)清洗这些孔，然后在室温下用200μl封闭溶液(1％BSA/PBS)封闭1小时，然后用洗液清洗两次。然后，将上面所得的经稀释的混合物(经表面活性剂处理然后被稀释的血样)以每个孔100μl的量置于这些孔中，使其在室温下反应2小时。然后用洗液将这些孔清洗3遍，将用辣根过氧化物酶(下文称为“HRP”)标记的5μg/ml的抗-MPO抗体溶液以每个孔100μl的量加到这些孔中，使其在室温下反应1小时。作为上面所述HRP标记的抗-MPO抗体，采用已经用HRP Grade IV(以美国SIGMATM牌制造并销售)标记的抗人体MPO抗体(由美国Calbiochem-Novabiochem公司制造并销售)。利用Analytical Biochemistry，132，68-73(1983)中描述的方法进行标记。用洗液将孔清洗5遍，向其中加入100μl刚制备的TMB溶液(由美国Kirkegaad&Perry Laboratories制造并销售)以引起颜色反应。在颜色反应开始后2分钟向孔中加入100μl的1N硫酸溶液(由日本Nacalai Tesque有限公司制造并销售)以终止反应。然后，借助于板的读取装置(由美国Bio-Rad Laboratories制造并销售)测量450nm下的吸光度。进行3次测量，获得平均值±标准偏差。结果示于表2中。
表2
由此可以断定，对于使用TritonTMX-100、TritonTMX-114和IgepalTMCA630中任何一种，当表面活性剂的浓度在0.2到10.0％(w/v)的范围内，从白细胞中释放固有MPO可达到令人满意的程度。
实施例3各种表面活性剂的MPO释放效果利用28G带翼的静脉注射针(由日本Terumo公司制造并销售)采集10ml健康人的全血，立即与10mg的EDTA-2K(由日本DojinLaboratories制造并销售)混合，在血样采集后1小时内对所得含EDTA的全血样品进行下述的各项测量。
通过下述方法测量髓过氧化物酶的浓度。
将500μl的血液加到2-ml Eppendorf管内，向该管内加入500μl浓度为1％(w/v)的表面活性剂水溶液，用Vortex搅拌器搅拌所得混合物2秒种。接着，使混合物在冰块上静置60分钟以溶解白细胞。白细胞溶解后，取出100μl的混合物并将其加到溶有1％BSA(商品名“Sigma fraction V”，以美国SIGMATM牌制造并销售)的900μl PBS溶液中。用Vortex搅拌器搅拌所得混合物，然后取出10μl混合物，并用1％的BSA/PBS溶液将其稀释2000倍。通过ELISA法测量所得的经稀释的混合物。
ELISA的要点叙述如下。将5μg/ml的抗-MPO抗体PBS溶液以每个孔100μl的量加到Nunc Immuno Plate(由丹麦Nalge NuncInternational制造并销售)的孔中。密封每个孔中的溶液，并在4℃下使其反应18小时以固定原生抗体。用洗液(0.05％的TweenTM20/PBS)清洗这些孔，然后在室温下用200μl封闭溶液(1％BSA/PBS)封闭1小时，然后用洗液清洗两次。然后，将上面所得的经稀释的混合物(经表面活性剂处理再被稀释的血样)以每孔100μl的量置于这些孔中，使其在室温下反应2小时。然后用洗液将这些孔清洗3遍，将5μg/ml的用辣根过氧化物酶标记的抗-MPO抗体溶液(用与实施例2中相同的方式制备的辣根过氧化物酶标记的抗-MPO抗体)以每个孔100μl的量加到这些孔中，使其在室温下反应1小时。用洗液将孔清洗5遍，向其中加入100μl刚制备的TMB溶液(由美国Kirkegaad&Perry Laboratories制造并销售)以引起颜色反应。颜色反应开始后2分钟，向孔内加入100μl的1N硫酸溶液(由日本Nacalai Tesque有限公司制造并销售)以终止反应。然后，借助于板读取装置(由美国Bio-Rad Laboratories制造并销售)测量450nm下的吸光度。
对于样品MPO浓度的测量，将MPO(由美国Elastin Products有限公司制造并销售)加到样品中，从而使所加MPO的最后浓度变为5ng/ml或10ng/ml，测量所得混合物的MPO浓度。由所得到的MPO浓度值获得每个样品的标准曲线。基于所获标准曲线与根据标准MPO溶液获得的标准曲线之间的关系校正样品的标准曲线，利用经过校正的每个样品的标准曲线测定全血中的MPO浓度。进行测量3次，获得平均值±标准偏差。
参加测试的表面活性剂如下
溴化十六烷基三甲铵(HTAB)(由日本Wake Pure ChemicalIndustries有限公司制造并销售)，TritonTMX-114(由日本Nacalai Tesque有限公司制造并销售)，TritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)，TritonTMDF-12(以美国SIGMATM牌制造并销售)，BrijTM56(以美国SIGMATM牌制造并销售)，BrijTM97(以美国SIGMATM牌制造并销售)，IgepalTMCA630(以美国SIGMATM牌制造并销售)，Nissan Nonion NS-208.5(由日本油脂有限公司制造并销售)，Nissan Dispanol TOC(由日本油脂有限公司制造并销售)。
将这些表面活性剂分别溶解在净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)中以获得10％或2％(w/v)的水溶液，在用于测试前，将每份水溶液进一步稀释以获得1％(w/v)的水溶液，从准备该水溶液开始的15小时内使用该1％(w/v)的水溶液进行测量。使用净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)作为空白。
其结果示于表3中。
表3
由此，表明参加测试的任何一种表面活性剂都能使固有MPO从全血样品含有的白细胞中有效地释放。
实施例4各种表面活性剂的MPO释放效果通过与实施例3相同的方法，根据固有MPO从全血样品含有的白细胞中被有效释放的效果对下述表面活性剂进行测评。这些表面活性剂如下所述氯化十六烷基吡啶鎓的一水合物(HPC)，溴化十六烷基吡啶鎓的一水合物(HPB)，氯化十六烷基三甲铵(HTAC)，溴化n-十二烷基三甲铵(DTAB)，溴化十六烷基三甲铵(HTAB)，氯化1-月桂基吡啶鎓(LPC)，以及溴化十四烷基三甲铵(TTAB)(所有这些表面活性剂都是由日本Wako Pure Chemical Industries有限公司制造并销售的)。
将这些表面活性剂分别溶解在净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)中以获得10％或2％(w/v)的水溶液，在用于测试前将每份水溶液进一步稀释以获得1％(w/v)的水溶液，在水溶液制备后的15小时以内使用该1％(w/v)的水溶液进行测试。使用净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)作为空白。结果示于表4中。
表4
由此，表明参加测试的任何一种表面活性剂都能令人满意地从全血样品所含的白细胞中释放出固有MPO。
实施例5各种表面活性剂的MPO释放效果通过与实施例3相同的方法，相对于固有MPO从全血样品含有的白细胞中被有效释放的效果对下述表面活性剂进行测评。这些表面活性剂如下所述氯化十六烷基吡啶鎓的一水合物(HPC)，溴化十六烷基吡啶鎓的一水合物(HPB)，氯化十六烷基三甲铵(HTAC)，溴化n-十二烷基三甲铵(DTAB)，溴化十六烷基三甲铵(HTAB)，氯化1-月桂基吡啶鎓(LPC)，溴化十四烷基三甲铵(TTAB)，(其中上述所有表面活性剂都是由日本Wako Pure ChemicalIndustries有限公司制造并销售的)氯化二癸基二甲铵(DDAC)，以及氯化十八烷基三甲铵(OTAC)(其中最后两种表面活性剂是由日本油脂有限公司制造并销售的)。
将这些表面活性剂分别溶解在净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)中以获得10％或2％(w/v)的水溶液。在用于测试之前，将每份水溶液进一步稀释以获得1％(w/v)的水溶液，在水溶液制备的15小时以内使用该1％(w/v)的水溶液进行测试。使用净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)作为空白。结果示于表5中。
表5
由此，表明参加测试的任何一种表面活性剂都能令人满意地从全血样品所含的白细胞中释放出固有MPO。
实施例6MPO的释放量与表面活性剂的HLB值之间的关系为测量下述各表面活性剂的MPO释放效果，利用与实施例3相同的方式执行血样采集、表面活性剂处理和ELISA。
参加测试的表面活性剂为以下非离子表面活性剂NonidetTM-P40(由日本Nacalai Tesque有限公司制造并销售)，TritonTMX-114(由日本Nacalai Tesque有限公司制造并销售)，TritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)，TritonTMX-207(以美国SIGMATM牌制造并销售)，TritonTMX-305(以美国SIGMATM牌制造并销售)，BrijTM35(以美国SIGMATM牌制造并销售)，BrijTM56(以美国SIGMATM牌制造并销售)，BrijTM58(以美国SIGMATM牌制造并销售)，BrijTM97(以美国SIGMATM牌制造并销售)，
BrijTM98(以美国SIGMATM牌制造并销售)，IgepalMCA630(以美国SIGMATM牌制造并销售)，TweenTM65(以美国SIGMATM牌制造并销售)，TweenTM85(以美国SIGMATM牌制造并销售)，TweenTM20(由美国Bio-Rad实验室制造并销售)，以及TritonTMX-45(由瑞士Fluka制造并销售)。
将这些表面活性剂分别溶解在净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)中以获得10％或2％(w/v)的水溶液。在用于测试之前，将每份水溶液进一步稀释以获得1％(w/v)的水溶液，在水溶液制备后的15小时内使用该1％(w/v)的水溶液进行测试。使用净化水(由日本Kyoei Seiyaku公司制造并销售)作为空白。
如图1所示，发现从表面活性剂处理的全血的白细胞中释放出的MPO量的变化，取决于表面活性剂的HLB值，还发现HLB值为12到14的表面活性剂适用于从白细胞中释放MPO。
实施例7和比较例1和2髓过氧化物酶、乳铁蛋白和弹性蛋白酶中每一种与白细胞个数和嗜中性白细胞个数中每一种之间的关系在实施例7和比较例1和2中，所用为从13个健康人获取的全血样品(A组)和从14个已知患有具体疾病的不健康人抽取的全血样品(B组)。取每份全血样品10ml置于含10mgEDTA-2K(由日本DojinLaboratories制造并销售)的试管中，将所得含EDTA的全血样品搅拌均匀。取出一部分所得含EDTA的全血样品，利用CELL-DYNETM3500(由美国DAINABOT制造并销售)测定其白细胞个数和嗜中性白细胞个数。此外，取出1ml含EDTA的全血样品，将100μl含11％(w/v)TritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)的水溶液加到取出的1ml全血样品中，将得到的混合物搅拌均匀，然后在室温下使其静置1小时，以便溶解全血内所含的白细胞，从而获得含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)。
(1)髓过氧化物酶的测量(实施例7)
按下述方法测量髓过氧化物酶(MPO)的浓度。用样品稀释缓冲剂(20mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4)，内含0.1％牛血清蛋白和0.2％叠氮化钠)将上述含溶解了白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)稀释2000倍，该缓冲剂附属于BIOXYTECTMMPO酶免疫测定试剂盒(由美国OXIS International有限公司制造并销售)，然后将所得的经稀释的混合物作为测量髓过氧化物酶(MPO)的样品。
对于上述用于测量MPO的样品和标准MPO溶液(它是通过将商品的MPO溶解在上述缓冲剂中得到的)，利用BIOXYTECTMMPO酶免疫测定试剂盒(由美国OXIS International有限公司制造并销售)依照其所附说明书实现对MPO浓度的测量。具体地说，对于上述样品的MPO浓度测量，将MPO(由美国Elastin Products有限公司制造并销售)加到样品中，从而使所加MPO的最后浓度变为5ng/ml或10ng/ml，测量所得到的混合物的MPO浓度。由所得的MPO浓度值获得每个样品的标准曲线。基于所获标准曲线与根据标准MPO溶液获得的标准曲线之间的关系校正样品的标准曲线，利用经校正的每个样品的标准曲线测定全血中的MPO浓度。进行3次测量，获得平均值。
乳铁蛋白的测量(比较例1)按下述方法测量乳铁蛋白(LTF)的浓度。用样品稀释缓冲剂(20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)，内含150mMNaCl、2mg/ml牛血清蛋白和0.1％的TweenTM20和0.01％的硫柳汞)将上述含溶解了白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)稀释2000倍，该缓冲剂附属于BIOXYTECTMLactof酶免疫测定试剂盒(由美国OXIS International有限公司制造并销售)，然后将所得的经稀释的混合物作为测量乳铁蛋白(LTF)的样品。
对于上述用于测量LTF的样品和标准LTF溶液(它是通过将商品的LTF溶解在上述缓冲剂中得到的)，利用BIOXYTECTMLactof酶免疫测定试剂盒(由美国OXIS International有限公司制造并销售)依照所附说明书实现对LTF浓度的测量。具体地说，对于上述样品的LTF浓度测量，将LTF(由美国ICN Pharmaceutical有限公司制造并销售)加到样品中，从而使所加LTF的最后浓度变为5ng/ml或10ng/ml，测量所得混合物的LTF浓度。由所获的LTF浓度值获得每个样品的标准曲线。基于所获标准曲线与根据标准LTF溶液获得的标准曲线之间的关系校正样品的标准曲线，利用经校正的每个样品的标准曲线测定全血中的LTF浓度。进行3次测量，获得平均值。
弹性蛋白酶的测量(比较例2)按下述方法测量弹性蛋白酶(ELT)的浓度。用样品稀释缓冲剂(20mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4)，内含0.1％牛血清蛋白和0.2％叠氮化钠)将上述含溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)稀释2000倍，该缓冲溶液附属于PMN弹性蛋白酶试剂盒(由美国MERCK制造并销售)，然后将所得的经稀释的混合物作为测量弹性蛋白酶(ELT)的样品。
对于上述用于测量ELT的样品和标准ELT溶液(它是通过将商品的ELT溶解在上述缓冲剂中得到的)，利用PMN弹性蛋白酶试剂盒(由美国MERCK制造并销售)依照其所附说明书实现对ELT浓度的测量。具体地说，对于上述样品的ELT浓度测量，将附属于试剂盒的ELT加到样品中，从而使所加ELT的最后浓度变为5ng/ml或10ng/ml，测量所得混合物的ELT浓度。由所得ELT浓度值获得标准曲线。基于所得标准曲线与根据标准ELT溶液获得的标准曲线之间的关系校正样品的标准曲线，利用经校正的每个样品的标准曲线测定全血中的ELT浓度。进行3次测量，获得平均值。
在表6中示出了实施例7和比较例1和2的结果(健康人全血和非健康人全血中MPO、LTF和ELT的浓度)以及血液中白细胞的个数和嗜中性白细胞的个数。
表6
此外，基于有关健康人全血样品(A组)和非健康人全血样品(B组)的所有测量结果，检测白细胞个数与固有物质(MPO、LTF和ELT)浓度之间的相互关系，结果示于图2(a)到2(c)中。另外，检测嗜中性白细胞个数与固有物质(MPO、LTF和ELT)浓度之间的相互关系，结果示于图3(a)到3(c)中。
如图2(a)到2(c)和3(a)到3(c)所示，可发现固有物质(MPO、LTF和ELT)的浓度与白细胞个数以及嗜中性白细胞个数之间存在下述相关性。
表示MPO浓度(y)与白细胞个数(x)之间关系的回归函数如下所示y＝0.0019x+0.6981 (R＝0.9034)(如上所述，R表示相关系数。这适用于下面所提到的所有R。)表示MPO浓度(y)与嗜中性白细胞个数(x)之间相互关系的回归函数如下所示y＝0.0018x+5.5395 (R＝0.9088)表示LTF浓度(y)与白细胞个数(x)之间相互关系的回归函数如下所示y＝0.0014x+1.6278 (R＝0.8275)表示LTF浓度(y)与嗜中性白细胞个数(x)之间相互关系的回归函数如下所示y＝0.0013x+5.3757 (R＝0.8190)表示ELT浓度(y)与白细胞个数(x)之间相互关系的回归函数如下所示y＝0.0032x-8.4464 (R＝0.8076)表示ELT浓度(y)与嗜中性白细胞个数(x)之间相互关系的回归函数如下所示y＝0.0032x-1.0451 (R＝0.8367)由此表明白细胞个数和嗜中性白细胞个数都显现出与MPO浓度的良好相关性。
实施例8和比较例3和4针对健康人的全血样品组和非健康人的全血样品组进行的MPO、LTF和ELT中每个的浓度与白细胞个数之间相互关系的分析将实施例7和比较例1和2中获得的数据分成健康人全血样品(A组)的数据和非健康人全血样品(B组)的数据，A组中每个样品的白细胞个数小于10000个细胞/微升，B组中每个样品的白细胞个数为10000个细胞/微升或更多。根据A组和B组中的每个数据分析MPO、LTF和ELT中每个的浓度与白细胞个数之间的相互关系。结果示于图4(a)到4(c)和图5(a)到5(c)中。
对A组(健康人的全血样品)数据的分析表明，对于A组，与LTF浓度与白细胞个数之间的相关系数(R)(y＝0.0016x-0.7488；R＝0.7929)和ELT浓度与白细胞个数之间的相关系数(R)(R＝0.8676；y＝0.0017x-1.33)中的任一个相比，MPO浓度与白细胞个数之间的相关系数(R)很高，具体R＝0.9336(y＝0.0021x-0.2414)。因此判断在健康人全血样品的情况下，可通过测量MPO浓度获得最精确的白细胞个数测定结果。
此外，对B组(非健康人的全血样品)的数据分析表明，对于B组，与LTF浓度与白细胞个数之间的相关系数(R)和ELT浓度与白细胞个数之间的相关系数(R)中的任一个相比，MPO浓度与白细胞个数之间的相关系数(R)很高，具体为R＝0.7318。此外，对于B组数据，注意到了表示MPO、LTF和ELT中每个的浓度与白细胞个数间相互关系的回归线斜率。将B组中MPO、LTF和ELT的浓度对白细胞个数的回归线斜率分别与A组中MPO、LTF和ELT的浓度对白细胞个数的回归线斜率进行比较。比较结果如下。表示B组中MPO浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率为0.0019(y＝0.0019x+0.5678)，该斜率与表示A组中MPO浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率(0.0021)接近。与此相反，表示B组中LTF浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率为0.0007(y＝0.0007x+13.447)，该斜率与表示A组中LTF浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率0.0016相差很大，即，这表明，在LTF的情况下，基于B组获得的回归线斜率是基于A组获得的回归线斜率的大约1/2.3那么小。此外，B组中表示ELT浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率为0.0031(y＝0.0031x-5.4788)，该斜率与A组中表示ELT浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线斜率0.0017相差很大，即，这表明，在ELT的情况下，基于B组获得的回归线斜率是基于A组获得的回归线斜率的约1.8倍那么大。另外还可以发现，在从患有梗阻性黄疸、急性胰腺炎和急性胆囊炎的患者获取全血样品的情况下，ELT浓度要比MPO和LTF的浓度高许多，并且ELT浓度显现出与表示全血中ELT浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线的很大偏差。
因此判断，在非健康人全血样品的情况下，也可通过测量MPO浓度获得最精确的白细胞个数测定结果。
实施例9人全血样品中(包括那些白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的全血样品)MPO浓度与白细胞个数和嗜中性白细胞个数中每一种之间的相互关系对从门诊病人获取的46份全血样品进行检验。分别使用TritonTMX-100、TritonTMX-114和IgepalTMCA630作为溶解白细胞的表面活性剂。通过与实施例1中相同的方式用表面活性剂处理全血样品，通过与实施例2中相同的方式测量MPO浓度。利用Coulter GEN·S系统(由美国COULTER ELECTRONICS有限公司制造并销售)测定白细胞个数和嗜中性白细胞个数，获得MPO浓度与白细胞个数和嗜中性白细胞个数中每一个之间关系的相关系数。测量3次，得到平均值±标准偏差。
关于白细胞个数的结果示于图6中。在使用TritonTMX-114的情况下，MPO浓度与白细胞个数之间关系的相关系数(R)为R＝0.8430(p＜0.0001)(y＝0.0022x+3.324)。在使用TritonTMX-100的情况下，MPO浓度与白细胞个数之间关系的相关系数(R)为R＝0.9066(p＜0.0001)(y＝0.002x+2.1757)。在使用IgepalTMCA630的情况下，MPO浓度与白细胞个数之间关系的相关系数(R)为R＝0.9061(p＜0.0001)(y＝0.0019x+2.4259)。由此，可判断MPO浓度与白细胞个数之间存在良好的相关性。因此，可以断定，在人体全血样品(包括那些白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的血样)的情况下，MPO浓度可作为白细胞个数的精确指标。
MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间的相互关系示于图7中。在使用TritonTMX-114的情况下，MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间关系的相关系数(R)为R＝0.8789(p＜0.0001)(y＝0.0025x+7.4089)。在使用TritonTMX-100的情况下，MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间关系的相关系数(R)为R＝0.9364(p＜0.0001)(y＝0.0023x+5.9748)。在使用IgepalTMCA630的情况下，MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间关系的相关系数(R)为R＝0.9405(p＜0.0001)(y＝0.0022x+6.0951)。由此，可判断MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间存在良好的相关性，并且注意到，当这些结果与白细胞个数的结果比较，并且当这些比较是相对于同一表面活性剂进行时，MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间的相关性要高于MPO浓度与白细胞个数之间的相关性。因此，如图7所示，可以判断，在人体全血样品(包括那些白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的血样)的情况下，MPO浓度可作为嗜中性白细胞个数的精确指标。
实施例10基于MPO浓度测得的白细胞个数/嗜中性白细胞个数与利用血细胞计数装置测得的白细胞个数/嗜中性白细胞个数之间的相关性对从门诊病人获取的46份全血样品进行检验，该样品与实施例9中的样品相同。使用TritonTMX-100作为溶解白细胞的表面活性剂。通过与实施例2中相同的方式测量MPO浓度。将所得MPO浓度代入到实施例7中得到的回归函数中(该函数表示MPO浓度与白细胞个数之间的相互关系)即函数y＝0.0019x+0.6981(见图2(a))，由此得到白细胞个数。此外，通过血细胞计数装置测定白细胞个数，该计数装置具体为Coulter GEN·S系统(由美国COULTER ELECTRONICS有限公司制造并销售)。基于MPO浓度测得的白细胞个数与通过血细胞计数装置测得的白细胞个数之间的相关关系示于图8(a)中。
从图8(a)中明显看到，可以确定的是，即使在人体全血样品(包括白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的血样)的情况下，在通过本发明的方法测得的白细胞个数与通过血细胞计数装置测得的白细胞个数之间存在良好的相关性(y＝1.0333x+777.69；R＝0.907)。因此，通过提前准备表示全血样品中MPO浓度与白细胞个数之间相互关系的回归线，通过测量全血样品中MPO的浓度可容易地获得全血样品中白细胞的数量，其中所得到的白细胞个数显现出与通过血细胞计数装置测得的白细胞个数之间存在良好的相关性。由此，通过本发明的方法，即使在人体全血样品包括那些白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的血样的情况下，也可以容易地实现全血样品中白细胞个数的精确测定。
此外，将上面获得的MPO浓度也代入实施例7中得到的回归函数中(该函数表示MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间的相互关系)，即函数y＝0.0018x+5.5395(见图3(a))，由此得到嗜中性白细胞的个数。另外，利用血细胞计数装置、即Coulter GEN·S系统(由美国COULTER ELECTRONICS有限公司制造并销售)测定嗜中性白细胞的个数。基于MPO浓度测得的嗜中性白细胞个数与利用血细胞计数装置测得的嗜中性白细胞个数之间的相关关系示于图8(b)中。
从图8(b)中明显看到，可以确定的是，即使在人体全血样品包括那些白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的血样的情况下，在通过本发明的方法测得的嗜中性白细胞个数与利用血细胞计数装置测得的嗜中性白细胞个数之间存在良好的相关性(y＝1.2542x+241.85；R＝0.936)。因此，通过提前准备表示全血样品中MPO浓度与嗜中性白细胞个数之间相互关系的回归线，通过测量全血样品中MPO的浓度可容易地获得全血样品中嗜中性白细胞的个数，其中所得的嗜中性白细胞个数显现出其与利用血细胞计数装置测得的嗜中性白细胞个数之间存在良好的相关性。由此，通过本发明的方法，即使在人体全血样品包括那些白细胞个数为10000个细胞/微升或更多的血样的情况下，也可以容易地实现全血样品中嗜中性白细胞个数的精确测定。
实施例11在一个样品中对MPO浓度和CRP浓度的测量向10ml白细胞个数为4800个细胞/微升的健康人全血中加入1mlTritonTMX-100(以美国SIGMATM牌制造并销售)浓度为11％(w/v)的水溶液，将所得到的混合物搅拌均匀，然后在室温下使其静置60分钟，以便溶解白细胞从而获得含有溶解了的白细胞的混合物(全血样品/表面活性剂)。将所获得的混合物指定为“样品A”。从中取出部分样品A，向该取出部分中加入MPO(由美国Elastin Products有限公司制造并销售)和CRP(由日本Oriental Yeast Industries有限公司制造并销售)，由此使所加MPO和CRP的最后浓度分别为10μg/ml和2μg/ml，从而获得样品B。从中取出另一部分样品A，向该取出部分加入MPO和CRP，从而使所加MPO和CRP的最后浓度分别为20μg/ml和10μg/ml，由此得到样品C。从中再取出一部分样品A，向该取出部分加入MPO和CRP，使所加MPO和CRP的最后浓度分别为30μg/ml和50μg/ml，由此得到样品D。
提供一种表面涂有聚硅氧烷聚合物的硅片(该硅片由美国BioStar制造并销售)，在国际申请公开第WO94/03774号中描述了这种硅片。在4℃下将硅片浸到家兔抗人体MPO抗体(由美国Calbiochem-Novabiochem公司制造并销售)在0.1M HEPES中的10μg/ml溶液(pH8.0)中24小时，或浸入到家兔抗人体CRP抗体(由日本Oriental Yeast Industries有限公司制造并销售)在0.1MHEPES中的10μg/ml溶液(pH8.0)中24小时，由此使抗-MPO抗体或抗CRP抗体吸附到涂覆了聚硅氧烷的硅片表面上。然后，用水清洗吸附了抗体的硅片，利用氮气去除硅片上存留的水滴，接着进行空气干燥。
可用0.1M HEPES(PH8.0)溶液将上述样品A、B、C和D每个分别稀释100倍，得到稀释后的溶液。从每份取出稀释后的溶液10μl，并分别在Eppendorf管内混和30μl的HRP-标记的抗-MPO抗体溶液或在Eppendorf管内混和30μl的HRP-标记的抗-CRP抗体溶液(其中通过与实施例2中相同的方式对抗体进行HRP标记)，在室温下使得到的混合物分别反应10分钟。
分别从反应后的混合物中取出30μl，将其置于上述吸附了抗-MPO抗体或抗-CRP抗体的硅片上，在室温下静置10分钟。然后用水清洗这样处理的硅片，利用氮气去除硅片上存留的水滴，接着进行空气干燥。干燥后立即将30μl TMB色基(fast)(由美国Kirkegaad&PerryLaboratories制造并销售)加到硅片上，反应5分钟，从而在硅片表面上形成沉淀层。上述反应完成后，用水清洗硅片，用氮气去除硅片上存留的水滴，接着进行空气干燥，从而获得载有蛋白的硅片，其中所述蛋白已经与硅片上固定的抗体结合，并已经被显象。目视检测显象蛋白的着色度，用从以下符号组成的组中选择评价符号“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”，它们的顺序是从低着色度到高着色度。结果示于表7中。
表7
从表7可清楚看到，对于用表面活性剂处理全血样品得到的样品，即可以测定MPO浓度也可以测定CRP浓度。
实施例12利用安装了偏振片的椭球偏光计(入射角70，入射侧偏振片的角度20，检测侧偏振片的角度；10，He/Ne激光器)(由日本SigmaKoki有限公司制造并销售)测量实施例11中获得的硅片(其上面形成有沉淀层)的沉淀层厚度，从而测得每个样品中的蛋白量。测量进行10次，获得平均值。结果示于表8中。
表8
从表8可清楚看到，对于用表面活性剂处理全血样品得到的样品，既可以测定MPO浓度也可以测定CRP浓度。
工业实用性通过本发明的测定白细胞个数的方法，无需从全血样品中分离血细胞就能简单而又快速地完成全血样品中白细胞个数和/或嗜中性白细胞个数的测定。此外，通过本发明的测定方法，除可测量全血样品中的白细胞个数外，还可测量同一全血样品中所含的C-反应性蛋白的浓度。因此，通过本发明的方法，可快速、简单而又廉价地诊断感染性疾病的存在或不存在和炎症的严重程度。
权利要求
1.一种测定全血样品中白细胞个数的方法，它包括(a)将全血样品与表面活性剂混合，从而获得混合物；(b)使所述混合物静置足够时间，以便溶解所述全血样品中所含的白细胞，并从所述白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；(c)测量所述混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度；以及(d)基于所述释放出的髓过氧化物酶浓度测定所述全血样品中白细胞的个数。
2.根据权利要求1的方法，其中，在步骤(c)中，除测量所述释放出的髓过氧化物酶的浓度外，还测定所述全血样品中所含的C-反应性蛋白的浓度。
3.根据权利要求1的方法，其中，在步骤(c)中通过免疫方法测量所述释放出的髓过氧化物酶的浓度。
4.根据权利要求2的方法，其中，在步骤(c)中通过免疫方法既测量所述髓过氧化物酶的浓度又测量所述C-反应性蛋白的浓度。
5.根据权利要求3或4的方法，其中所述免疫方法为酶免疫测定。
6.根据权利要求3或4的方法，其中所述免疫方法为光学免疫测定。
7.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
8.根据权利要求7的方法，其中所述非离子表面活性剂的亲水亲油平衡(HLB)值为12到14。
9.根据权利要求7的方法，其中所述非离子表面活性剂为聚环氧乙烷类化合物，其具有与之结合的饱和或不饱和烃。
10.根据权利要求9的方法，其中所述非离子表面活性剂是至少一种从以下物质组成的组中选择的非离子表面活性剂具有聚氧乙烯烷基苯基醚结构的非离子表面活性剂、作为具有与之结合的不饱和脂肪族烃的聚环氧乙烷类化合物的非离子表面活性剂、以及具有聚氧乙烯烷基醚结构的非离子表面活性剂。
11.根据权利要求10的方法，其中所述非离子表面活性剂是至少一种从以下物质组成的组中选择的非离子表面活性剂TritonTMX-114、TritonTMX-100、IgepalTMCA630、Nissan Nonion NS-208.5、Nissan Dispanol TOC、BrijTM97和BrijTM56。
12.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中所述表面活性剂是至少一种从以下物质组成的组中选择的阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基三甲铵、氯化二癸基二甲铵、氯化十二烷基三甲铵、溴化十二烷基三甲铵、氯化十八烷基三甲铵、溴化四癸铵、氯化十二烷基吡啶鎓、氯化十六烷基吡啶鎓、溴化十六烷基吡啶鎓、氯化1-月桂基吡啶鎓和溴化十四烷基三甲铵。
13.根据权利要求1到12中任一项的方法，其中所述表面活性剂与所述全血样品混合的量使得所述混合物中所述表面活性剂的浓度为0.2到10％(w/v)。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法，其中在步骤(b)中使所述混合物静置不超过1小时。
15.根据权利要求1到14中任一项的方法，其中所述白细胞的个数为嗜中性白细胞的个数。
全文摘要
公开了一种测定全血样品中白细胞个数的方法,该方法包括:将全血样品与表面活性剂混合从而获得混合物;将混合物静置足够时间,以便溶解全血样品中所含的白细胞,并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶;测量混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度;基于释放出的髓过氧化物酶浓度测定全血样品中白细胞的个数。还公开了这样一种方法,其中除测量全血样品中白细胞的个数外,还测量同一全血样品中所含的C－反应性蛋白的浓度。
文档编号G01N33/543GK1342265SQ00804424
公开日2002年3月27日 申请日期2000年3月29日 优先权日1999年3月29日
发明者畑中美博, 芹泽领 申请人:旭化成株式会社