专利名称：Ers基因,筛选能够在植物中诱导ers的化合物的方法
背景技术：
本发明涉及一种检测化合物在植物中诱导针对病原菌增强的抗性状态(ERS)的能力的方法，也涉及上述方法在筛选能够在植物中诱导ERS的化合物上的用途。另一方面，本发明还涉及编码多肽或其部分的DNA分子，其表达在它们天然的遗传环境下可以被ERS诱导化合物诱导、并且可以用按照本发明的方法分析，本发明进一步涉及转基因植物，包含所说DNA分子的植物部分或种子，由该DNA分子编码的多肽/蛋白或其部分以及特异性识别和结合该多肽/蛋白或其部分的抗体。
植物的增强的抗性状态(ERS)是生物和/或化学诱导抗性现象的结果，该抗性现象特别包括由根瘤杆菌介导的系统获得性抗性(SAR)和诱导的系统抗性(ISR)。
在最近十年，积累了使人信服的数据，即水扬酸(SA)对双子叶植物对广谱病原菌的系统获得性抗性的建立是必不可少的(例如，Yang等，基因和发育11，1621-1639(1997))，因而导致那些植物的增强的抗性状态(ERS)。
与SAR相反，导致ERS的被总结为术语ISR的其它植物防御反应，例如根瘤杆菌介导的抗性(植物病理学年评36，453-483(1998)和包括蛋白酶抑制剂1和2基因表达的茉莉酸介导的伤口反应，是不能由水杨酸或其它的SAR诱导化合物诱导的，有时甚至受到水杨酸或其衍生物的抑制(例如Doares等，植物生理学108，1741-1746(1995))。
美国专利5,614,395公开了一种在含有嵌合基因的遗传改良植物的辅助下筛选诱导SAR的农业化学品的方法，所述嵌合基因对诱导SAR的化合物产生反应，它作为一种小麦基因如WCI-1被公开。该方法只是限于对此嵌合基因敏感的植物种类上，尤其是限于小麦上。
国际专利申请WO 98/00023提出了一种通过检测植物防御基因如PDF 1的表达，筛选诱导抗性活性的化合物的方法，此处公开的一些基因是由植物病原菌如Alternaria brassicicola或Botrytiscinera诱导，但不能被诱导SAR的农业化学品如水杨酸或二氯异烟酸诱导。
直到现在，尚未报道与本发明序列相对应的基因对SAR诱导化合物的反应性。因而，还没有促动因素去利用本发明基因的天然存在的表达水平或产物筛选包括SAR诱导化合物在内的ERS诱导化合物。
从EP 0 734 530，EP 0 816 309和EP 0 818 431的实施例得知，合成组合文库的产生。然而，直到现在才可能筛选这种文库以便选择具有药用性质的化合物。因此，非常合乎需要的是开发一种高通量的筛选方法，以产生用作农业研究的重要化合物、尤其是筛选ERS诱导化合物的方法。
发明概述本发明是根据最令人惊奇的发现一种新基因与传统的致病相关(PR)基因分开存在，其表达可由SAR诱导化合物诱导，在一个特定的实施方案中，可由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。
该发现能够建立一些新方法，以检测化合物和天然产物在植物中诱导增强的抗性状态(ERS)、尤其是SAR或ISR的能力，以及筛选多种化合物，以获得在植物中具有诱导ERS能力的化合物或组合物。该发现使得能够在转基因植物中使用包含这些DNA分子的重组DNA分子赋予植物对病虫害生物体增强的耐受性。
本发明涉及具有下面(A)至(H)序列的DNA分子，这些序列编码多肽或其部分，其表达可由ERS诱导化合物诱导A(346bp)ACATGAAGAG CAGCGACGGC AAGGTCTACG ACTCCTTCAC CATCCACAGG 50GATTACCGCG ACGTGCTCAG CTGCGTGCAC GACAGCTGCT TCCCCACCAC100GCTCGCTAGC TAGCTCATAT CGTCCGGCCG TCATGTCAAT GTAATGGAGG150GTCATCCATC CAATAAAATT GTGGGCATGT GTTGAGTAAT AAAATTGGTC200AGCTGCACAA TTTATATGTG CTAGTAAAAA GATCATGCAA GAGGTGGGTG250TATGCTCGTT ATATATGCTT TGTAACTCCT TCATGTCATA TTWTTATGGG300TTAATAAAAA CATCCTTTAT CAAAAAAAAA AAAAAaAAAA GCTTGT350B(292bp)ACAGTATTGG TTGATATGAT TGCTAATCCG GCCCTAGCTC GCGCAGTAAG 50GGCATCTCCA ATGATTGTAT GATCATCGTT GGTAATATTG CCACATAGAT100GATTTTGATG ACATGACGCC TAATAAAAGA AGAAAGAGAA TGAAATCGTA150TGAACTTGAA GCAACGGTTC ACGCACAAGC TCCGAGGCAA AGCATGGTTA200TTTCTTCCAT GTTTAGTGGA CCCGCAATGC ATGCATGGAG GTGTATCTTA250CGATTGATCG CAATTAATAA AGTGTTTCGG TACGATAGTA GCC(387bp)ACTTATCTTG AGCATGACAT TAGTCAGCAA ACATCCGGCG aTCATCAGAA 50GaTCTTACTA GCCTATGTGG GCATTCCACG CTACGAAGGT CCAGAGGTTG100ATCCCACTAT AGTGACACAT GATGCGAAGG ACCTCTACAA AGCTGGTGAG150AAGAAGCTGG GCACAGATGA GAAAACCTTC ATCCGCATCT TCACTGAACG200CAGCTGGGCA CACATGGCAG CTGTTGCTTC TGCTTACCAG CACATGTATG250MTCGGTCATT ACAGAAGGTT GTGAAGAGTG AAACATCTGG AAACTTTGAA300GTTGCTCTGA TaACTATCCT CAGATGTGCT GAGAATCCAG CTAAGTaTTT350TGCTAAGGTG TTAAGGAAGT CCATGAAAGG TCTAGGTE(512bp)ACAGAAGCTT GGACAGTTCC ACTCGGAAGC TTCGGTTCGC GCTACCGTTC 50CCGATGCTCG CCTACCCATT CTACTTGTGG TCAAGGAGTC CAGGGAAGTC100AGGCTCGCAT TTCCACCCGA GCAGCGATTT GTTCCAGCCG AACGAGAAGA150ACGACATACT GACGTCGACG ACATGCTGGC TTGCCATGGC TGGCCTGCTC200GCTGGGCTCA CTGCCGTGAT GGGCCCCCTT CAGATACTCA AGCTCTACGC250CGTCCCCTAC TGGATTTTTG TTATGTGGCT GGACTTTGTC ACCTACCTGC300ACCACCACGG CCACAACGAC AAGCTTCCCT GGTATCGCGG AAAGGCATGG350AGCTATCTGC GCGGGGGCCT GACAACGCTC GACAGGGACT ACGGGTGGCT400CAACAACATC CACCACGACA TCGGGACTCA CGTGATCCGC CATCTTTTCC450CGCAAATCCC GCATTACCAT CTAGTGGAGG CGACCGAGGC GGCGAACAGS500TGCTAGGGAA GTF(484bp)ACAAGCTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGTGG TAAACAACAA150CTGCTTCATA TGAACAACGG GCTTGACAAT CAAAATTCTT CCATATGTTG200TTATTATACA AAAAATTGCT TAGAGCCAGA GTGAAATTAC ATCAAAGGCC250TTTAAAACTT TGTTATAAAA TCTAGTCTCA AACTCCCCCT CGTCTACAGG300TGTTCTCCGA GATATTCTCC CCTTGCCTCC AGTGCGAAAT TTCTGCTATG350TCTATGCTCT ATTCACACGG ATGGTTTGTC CTTCCAATTC TGTGTTGTTG400AAAGTAGAAA CCACAGCTTC AACTTCCTCC TCTGAAGAAA ACGTGACAAA450ACCATATCCC TTGGACTTTG GGGTTCCCGG AATTCGGGAT ACCGTGGCAC500TGAGGACCTC CCCCTTTTCA GAGAAGAAGT TCTTGAGAAC TTCCGTCGTC550ACTTTCTTCG CAAGATTGCC AACATAAACC TTGTG(305bp)GTCAAGTTCA CGCCTGCCGA ATCGAGGATG ASTGCGCCGC CCCAAAAGCC 50CCCGCCGGAG AGGAGAAGAA GACGTCATGG CCGGAGGTAG CGGGAAAGTC100CATCGAGGAG GCCAAGGAGA TCATCCTTAA GGACATGCCT GAAGCGGACA150TCGTCGTCCT CCCAGCCGGC TCGCCGGTGA CCCTCGACTT CAGGACCAAC200CGTGTCCGCA TCTTCGTCGA CACTGTCGCG TCCACTCCCC ACATTGGCTA250GCTAGCTTTG CAAGCAAAGG CAACATGGAT GCATTGTGGA TGCTGATGAA300TAAGTH(1035bp)CAGGATCATA GCTACAGGCG ACAATGCCCG GTCATCGACA ATCGCTGGCA 50GCGGCTTCTC TGAAGCTACC ATCTCTTCTG CTTCTGTGGA TCTTTAGCTG 100GAACTGGGGG CATGCCGTGG CCAAGTTTGA TCCTGCAAAC ATGACGGAGC 150TTCAGAAACA TGTCTCCTTT TTCGACCGGA ACAAGGATGG CTTCATCACT 200CCTACAGAAA CCATCCAAGG GTTTGTTGCA ATCGGTTGCG AGTATGCATT 250TGCTACTGCT GCCTCTGCCG CCATTCACGG TGCCCTTGCT CCTCAAACAA 300CCCCGGCTGG TACACCACTG CCTCACTTGA CAATATACGT AGAGAATATC 350CACAAAGCTA TGCATGGAAG TGATCCAGGT GTATATGATG CCAAAGGAAG 400GTTTCTTCCC CAAAACTTTG AGGAATTATT CAAAACATAT GCAATACTCC 450GACCAGATGC GTTGACTCTT GCGGAGATGC ATGTGATGCT CTTTGCAAAA 500CGGGATCTAG ACCCTATATC ATGGGCACCA CCACAGGTTG AGTGGGGCCT 550ATTATTCACG CTTGCAAGCG ATTGGCTTGG GTTCCTTCAC AAAGACAGTG 600TTAGAGGTAT ATATGATGGA AGCCTGTTTA TCAAGTTGGA AAAGAAATGG 650CACCCTTTTC AAAGTGCTAT GCGATGAACT TGGTGCTAGT TTAGAGTGAG 700AGTTTGGATA TGGAAAGGTT TGTCCCGAAG AAGGTTTTCC TGCTATCTCC 750AAATTCAACT AGAGTTTATT TTCTTTTCCT CCAAGTTGTA ATTGGTTTTA 800TAAGACCTTC ATAGCCGATC AATACAACGA AGCAAGTTGG ATATATTTCC 850CGACCTTGTA TTCTCTCTCA TGKGCCCCTT ATTATGTTTG CGCCATGAGC 900GCCTACCCAA GAKGAGCCAT AAGCATAAGG CTCATCCACC TATTGGCCAC 950GACTACTGTT GGAAATATTC CCTACAKGCA ATATTGKGAK GAWAAWATTT1000ATCTATAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA本发明也涉及一种检测化合物在植物中诱导增强的抗性状态(ERS)之能力的方法，所说的方法包括(a)将植物或植物部分与化合物接触，该植物或植物部分包含表达可由SAR诱导化合物诱导的具有序列(A)至(H)的基因片段，该基因片段编码多肽/蛋白质或其部分和(b)分析所说的基因片段的表达，其中所说的基因片段的表达表明所说的化合物具有诱导ERS的能力。
在一个特定的实施方案中，由SAR诱导化合物诱导的上述基因片段(A)至(H)的表达是不能被植物病原菌诱导的。在另一优选实施方案中，上述基因片段的表达还可另外由ISR诱导化合物诱导。
此外，按照本发明的方法，在不同的植物种类，例如谷物如小麦或大麦，及稻米中筛选ERS诱导化合物；测定样品中的ERS诱导化合物的存在；测定样品中的ERS诱导化合物的浓度；比较两个诱导化合物在植物中诱导ERS的相对能力；和检测化合物和化学组合物改变化合物的ERS诱导效果的能力。
本发明的另一方面涉及用于本发明方法中的试剂盒。
本发明的另一方面涉及一种用于提供在植物中具有诱导ERS能力的化合物方法，包括；(a)产生不同化合物的一种合成组合文库，和(b)按照本发明的筛选方法，筛选上述文库的化合物。本发明的另一方面是新化合物，其在该方法的帮助下是可获得的，以及新化合物作为农业化学品的用途。
本发明涉及编码多肽/蛋白的DNA分子，其表达可按照本发明的方法分析；关于上述DNA分子的片段，该片段可用作探针或引物；也涉及包含上述DNA分子的已转化的微生物、转基因植物、植物部分或种子；涉及上述DNA分子编码的多肽和蛋白以及特异性识别和结合上述多肽和蛋白的抗体。
本发明的这些和其他目的和特征从下文陈述的详细描述中将变得十分明了。
优选实施方案的详细描述现在已发现化合物诱导植物的ERS的能力可有效地由(a)和(b)检测(a)使植物或植物部分与化合物接触，该植物或植物部分包含有按本发明编码多肽/蛋白或及其部分的(A)至(H)基因片段，其表达可由SAR诱导化合物诱导，尤其是可由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导；和(b)分析上述基因片段的表达。
通过使用上述方法，可以筛选大量的化合物和组合物，以鉴定具有诱导植物ERS的能力的化合物和/或组合物。在一个特定的实施方案中，例如，以组合文库如EP 0 734 530，EP 0 816 309和EP 0 818431中例举说明的组合文库的形式或以收天然化合物和/或组合物的文库或集合的形式或以含有天然化合物和合成化合物和组合物组成的文库的形式，可以提供大量的上述化合物和组合物。
或者，上述方法也可被用来测定样品中能够在植物中诱导ERS的化合物的存在，其中在上面的步骤(a)里，以等量的样品代替化合物接触植物或植物部分，那么，上述基因片段的表达表明在该样品中存在一个或多个能够在植物中诱导ERS的化合物。
在一个特定的优选实施方案中，可由SAR诱导化合物诱导的、且优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导的上述基因片段在上述植物中的表达，是不能由天然存在的病原菌诱导的。在植物病原菌存在的环境中如果打算实施本发明的方法，这种特征似乎特别有价值。这将是在温室或田间使用植物实施本发明的方法时的情行。在这些情况下，上述的特征将保证观察到的上述基因片段的任何表达归因于具有在植物中诱导ERS能力的化合物或组合物的存在。如果在细胞和组织培养系统中按照本发明使用该方法，可以利用上述的具体特征，但并非必要。
在本申请的上下文中，术语“天然存在的植物病原菌”包括所有种类的致病微生物，尤其是植物病原真菌，细菌和病毒。
在上文和下文中使用的术语“植物”和“植物的部分”包括所有种类的植物和植物部分，尤其是叶，根和种子。上述植物或植物部分优选地选自下组植物原生质体，植物细胞，植物组织，愈伤组织组织，发育的小植株，植物叶片，不成熟的整株植物，成熟的整株植物和种子。更具体地说，上述植物或植物部分，尤其是植物细胞或植物叶片是或者来自单子叶植物，诸如谷物，尤其是小麦或者是小麦属的一种植物、更为优选地为小麦属的植物，以及水稻，也可来源于双子叶植物。
步骤“a”的基因片段可以是具有序列(A)至(H)或其部分的任何基因片段，其表达可由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。该定义包括显示这些特点的任何天然存在的基因片段和非天然存在的基因片段，其序列与上述天然存在的基因片段及其变异体以及含有一个或多个部分的前面提到的基因片段和变异体的基因片段的序列具有大量的同源性，其中所有这些基因片段和变异体保持上面表明的特点，即其表达由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。
正如上面已经提到的，在本发明的一个特定的实施方案中，所说的基因片段或变异体的表达是不能由天然存在的病原菌诱导的，这些基因片段或变异体的表达可由SAR诱导化合物诱导，且优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导的。
在另一实施方案中，所说的基因片段(A)至(H)是一种基因片段，其核苷酸序列表现出与核苷酸序列(A)至(H)，或者其变异体很大的同源性，或者包含一个或多个部分的以上给定核苷酸序列，与其具有实质上的同源性的序列或其变体。因此，该术语也包括能与上面给定的核苷酸序列大部分杂交的序列，尤其是在低严紧度的条件下。
在上文和下文使用的术语“其变异体”意味着天然存在的基因片段(A)至(H)的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的替换、变异、修饰、插入、缺失或添加，该基因片段的表达由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导，例如，含有上面给定的核苷酸序列的一种基因片段，假如其变异体的表达还可应用SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。该术语特别地包括自然发生的基因片段(A)至(H)的等位基因变异体，其表达由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导的。该术语也包括合成变异体，其包含或本质上由核苷酸序列组成，这些核苷酸序列能大量地与天然存在的亲本基因片段杂交。这种杂交优选地在低严紧度的条件下进行，在另一个实施方案中，介于低严紧度和高严紧度条件之间进行，在非常特殊的实施方案中，甚至在高严紧度的条件下进行。作为一种规则，低严紧度条件可定义为3倍的SSC，温度为室温至65℃，高严紧度条件为0.1倍的SSC，温度为68℃。SSC是0.15M的氯化钠，0.015M柠檬酸三钠缓冲液的缩写。
在上文和下文中使用的短语“大量的同源性”至少包括与亲本基因序列(A)至(H)的必需核苷酸的同源性，假设其表达还可由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。典型地，当60％或更多的核苷酸与天然存在的亲本基因片段为相同时，即表现为同源性，更典型地为65％，优选地为70％，较优选地为75％，甚至更优选地为80％或85％，特别优选地为90％，95％，98％或99％或更高的同源性。
在本发明方法的一个特定的实施方案中，其表达可由SAR诱导化合物诱导、优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导的基因片段(A)至(H)还包括编码指示蛋白或多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列融合到相对于(A)至(H)的任一DNA分子的基因的编码区。结果，该指示蛋白或多肽的表达由SAR诱导化合物诱导、优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导，而且，当施用ERS诱导化合物时，与(A)至(H)的DNA分子的表达以融合蛋白的形式同时表达。在特定的实施方案中，编码指示蛋白或多肽的上述核苷酸序列编码葡糖醛酸酶，萤光素酶或绿色萤光蛋白(GFP)。此外，指示蛋白可能是赋予对除草剂有耐性的酶、如乙酰乳酸合成酶。
用按照本发明的方法测定的SAR诱导化合物和ISR诱导化合物可被概括为总称“ERS诱导化合物”。该术语包括能提供植物对所有类型有害生物以提高抗性特征的所有化合物，例如对有害微生物，象植物病原真菌，细菌和病毒以及对诸如昆虫、螨和线虫之类的害虫。正如已阐述的，它包括能诱导植物系统获得抗性(SAR)和包括不依赖于于水杨酸的防御机制的诱导系统抗性(ISR)的所有化合物。例如，通过激活细胞死亡反应(HR)，细胞壁的敷着，PR基因表达和/或植保素的积累，ERS诱导化合物在植物中诱导抗性状态。
这些化合物的应用导致被处理植物受到保护，免于受有害微生物，例如植物病原真菌，细菌和病毒以及昆虫、螨和线虫的严重侵染。
SAR诱导化合物包括苯甲酸，水杨酸，二氯异烟酸，聚丙烯酸，氨基丁酸，花生四烯酸及其衍生物和象harpin的天然产物和其它引发物。
另一组SAR诱导化合物为苯并-1，2，3-噻二唑衍生物，例如象美国专利US 4,931,581和US 5,229,384所公开的。
ISR诱导化合物的参照化合物以茉莉酸和它的衍生物如甲基茉莉酸为代表。
已知的ERS诱导化合物优选地被用作筛选新型农用化学品的参照化合物。
借助本发明的方法，通过分析试验化合物，能够容易地测定其它的化合物，尤其是本发明中包括的农用化学品，特别是合成组合文库的个别成员。
ERS诱导化合物，可以纯的形式，以溶液或悬浮液，以粉剂或粉尘，或以农业上应用的其它传统剂型进行应用。这些剂型可以包括固体或液体载体，即与上述ERS诱导化合物一起结合的材料，以促进在植物，组织，细胞或组织培养上的应用，或改善储藏，处理或运输性质。合适载体的例子包括硅酸盐，粘土，树脂，酒精，酮，脂肪族或芳香族碳水化合物等等。如果制成传统的可湿性粉剂，含水的悬浮液或乳剂浓缩液，ERS诱导化合物的剂型可以包括一种或多种传统的表面活性剂，离子的或非离子的，如润湿剂，乳化剂或分散剂。
ERS诱导化合物可单独地或联合地与其它剂型物质一起应用，例如，与佐剂，除草剂，杀真菌剂，杀虫剂，生长调节剂或肥料一起使用。
作为一种液体剂型，ERS诱导化合物可以喷雾到植物的叶片，茎或枝条或播种前喷雾至种子上或土壤中或其它生长或栽培介质中。
ERS诱导化合物以一定的量来使用，一段时间之后足以诱导ERS效应。作为一种规则，如果施用到整个植物上，化合物在土壤的浸透过程中以每升土壤体积0.1至1000mg活性成分的浓度施用，或者以每升喷雾溶液中0.1-100mg的浓度喷雾。如果在细胞或组织培养系统中使用，现在根据培养基的体积，也可使用较低的浓度。作为一种指标，2至72小时，尤其是12至48小时足够检测到反应。
原则上，可以用分析基因表达的每个传统方法来监测植物对化合物作用的反应，如Western印迹或Northern印迹分析，例如，对其表达可由一种SAR诱导化合物诱导的基因，可通过对其酶活性的测定来检测或监测其基因包含在上述基因片段的指示蛋白或多肽的表达。如果必须进行检测的该表达是组织特异性的，该分析将在上述特定的组织中进行。
如果上述基因片段或上述基因片段的一部分存在一种组成型的低水平表达，将在化合物不存在的情况下在该植物或植物部分检测其表达，与上述组成型的低水平表达相比，化合物诱导的表达将被测定为表达的增加。这一检测方法的变化形式也被包括在本发明的方法的(b)步骤中。
上述基因片段(A)至(H)的表达分析优选地用Northern印迹类型的分析进行，尤其是用地高辛标记的基因片段的cDNA，例如，具有(A)至(H)中给定的核苷酸序列的DNA，或其片段，最优选地是使用市售的Northern印迹试剂盒，例如德国Boehinger Mannheim公司的DIG High Prime标记试剂盒。
在本发明的另一个优选实施方案中，基因片段的表达可用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行。
在本发明的另一个优选实施方案中，例如，通过Western印迹类型的分析，用抗体来分析上述基因片段的表达、以检测上述基因片段的基因产物，或一种特定的指示多肽或蛋白，该蛋白的基因序列代表上述基因片段的一部分。
如果上述基因片段的表达检测是基于一种被包含于上述基因片段(A)至(H)内的和编码指示蛋白或多肽的“附加的”核酸序列的表达检测，该检测也可通过其它方式，而不是通过使用核酸探针(例如，对Northern印迹分析)或抗体(例如，对Western印迹分析)，取决于产生的指示蛋白或多肽的类型而定。指示蛋白或多肽可以是一种荧光蛋白或化学发光蛋白或多肽，如绿色荧光蛋白(GFP)，从而通过检测上述该植物细胞的荧光或化学发光能够检测上述基因片段的表达。或者，所述指示蛋白或多肽还可以表现出一种酶活性，该酶活性不是天然存在于本发明所用的植物或植物部分中的。因此，可以分析该酶的活性检测指示蛋白或多肽的表达和上述基因片段的表达。该分析可以是基于测定分析培养基中该酶的一种底物的消失或通过酶的转化测定一种产物的形成。在一个特定的实施方案中，该酶转化的上述产物可以是一种化合物，由于酶促转化的原因，该化合物可以改变颜色。具有酶活性的指示蛋白的一个例子为葡萄糖醛酸酶，该指示蛋白常常在植物中不被发现。此外，指示蛋白能够表现酶的活性，可提供例如对另外一种化学因子如除草剂或植物毒性化合物的耐性。在这种情形下，在除草剂或植物毒性化合物存在时进行表达分析，根据对化学因子的耐性对表达进行评价。
分析上述基因片段(A)至(H)的表达的分析步骤(b)可以以下列方式进行—产生一种结果，该结果仅仅能测定表达是否发生；—与其它相比，能够测定2个或更多的样品表现出上述基因片段高程度的表达(“半定量测定”)。—提供关于表达水平的定量结果(“定量测定”)。
如果小心地用相等的或实质上相等量的从步骤(a)处理的植物或植物部分中准备的核酸或蛋白材料实施分析步骤(b)，从而能够半定量测定或者甚至是定量测定上述基因片段的表达水平，本发明的方法也可被用于—测定样品中能够诱导植物的ERS的化合物的浓度；—测定化合物或组合物是否比ERS诱导参照化合物表现出更强的ERS诱导效果；和—测定化合物或组合物是否、或者在何种程度上能够改变化合物的ERS诱导效果。
测定样品中能够诱导植物的ERS化合物浓度的方法之特征在于它包括下列步骤(i)按照本发明实施该方法，包括如上面所概述的步骤(a)和(b)，其中在步骤(a)中，植物或植物部分与等份的样品相接触；(ii)通过与用已知浓度的上述化合物测定的相应的试验结果比较步骤(i)的结果，测定样品中ERS诱导化合物的浓度。
测定化合物是否比ERS诱导参照化合物例如水杨酸，二氯异烟酸，或茉莉酸表现出更强的ERS诱导效果的该方法之特征在于它包括下列步骤(i)按照本发明实施该方法，包括如上面所概述的步骤(a)和(b)，其中在步骤(a)中，植物或植物部分与特定浓度的化合物相接触；(ii)按照本发明实施该方法，包括如上面所概述的步骤(a)和(b)，其中在步骤(a)中，植物或植物部分与一定量的ERS诱导参照化合物相接触，与步骤(i)中的化合物浓度相比导致等摩尔浓度；(iii)通过比较步骤(i)和(ii)的结果，测定化合物的ERS诱导的相对水平。
因为用实质上等量的从步骤(a)处理的供分析的植物或植物部分材料制备的核酸或蛋白材料将完成任何步骤(b)，步骤(iii)将产生半定量的结果，以便实现测定化合物和ERS诱导参照化合物中的哪一个能诱导更高程度的上述基因片段的表达，因此在植物中产生更强的ERS诱导作用。或者，也可评估这些结果，与ERS诱导参照化合物相比，以实现定量评估化合物诱导的相对程度的表达。通过光密度计的方式或在液体闪烁计数器中，通过分析切下的相关部分分析凝胶，该凝胶用于分离含有放射性标记检测化合物(例如核苷酸探针或抗体)的分析混合物，例如，通过扫描分析凝胶或薄膜，图片或其打印出的结果，来实施该评估。
测定化合物或组合物是否、或者在何种程度上能够改变农用化学品的ERS诱导效果的方法之特征在于它包括下列步骤(i)按照本发明实施该方法，包括如上面所概述的步骤(a)和(b)，其中在步骤(a)中，植物或植物部分与特定浓度的化合物或组合物相接触；(ii)如同步骤(i)中在化合物或组合物存在的情况下一样，按照本发明实施该方法，包括如上面所概述的步骤(a)和(b)，其中在步骤(a)中，植物或植物部分与同样特定浓度的农化物相接触。
(iii)通过比较步骤(i)和(ii)的结果，测定化合物或组合物改变化合物或组合物的ERS诱导效果的能力。
因为在本方法中，用实质上等量的从步骤(a)处理的供分析的植物或植物部分材料制备的核酸或蛋白材料也将完成任何步骤(b)，步骤(iii)将产生半定量的结果，以便实现测定，是化合物还是组合物导致上述基因片段表达的增强，降低或者甚至是被抑制，因此将产生更强的或者是减弱的植物中的ERS诱导作用，或者甚至将取消ERS的诱导作用。或者，也可评估这些结果，与农用化学品单独相比，以实现定量评估农用化学品与化合物或者与组合物诱导的相对程度的表达。通过光密度计的方式或在液体闪烁计数器中，通过分析切下的相关部分分析凝胶，该凝胶用于分离含有放射性标记检测化合物(例如核苷酸探针或抗体)的分析混合物，例如，通过扫描分析凝胶或薄膜，图片或其打印出的结果，来实施该评估。
测定化合物或组合物是否、或者在何种程度上能够改变农用化学品的ERS诱导效果的方法可被进一步用在一种方法中，该方法用于筛选能够改变农用化学品的ERS诱导效果的化合物或组合物。
本发明还涉及本发明方法中使用的试剂盒的使用。上述试剂盒之特征在于它包括下列组成(a)一种或多种植物或植物部分，包含着基因片段(A)至(H)，其表达可由SAR诱导化合物诱导、优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导；和(b)检测上述基因片段表达的方法。
在一个特定的实施方案中，该试剂盒可以包括一种或多种植物或植物部分，包含在其中的上述基因片段(A)至(H)的表达是不能由植物病原菌诱导的。在另一个特定的实施方案中，该试剂盒可以包括一种或多种植物或植物部分，其中的上述基因片段另外还包括编码指示蛋白或多肽的核苷酸序列。
如果该试剂盒包括一种或多种植物部分，如植物细胞，可提供的所说植物部分固定在一固相支持物上。合适的支持物可以由玻璃、特定的多糖，象琼脂糖，或特定的塑料物质聚丙烯酰胺，聚苯乙烯聚乙烯醇，硅。在这些类型的支持物上固定细胞和组织的方法和技术是技术人员所掌握的。在一特定的技术方案中，尤其是本发明的筛选方法，该试剂盒可以包括平板，如微量滴定板，包括大量的反应孔，这些反应孔含有所说的植物部分、尤其是植物细胞，其优选地被固定在这些孔的底部或壁上。
检测上述基因片段(A)至(H)表达的工具包括一种或多种核苷酸探针，例如检测标记的cDNA或上述基因片段的cDNA片段。可检测的标记可以是，例如荧光，化学发光或放射性标记，尤其是地高辛分子。或者，为了在酶联免疫吸附测定或Western印迹类型的分析中使用，检测上述基因片段表达的工具将包括一种抗体，该抗体特异性地识别和结合所说的基因片段的基因产物。该抗体将携带一可检测的标记，例如一种荧光或化学发光染料，一种放射性标记或一种酶的活性部分或结构，或通过使用对所说的一级抗体有特异性的二级抗体检测该抗体，该二级抗体在试剂盒中也可区分于所说的一级抗体被单独地提供。为(对)分析指示蛋白或多肽的酶活性，在此情形下，所说的基因片段还包括编码各自的指示蛋白或多肽的核苷酸序列，该基因片段的表达可由ERS诱导化合物诱导，检测上述基因片段表达的工具将包括一种或多种供分析指示蛋白或多肽的酶活性的试剂，例如包括一种指示蛋白的底物，可选择性地与一种或多种必需的辅助因子一起使用，和可能的供检测底物经酶转化为产物的试剂。
此外，上述工具可包括一种或多种用于分析反应的缓冲液和/或用于测定的试剂，尤其是供显示分析结果的试剂(例如，在检测附着在抗体上的酶活性的情形下)，它们可彼此单独提供，可独立于探针或抗体提供，或以结合的方式、或者以某些上述成分的组合方式提供。
或者，该试剂盒可包括更多的组成部分，尤其是作为单独的组分，如一种或多种对植物部分与试验化合物或组合物进行温育的缓冲液，破碎植物或植物部分细胞结构的因子、使之能够反应以检测上述基因片段的表达，或者是试剂盒的使用说明书。
此外，本发明是关于提供具有在植物中诱导ERS能力的化合物的方法，它包括步骤(a)产生化合物的合成组合文库，和(b)按照本发明，用包括以上概括的步骤(a)和(b)的检测在植物中能够诱导ERS的化合物的方法筛选上述文库的化合物。本发明也包括具有诱导ERS能力、通过本方法可获得的新的化合物，及其作为农用化学品的用途，尤其是用于诱导植物中的ERS。关于这些用作农用化学品的新的农用化合物的剂型和应用，参考该说明书中较早给定的相关解释。
另一方面，本发明涉及编码蛋白或多肽或其部分的分离的DNA分子，如果所说的DNA分子位于其自然遗传环境下，其表达由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导，或涉及与其互补的核苷酸序列。
在本发明的一个特定的实施方案中，分离的DNA分子包括核苷酸系列(A)至(H)或与其互补的核苷酸序列。
按照本发明的方法，可测定这些DNA分子的表达。
本发明还涉及分离的DNA分子，这些DNA分子的核苷酸序列与上面给定的核苷酸序列基本上同源，尤其是与后者杂交，或者是具有上面给定的核苷酸序列的DNA分子的变异体，或者与上述通过突变的DNA分子有关。关于术语“基本上同源”和“变异体”的含义，参考该说明书中较早给定的相关解释。在本上下文中，特定的技术方案是具有核苷酸序列(A)至(H)的DNA分子等位变异体和具有与(A)至(H)中给定的核苷酸序列杂交的核酸序列的DNA分子。正如上面已概述的，优选地，这种杂交在低严紧度的条件下进行，在另一和技术方案中，介于低严紧度和高严紧度条件之间进行，在非常特殊的技术方案中，甚至在高严紧度的条件下进行。作为一种规则，低严紧度条件可定义为3倍的SSC，温度为室温至65℃，高严紧度条件为0.1倍的SSC，温度为68℃。SSC是0.15M的氯化钠，0.015M柠檬酸三钠缓冲液的缩写。另一个特定的技术方案是其它的DNA分子，这些DNA分子具有的核苷酸序列不一定分别与核苷酸系列(A)至(H)中的一种序列杂交，但是，由于遗传密码的简并性，可编码与(A)至(H)序列中给定的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在一特定的技术方案中，编码蛋白/多肽或其部分的DNA分子，在细胞内的自然遗传环境下，其表达由SAR诱导化合物诱导，优选地是由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导，这些DNA分子源自植物的基因组，通过使用由具有核酸序列(A)至(H)的DNA分子片段的组成的、或者包含核酸序列(A)至(H)的DNA分子片段的核酸杂交探针，可以鉴定和分离出这些DNA分子。在筛选除大麦的其他植物，尤其是大麦属的其它植物中的基因时，还包括单子叶植物，也包括双子叶植物，所说的DNA分子的优选片段包含至少15个核苷酸，典型地介于15和30个核苷酸之间，更优选地是至少25个核苷酸，但如有必要，可包含甚至更高数量的核苷酸，如50个或更多的核苷酸。
因此，本发明包括本发明的DNA分子的片段，尤其是包括具有上述给定的核酸序列的分离的DNA分子片段，及其作为杂交探针的用途，尤其作为筛选探针或引物的用途，尤其是作为序列测定或PCR引物的用途。本发明也包括比上述提到的更短的片段，例如包含8至15个核苷酸，尤其是它们用作核苷酸探针或引物时。特别是用作核苷酸探针时，以标记的形式，例如放射性标记或以非放射性的报道或指示分子附着的标记，例如地高辛分子，使用包含一种或多种本发明的片段的或者由一种或多种本发明的片段组成的DNA分子。尤其是用作PCR引物，在本发明的片段序列内、以一种包含修饰的核苷酸序列的形式使用包括或基本上由一种或多种本发明的片段组成的DNA分子，该修饰的核苷酸序列在上述引物内提供合适的限制性位点和经PCR后任何扩增的产物，有利于上述扩增产物的克隆。尽管这些核苷酸序列进行了修饰，在PCR条件下，PCR引物还是将特异性地与本发明的目标DNA分子杂交。
本发明的DNA片段，例如，在核苷酸序列(A)至(H)的基础上，可能通过使用合适的限制性内切酶，或通过化学合成来准备。按照本发明，制备DNA片段和含有一种或多种这些片段的DNA分子的各种合适的技术是技术人员熟知的技术。
通过使用本发明的核苷酸片段或DNA分子作筛选探针，在一不同的植物种中已经鉴定出一相应的基因，确定其表达是否由ERS诱导化合物诱导的、尤其是否由SAR诱导化合物诱导的，优选地是否由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导的可能是很有趣的。这是可能付诸实施的，例如，如同实施例中所概述的，在一ERS诱导化合物存在时，通过培养植物或植物部分，和通过Northern-印迹或RNA点杂交分析的方式分析所说的植物或植物部分，例如，通过使用与核苷酸片段(A)至(H)特异的杂交探针、 用于鉴定上述基因，和在ERS诱导化合物不存在时与培养上述植物或植物部分的结果相比较。通过描述的方法鉴定的植物可被用于本发明的方法中，该植物将包含一种基因，该基因可由ERS诱导化合物诱导、尤其能由SAR诱导化合物诱导，优选地由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。
在另一特殊的技术方案中，本发明涉及一种分离的DNA分子，该DNA分子包括上面定义的与编码指示蛋白或多肽的核苷酸序列融合的DNA分子或片段。在一优选的技术方案中，如果在表达上连接到单个的表达序列上，上述DNA分子的完整的编码信息将被表达。该DNA分子的这另一核苷酸部分编码的指示蛋白或多肽是一种容易检测的蛋白或多肽，如通过使用特定的核苷酸杂交探针，通过使用特异的抗体或由于该蛋白或多肽自身特定的性质如荧光或酶活性。在一特定的实施方案中，该DNA分子所说的另一核苷酸序列部分可以编码葡萄糖醛酸酶或绿色荧光蛋白或一修饰形式的植物AHAS酶。指示多肽或蛋白的合适基因的分离和克隆以及上述定义的重组嵌合DNA分子的产生是技术人员所熟知的技术。
本发明也包括DNA构建体，它包括一种或多种以上定义的DNA分子和/或片段，尤其是用作核苷酸探针或PCR引物的构建体，以及在表达控制序列控制下、如在可操作性地连接到所说的DNA分子和/或片段的一表达控制序列控制下，包含DNA分子和/或片段的构建体。
特别是作为核苷酸探针的使用，将以一种标记的形式使用包含或由一种或多种本发明的DNA分子和片段组成的DNA分子，其中所说的标记可通过附加非放射性的报道或指示分子，如荧光或磷光分子，地高辛分子，生物素分子或它们的衍生物来完成。
特别是作为PCR引物的使用，按照本发明，在本发明片段的序列内、以包含附加的核苷酸序列或修饰的核苷酸序列的形式使用包含或基本上由一种或多种本发明的DNA分子和片段组成的DNA构建体，该附加的核苷酸序列或修饰的核苷酸序列在上述引物内提供合适的限制性位点和经PCR后任何扩增的产物，有利于上述扩增产物的克隆。尽管这些核苷酸系列进行了修饰，在PCR条件下，PCR引物还是将特异性地与本发明的目标DNA分子杂交。在另一特殊的技术方案中，DNA构建体还包括可操作性地连接到所说的DNA分子和/或片段的一段表达控制序列。
本发明还涉及包含本发明的一种或多种DNA分子和片段的载体，质粒，粘粒，病毒，噬菌体基因组。
本发明还涉及含有本发明的DNA分子，片段和构建体的互补序列的DNA分子以及这些DNA分子，片段和构建体的RNA转录产物。
对本发明的DNA分子、片段和构建体进行分离、构建、合成和修饰的各种方法和技术是技术人员熟知的，且都有描述，如Sambrook等(1989)，Ausebel等。
此外，本发明涉及由本发明的DNA分子、片段、和构建载体编码的多肽/蛋白或其部分，涉及一些蛋白质，该蛋白质具有或包括一种氨基酸序列，它与DNA序列(A)至(H)相对应的氨基酸序列表现出至少65％，典型地，至少75％，优选地至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，特别优选地至少95％的同源性，以及涉及所说的蛋白质的多肽片段，其条件是这些片段的氨基酸序列与对应于DNA序列(A)至(H)的多肽的相应的“参考”片段表现出至少65％，典型地，至少75％，优选地至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，特别优选地至少95％的同源性。
在本发明的上下文中，术语“多肽”包括典型地包含至少18个氨基酸，更特殊地至少25个氨基酸，特别优选地多于40个氨基酸的分子。
在本发明的一个特定的技术方案中，多肽和蛋白是由本发明的DNA分子编码的蛋白质或其部分的融合蛋白，该融合蛋白带有如上面已经概述的一种指示蛋白或多肽。在另一实施方案中，本发明提供多肽/蛋白或其部分，包括在前面两段中描述的多肽/蛋白或其部分。
通过培养用一种或多种所说的DNA分子转化的寄主生物和通过本领域所熟知的方法、选择性地纯化这些多肽和蛋白，可以获得这些多肽/蛋白或其部分。或者，通过利用已知的肽或蛋白合成技术也可合成制备这些多肽和蛋白。
本发明的多肽和蛋白可以被用来制备单克隆或多克隆抗体，或者，如果它们表现出酶的活性，为多种目的可以利用该酶的活性。
另一方面，本发明也包括单克隆或多克隆抗体或特异性地识别和结合本发明的一种多肽或蛋白的抗血清。通过使用本发明的多肽或蛋白可制备相应的抗体，按照技术人员所熟知的方法对寄主免疫接种。
此外，本发明包括转化的微生物，如细菌，细菌噬菌体，病毒，真核生物如真菌，酵母，原生动物，藻类，和人，动物和植物细胞，它们包含一种重组的DNA序列，该DNA序列包含至少一种本发明的DNA分子，片段或构建载体。这些转化的微生物可以被用作一种表达系统，产生本发明的DNA分子，片段或构建载体的基因产物。用于这一目的的典型微生物为细菌，如大肠杆菌，酵母，如酿酒酵母。本发明的其它类型的转化微生物，如农杆菌，象根癌农杆菌，其被本发明的DNA分子，片段或构建体所转化，可以被用来转化植物，从而提供转基因植物。
用本发明的DNA分子，片段或构建体转化微生物的方法都是技术人员熟知的技术，包括在组成型或诱导的启动子控制之下的、含有本发明的DNA序列的表达载体的构建。该启动子也可使编码的信息在生物体，如植物的特定分隔空间中进行组织特异性表达。
最后，本发明涉及包含重组DNA序列的转基因植物，植物部分或种子，该重组DNA序列包括一种或多种本发明的DNA分子。术语“植物”或“植物部分”包括所有的植物繁殖材料，如植物原生质体，植物细胞，植物组织，愈伤组织，发育的小植株，植物叶片，不成熟的整株植物，成熟的整株植物。转基因植物，植物部分或种子可包含整合到其基因组中的或位于染色体外的上述重组DNA序列。适当的基因或基因片段的克隆，合适的转化载体的构建和包含在载体中的遗传信息向植物细胞导入的各种技术和方法对技术人员都是熟知的，并且能够产生本发明的转基因植物，植物部分或种子。遗传信息向植物细胞导入的技术包括直接的DNA转移(例如，通过电穿孔法或通过使用高分子量的渗透剂以及基因枪法导入到原生质体中，其中被包裹的DNA颗粒被射击到植物组织中)，以及使用自然寄主/载体系统(例如农杆菌或植物病毒的)。对重组DNA序列的染色体外的维持，可以使用在其基因组中插入重组的DNA序列的各种特定的病毒如烟草花叶病毒(TMV)或马铃薯X病毒(PVX)。
用于整合本发明的重组DNA序列的示范植物包括双子叶植物以及单子叶植物，尤其是禾谷类和作物，如马铃薯、calona、油菜、大豆、糖甜菜和烟草。
为了说明本发明，下面阐明具体的实施例。这些实施例仅仅是说明性的，并非以任何方式理解为本发明的限制范围和基本原则。除了本文中说明和描述的那些以外，本领域的技术人员从下面的实施例和前面的描述将明了本发明的各种更改。这些更改也将落入所附的权利要求书的范围内。
实施例方法抑制差减杂交(SSH)被用来鉴定相关的一套差式表达基因(Diatchenko等，1996)。该技术是根据包含在对照物cDNA群体中的平均的目标cDNA的丰度，和通过杂交的方式有效地扣除对照物和驱动物的cDNA群体中的共同序列。在一特定形式的PCR中，差式表达的目标cDNA被选择性地扩增，而非目标cDNA的扩增被抑制。
从非诱导的植物(驱动物)中扣除cDNA，我们从化学诱导的大麦植物(对照物)中分离了差式表达的cDNA片段。植物，病原菌和接种植物，即大麦(Hordeum vulgare L.)栽培种Ingrid和Rorl-2突变体A89，于16℃，60％的相对湿度和16小时的光照(100μEs-1m-2)在生长箱中生长。对化学诱导的对照接种在化学处理后的第3天用白粉菌的大麦生理小种(Erysiphe graminis DCFr.f.sp.hordei)的K1分离株(Hinze等，1991)的10mm-2分生孢子接种。植物激活2，6-二氯异烟酸(DCINA，CGA 41396，气巴嘉基(Coba GeigyAG)，Basel，瑞士)，以25％活性成分与可湿性粉剂(WP)载体(Metrauxet al.1991)的剂型以浸透土壤的方式施用于5天苗龄的大麦苗。化合物的终浓度为5毫克/升土壤体积。悬浮液用无菌的自来水配制。总RNA的分离为了分离用于抑制差减杂交和cDNA末段快速扩增实验(raceexperiment)的poly(A)+RNA，从5克叶子中分离总RNA按照DUDLER等的方法(1991)进行。
为了Northern分析，对提供的手册稍加修改并通过使用RNA去垢剂(clean)(AGS)分离总RNA。叶片材料在液氮中研磨，向200毫克的叶片粉末的等份试样中加入1.7毫升的RNA去垢(clean)提取缓冲液和200微升的氯仿之后，内含物经充分混合和摇动30分钟。样品再于20800xg(4℃，30分钟)离心，水相再用等体积的氯仿抽提。经离心之后(20800xg，4℃，30分钟)，RNA从上面的水相中用等体积的异丙醇沉淀下来，样品于冰上保存1小时，然后再于20800xg(4℃，30分钟)离心。弃掉上清液，沉淀用70％的乙醇(-20℃)洗涤一次。简单离心后，彻底地弃掉上清液，沉淀于室温下干燥，RNA用适当体积的水溶解。聚腺苷酸化RNA(poly(A)+RNA)的分离把不同时间点(分别为化学诱导和对照处理后的12，24，48小时)的总RNA等量集中合并。合并的RNA用DNA酶消化如下每等份750微克的RNA通过加入12.5微升的1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.5)，50微升50mM的氯化镁，1微升的25mM的乙二胺四乙酸(pH7.5)，2.5微升的RNA酶抑制剂(40个单位/微升)，10微升的DNA酶I(10单位/微升)和适当体积的水至250微升。反应混合液于空气培养箱中在37℃下温育30分钟。为了提取RNA，加水使体积补偿到1250微升，加入等体积的苯酚(用三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.0)饱和)，氯仿(3∶1)，充分混合，于20800xg室温下离心5分钟。把水相转移到一新的试管中，然后加入0.1倍体积的3M的乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的冷的(-20℃)96％乙醇。把试样混合并于-20℃下保存24小时。于20800xg、4℃下离心1小时后，弃掉上清液，沉淀用冷的(-20℃)70％乙醇洗涤。混合液再于20800xg、4℃下离心15分钟，弃掉上清液。沉淀于室温下干燥，并用适当体积的水溶解。
按照生产商的推荐、用DYNABEADS mRNA纯化试剂盒(Dynal)分离多聚腺苷化的RNA。用6％的聚丙烯酰胺变性胶和银染色检查多聚腺苷化的RNA，方法如下用于灌胶或跑胶，使用Mini-PROTEAN II型的槽(BioRad)，向12毫升的胶溶液中，加入5。6微升的Temed(SERVA)和72微升10％的腺苷酰硫酸(BioRad)，然后立即到胶，并使其聚合2小时。经100伏预电泳45分钟之后，100毫微克的聚腺苷酸化的RNA和250毫微克的总RNA在5倍的膦酰乙酸缓(PAA)冲液中于98℃变性5分钟，然后迅速地在冰上冷却，并且上样至胶上。在1倍的TBE缓冲液中、于60伏下跑胶。电泳之后，胶在固定溶液中温育3次，15分钟，再用水冲洗4次，每次2分钟，再用1.5％(体积/体积)的甘油湿润1次，2分钟。用13毫升的染色液B与7毫升的染色液A混合。把胶浸泡在该混合液中，直到带显现出来。通过把胶转移到终止溶液中终止反应。通过抑制差减杂交(SSH)合成cDNA和产生差减文库使用PCR-SelectTMcDNA差减试剂盒(Clontech)，在A89非诱导的(“驱使物”)和A89化学诱导的(“对照物”)之间进行抑制差减杂交。除有关杂交步骤的修改外，所有的程序，如第一和第二条cDNA链的合成，RsaI消化和接头连接均按照厂商推荐的规则进行。对第一次杂交，把一种非连接的“驱使物”和连接了两个不同接头中的一个的“对照物” cDNA群体的混合物进行变性，并在68℃下保持整整8小时。对第二次杂交步骤，混合“驱使物-对照物”杂交试样，加入新变性的“驱使物”，于68℃下温育12小时。用AdantagecDNA聚合酶混合物(Clontech)进行的以下PCR反应，按照差减试剂盒提供的手册操作，所有的PCR和杂交步骤在Perkin-Elmer 2400热循环仪上进行。
现在，将PCR混合物富集起来大致相等的丰度差式表达的cDNA。差减cDNA向TA载体的克隆虽然AdantagecDNA聚合酶混合物只表现出少量的校对活性，在第二次PCR扩增之后可直接进行腺苷加尾，以保证大部分cDNA片段含有“腺苷-悬垂物”。10微升的反应混合物与dATP(0.4mM的终浓度)和1个单位的Taq聚合酶(Eurogentec)在70℃下温育15分钟。无须进一步的扩增，1微升和3微升的差减cDNA被连接到50毫微克Pt-Adv(AdantageTMPCR克隆试剂盒，Clontech)上。连接混合物导入到大肠杆菌TOP10 F′(Clontech)之后，文库涂板到含100微克/毫升的氨苄青霉素，50微克/毫升的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和280μM的异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)的琼脂平板上。细菌生长直到菌落可见，可清晰地辨别出蓝/白斑。所述平板于4℃下保存。菌落PCR，反向northern印迹和筛选为了评估扣除效果和筛选真正差异表达的cDNA，进行菌落PCR，PCR产物印迹到膜上并与地高辛标记的第一条链cDNA杂交，该cDNA来源于合并的从诱导的和非诱导的植物作为模板提取的聚腺苷酸化的RNA。
总共挑取了480个白色和淡蓝色的单个克隆，首先用来接种含100微克/毫升的氨苄青霉素的琼脂平板，再接种到96-孔的含40微升无菌水的微量滴定板中。微量滴定板中的细菌用Perkin-Elmer 9700热循环仪通过加热至98℃、5分钟裂解。PCR反应混合液以如下方式用微量移液管移到96孔的微量滴定板中用提供有酶，200μM浓度的dNTP，1.5mM的氯化镁，0.5个单位的Taq聚合酶(Eurogentec)和0.4μM的位于插入物两端的每种引物(嵌套引物1和嵌套引物2R)，用10微升的裂解液在30微升的反应液中用标准的10倍的PCR缓冲液(Eurogentec)扩增克隆的插入物。按以下列条件进行PGR94℃、30分钟一个循环；35个循环，每个循环94℃、15秒，68℃、30秒和72℃、60秒；紧接着72℃、5分钟一个循环。
扩增之后，进行预电泳，考虑到最小的插入物大小为0.1千碱基对，选择360个克隆中的一些作反向northern分析。两个10微升的等份上样到1.5％琼脂糖/溴化乙啶(EtBr)、1倍的TBE中进行平行电泳(胶A和胶B)。通过紫外灯下因核酸对溴化乙啶的积累而产生的荧光监测同样的上样量。胶于2倍的SSC中印迹到尼龙膜(Boehringer)上16小时。滤膜A和B然后在浸泡有0.5M的氢氧化钠，1.5M的氯化钠的whatman试纸上变性2次，每次5分钟，然后在浸泡有0.5M的Tris/HCL(pH 7.4)，1.5M的氯化钠的whatman试纸上中和2次，每次5分钟。最后用125mJ通过交联作用(GS GeneLinker，BioRad)固定DNA。
为了第一条cDNA链的合成，2微克的聚腺苷酸化RNA加2.22微克的寡聚(dT15)引物在13微升的体积中加热至65℃，10分钟，在冰上冷却5分钟。5倍的第一条链缓冲液(Boehringer)，7.5微升的dNTPs原液(2mM的dATP，dGTP，dCTP，0.52mM的dTTP，0.28mM的地高辛-dUTP(Boehringer))和37.5单位的RNA酶抑制剂(Boehringer)用水补充到15微升，加入到聚腺苷酸化RNA/引物的混合物中。在室温下温育2分钟后，通过加入40个单位的鼠白血病病毒(MMuLV)逆转录酶(Boehringer)开始逆转录。充分地混合该组分，于37℃下温育1小时。通过加热至95℃、5分钟终止反应，然后在冰上冷却5分钟。为了消化RNA，各加入1个单位的RNA酶A(RNaseA)和RNA酶H(RNaseH)到第一条链的合成液中，然后于37℃下温育1.5小时。地高辛标记的第一条cDNA链的控制为了用反向northern技术筛选差式表达的cDNA，对地高辛渗入到诱导的(“参照物”)和非诱导的(“驱使物”)单链cDNA群体中的强度的估计和使之均等是非常重要的。
第一条链合成的等份在适当体积的RNA上样缓冲液中于95℃变性5分钟，再于冰上冷却并上样至变性的1.5％琼脂糖胶，于1倍的3-(N-吗啉代)丙磺酸MOPS的缓冲液和5％(体积/体积)的甲醛(37％)中电泳。电泳之后，将探针印迹到25mM的磷酸钠缓冲液(pH6.5)的尼龙膜上持续16小时，然后用125mJ(GS基因交联机，BioRad)交联。按照“滤膜杂交的地高辛系统用户指南”(Boehringer)通过化学荧光检测地高辛标记的cDNA。通过比较信号强度估计地高锌标记的“参照物”和“驱使物”探针的浓度。
对差式表达的cDNA的筛选以下列方法进行。滤膜(A和B)在DiGEasy HyB(Boehringer)中与分别来源于非诱导的(“驱使物”)和化学诱导的(“参照物”)聚腺苷酸化RNA的、经地高辛标记的单链cDNA在50℃下杂交16小时。滤膜用2倍的SSC/0.1％SDS于室温下洗涤2次，再用0.1倍的SSC/0.1％SDS于50℃下洗涤2次。按照“滤膜杂交的地高辛系统用户指南”(Boehringer)通过化学荧光进行检测。质粒的分离按Sambrook等(1989)方法培养细菌，质粒用JETSTAR的质粒Miniprep试剂盒(Genomed)分离。序列测定用热测序酶标记的引物循环测序试剂盒(Amersham)和LongRanger胶溶液(FMC)于Licor 4200测序仪(MWG-RIOTECH)上进行序列测定。反应设置如下2pmol引物(用IRD-800进行5′标记)，1.0微克的模板DNA，10％(体积/体积)的二甲基亚砜(DMSO)，加水补充到21微升。向1.5微升的A，C，G或T试剂中加4.5微升的引物/模板混合物。在Perkin-Elmer 2400热循环仪上用下列参数进行循环95℃、5分钟一个循环；30个循环，每个循环95℃、15秒，61℃(M13反向-29)和64℃(M13正向-21)、15秒， 70℃、15秒。反应液通过加入试剂盒(Amersham)提供的4微升终止缓冲液终止反应。经30分钟的预电泳后，把1-2微升的等份上样至胶上，电泳跑胶按照对测序仪的MWG-规则推荐的方法进行。序列分析用BLAST规则系统(Altschul等，1990)在基因库和EMBL数据库中进行同源性检索。预测的氨基酸序列用CLUSTAL W程序(Thompson等，1994)进行排列。序列分析揭示出下列的相似性克隆A(346个碱基对)ACATGAAGAG CAGCGACGGC AAGGTCTACG ACTCCTTCAC CATCCACAGG 50GATTACCGCG ACGTGCTCAG CTGCGTGCAC GACAGCTGCT TCCCCACCAC100GCTCGCTAGC TAGCTCATAT CGTCCGGCCG TCATGTCAAT GTAATGGAGG150GTCATCCATC CAATAAAATT GTGGGCATGT GTTGAGTAAT AAAATTGGTC200AGCTGCACAA TTTATATGTG CTAGTAAAAA GATCATGCAA GAGGTGGGTG250TATGCTCGTT ATATATGCTT TGTAACTCCT TCATGTCATA TTWTTATGGG300TTAATAAAAA CATCCTTTAT CAAAAAAAAA AAAAAaAAAA GCTTGT350同源性blastn/其它est(ESTs未知功能)E值5e-42，与登记号AI622765(玉米(Zea mays)cDNA)的同源性98/102(96％)。
E值3e-20，与登记号AU033069(水稻(Oryza sativa)cDNA)的同源性53/54(98％)。blastn/nrE值2e-08，与登记号CAB36731(拟南芥(Arabidopsis thaliana)可能的蛋白，与酸性磷酸脂酶EC 3.1.3.2相似)的同源性26/34(76％)，阳性率28/34(81％)。克隆B(292个碱基对)ACAGTATTGG TTGATATGAT TGCTAATCCG GCCCTAGCTC GCGCAGTAAG 50GGCATCTCCA ATGATTGTAT GATCATCGTT GGTAATATTG CCACATAGAT100GATTTTGATG ACATGACGCC TAATAAAAGA AGAAAGAGAA TGAAATCGTA150TGAACTTGAA GCAACGGTTC ACGCACAAGC TCCGAGGCAA AGCATGGTTA200TTTCTTCCAT GTTTAGTGGA CCCGCAATGC ATGCATGGAG GTGTATCTTA250CGATTGATCG CAATTAATAA AGTGTTTCGG TACGATAGTA GC同源性无克隆C(387个碱基对)ACTTATCTTG AGCATGACAT TAGTCAGCAA ACATCCGGCG aTCATCAGAA 50GaTCTTACTA GCCTATGTGG GCATTCCACG CTACGAAGGT CCAGAGGTTG100ATCCCACTAT AGTGACACAT GATGCGAAGG ACCTCTACAA AGCTGGTGAG150AAGAAGCTGG GCACAGATGA GAAAACCTTC ATCCGCATCT TCACTGAACG200CAGCTGGGCA CACATGGCAG CTGTTGCTTC TGCTTACCAG CACATGTATG250MTCGGTCATT ACAGAAGGTT GTGAAGAGTG AAACATCTGG AAACTTTGAA300GTTGCTCTGA TaACTATCCT CAGATGTGCT GAGAATCCAG CTAAGTaTTT350TGCTAAGGTG TTAAGGAAGT CCATGAAAGG TCTAGGT同源性blastn/dbest(ESTs未知功能)E值1e-118，与登记号C27470(水稻cDNA)的同源性340/382(89％)。
E值1e-73，与登记号D39787(水稻cDNA)的同源性241/274(87％)。blastx/nrE值4e-44，与登记号Y11384(对渗透压力、脱落酸和水缺乏敏感的Medicago sativa膜联蛋白一类蛋白质)同源性88/128(68％)。克隆E(512个碱基对)ACAGAAGCTT GGACAGTTCC ACTCGGAAGC TTCGGTTCGC GCTACCGTTC 50CCGATGCTCG CCTACCCATT CTACTTGTGG TCAAGGAGTC CAGGGAAGTC100AGGCTCGCAT TTCCACCCGA GCAGCGATTT GTTCCAGCCG AACGAGAAGA150ACGACATACT GACGTCGACG ACATGCTGGC TTGCCATGGC TGGCCTGCTC200GCTGGGCTCA CTGCCGTGAT GGGCCCCCTT CAGATACTCA AGCTCTACGC250CGTCCCCTAC TGGATTTTTG TTATGTGGCT GGACTTTGTC ACCTACCTGC300ACCACCACGG CCACAACGAC AAGCTTCCCT GGTATCGCGG AAAGGCATGG350AGCTATCTGC GCGGGGGCCT GACAACGCTC GACAGGGACT ACGGGTGGCT400CAACAACATC CACCACGACA TCGGGACTCA CGTGATCCGC CATCTTTTCC450CGCAAATCCC GCATTACCAT CTAGTGGAGG CGACCGAGGC GGCGAACAGS500TGCTAGGGAA GT同源性blastn/nrE值0.0，与登记号D43688(小麦(Triticum aestivum)在光和暗处生长的叶子的质体ω-3-脂肪酸脱氢酶(温度敏感型的)的mRNA)的同源性467/496(94％)。克隆F(484碱基对)ACAAGCTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGTGG TAAACAACAA150CTGCTTCATA TGAACAACGG GCTTGACAAT CAAAATTCTT CCATATGTTG200TTATTATACA AAAAAttGCT TAGAGCCAGA GTGAAATTAC ATCAAAGGCC250TTTAAAACTT TGTTATAAAA TCTAGTCTCA AACTCCCCCT CGTCTACAGG300TGTTCTCCGA GATATTCTCC CCTTGCCTCC AGTGCGAAAT TTCTGCTATG350TCTATGCTCT ATTCACACGG ATGGTTTGTC CTTCCAATTC TGTGTTGTTG400AAAGTAGAAA CCACAGCTTC AACTTCCTCC TCTGAAGAAA ACGTGACAAA450ACCATATCCC TTGGACTTTG GGGTTCCCGG AATTCGGGAT ACCGTGGCAC500TGAGGACCTC CCCCTTTTCA GAGAAGAAGT TCTTGAGAAC TTCCGTCGTC550ACTTTCTTCG CAAGATTGCC AACATAAACC TTGT同源性blastn/dbest(ESTs未知功能)E值1e-37，与登记号AI600292(玉米cDNA)的同源性207/248(83％)。blastx/nrE值2e-14，与登记号CAB41335(拟南芥可能的蛋白，具有与Nicotiana plumbaginifolia RNA结合蛋白30相似性)的同源性40/73(54％)，阳性率48/73(64％)。克隆G(305个碱基对)GTCAAGTTCA CGCCTGCCGA ATCGAGGATG ASTGCGCCGC CCCAAAAGCC 50CCCGCCGGAG AGGAGAAGAA GACGTCATGG CCGGAGGTAG CGGGAAAGTC100CATCGAGGAG GCCAAGGAGA TCATCCTTAA GGACATGCCT GAAGCGGACA150TCGTCGTCCT CCCAGCCGGC TCGCCGGTGA CCCTCGACTT CAGGACCAAC200CGTGTCCGCA TCTTCGTCGA CACTGTCGCG TCCACTCCCC ACATTGGCTA250GCTAGCTTTG CAAGCAAAGG CAACATGGAT GCATTGTGGA TGCTGATGAA300TAAGT同源性blastn/dbest(ESTs未知功能)E值2e-13，与登记号C25074(水稻cDNA)的同源性103/125(82％)。blastx/nrE值1e-19，与登记号S61830(玉米对伤口和真菌侵染反应的枯草蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂[丝氨酸蛋白酶抑制剂])的同源性44/59(74％)，阳性率50/59(84％)。克隆H(1035个碱基对)caggATcATA GCTACAgGCg AcAATGCCCG GTCATCgACA ATCGcTgGCA 50GCgGCTTCTC TGAAGcTACC ATCTCTTcTG CTTCTGTGGA TCTTTAGCTG100GAACTGGGgG CATGCCGTGG CCAAGTTTGA TCCTGCAAAC ATgACGGAGC150TTCAGAAACA TgTCTCCTTT TTCGACCGGA ACAAGGATgG CTTCATcACT200CCTACAGAAA CCATCCAAGG GTtTGTtGCA ATCGGTTGCG AGTATgCATT250TGCTACTGcT GCCTCTGCCG CCATTCACGG TGCCcTTGCT CCTcAAAcaA300CCCCGGCTGG TaCaCCACTg CCTCACTtGA CAATATACGT AGAGAATAtC350CACAAaGCTA TGCATGGAAG tGaTtCaGGt gTATATGAtg CCAAaGGAaG400GTTTCTtCCC CAAAACTTTG AGGAATTATT CAAAACATAT GCAATACTCC450GaCCAGATGC GTTGACTCTT GCGGAGATGCATGTGATGQFGCHJQFGCHJ\VSDZXDXDZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZDDDDZZZZZZZCTCTTTGCAAAA 500CGGGATCTAG ACCCTATATC ATGGGCACCA CCACAGGTTG AGTGGGGCCT550ATTATTCACG CTTGCAAGCG ATTGGCTTGG GTTCCTTCAC AAAGACAGTG600TTAGAGGTAT ATATGATGGA AGCCTGTTTA TCAAGTTGGA AAAGAAATGG650CaCCCTTTTC AAAGTGCTAT GCGATGAACT TGGTGCTAGT TTAGAGTGAG700AGTTtGGAtA tGGAAAGGtT tGtCCCGAAG AAGGTTTtCC tGCTATCtCC750AAATTCAACT AGAGTTTATT tTCTTTtCCt CCAAGTtGTA ATtGGcTTTA800TAAgACCTtC ATAGCCGATC AataCAACGA aGCAAGTtGg ATATATTTCC850CGACCTTGTA TTCTCTCTCA TGKGCCCCTT ATTATGTTTG CGCCATGAGC900GCCTACCCAA GAKGAGCCAT AAGCATAAGG CTCATCCACC TATTGGCCAC950GACTACTGTT GGAAATATTC CCTACAKGCA ATATTGKGAK GAWAAWATTT 1000ATCTATAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA同源性blastx/nrE值7e-34，与登记号AC002332(拟南芥可能的钙结合EF手性蛋白)的同源性73/173(42％)，阳性率107/173(61％)cDNA末端的快速扩增(RACE)用马拉松(MARATHON)cDNA扩增试剂盒(Clontech)，通过cDNA末端的快速扩增获得cDNA的5′和3′端。为了产生双链的cDNA，合并分别从诱导的和非诱导的植物中(见上面)分离的聚腺苷酸化RNA作为模板。接头连接之后，用基因特异的引物与试剂盒提供的接头引物一起用文库作为模板扩增5′和3′端。cDNA末端的快速扩增产物被克隆到pT-AdV中，在大肠杆菌TOP10F′中繁殖，并与以上描述的一样作序列分析。Northern印迹分析为了证实差式表达，通过在1.5％甲醛琼脂糖胶上(见上面)分离5-10微克的总RNA和转移到尼龙膜上，进行northern印迹分析。膜在严紧的条件下、在Dig Easy Hyb(Boehringer)中与来源于抑制差减杂交或cDNA末端快速扩增的、地高辛-PCR-标记的cDNA-探针于60℃下杂交。膜用2倍的SSC/0.1％SDS于室温下洗涤2次，然后用0.1倍的SSC/0.1％SDS于60℃下洗涤3次。按照“滤膜杂交的地高辛系统用户指南”(Boehringer)进行检测。材料测序引物(在5′端用荧光染料IRD 800修饰过)
M13正向(-21)5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’Ta 57℃M13反向(-29)5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’Ta 57℃T7-启动子5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’Ta 56℃PCR引物嵌入式引物15’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’嵌入式引物2R5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’激活蛋白(AP)15’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’6％的测序胶的组成10xTBE 5毫升Long Ranger胶溶液(50％) 5毫升尿素21克水 加50毫升TEMED 25微升10％腺苷酰硫酸(APS) 250微升2xSSC氯化钠0.3M柠檬酸三钠 30mMpH7.0RNA上样缓冲液甲醛(37％)260微升甲酰胺720微升甘油 80微升溴酚蓝(水饱和溶液) 80微升10×MOPS 180微升溴化乙锭(10mg/ml) 100微升水100微升固定液甲醇 45％(体积/体积)乙酸 10％(体积/体积)于水中染色溶液A碳酸钠5％(重量/体积)于水中染色溶液B硝酸胺0.2％(重量/体积)硝酸银0.2％(重量/体积)钨硅酸1％(重量/体积)甲醛 1.4％(重量/体积)于水中终止液乙酸 10％(体积/体积)甘油 10％(体积/体积)5x膦酰乙酸(PAA)-缓冲液尿素 7M溴酚蓝0.25％(重量/体积)二甲苯腈蓝0.25％(重量/体积)EDTA 10mM甘油 30％(体积/体积)胶溶液尿素 7M丙烯酰胺溶液(37.5∶1丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺) 11.625毫升10xTBE 7.5毫升水 加75毫升10xTBETris碱 0.9M硼酸 0.9MEDTA 25mM参考文献Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，and David J.Lipman(1997)缺口的BLAST和PSI-BLAST新一代的蛋白质数据库搜索程序。核酸研究25，3389-3402。Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.F.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K。(编者)。现代分子生物学流程。John Wiley和Sons公司。2000。Diatchenko，L.，Lau；Y.-F.，Campbell，A.P.，Chenchik，A.，Moqadam，B.H.，Lukyanov，S.，Lukyanov，K.，Gurskaya，N.，Sverdlov，E.D.and Siebert，P.D.(1996)美国国家科学院院报93，6025-6030。Dudler，R.，Hertig，C.，Rebmann，G.，Bull，J.，and Mauch，F.(1991)一种病原菌诱导的小麦基因编码与谷胱苷肽-S-转移酶同源的蛋白质。MPMI 4，14-18。Faske，N.，Backhausen，J.E.，Sendker，M.，SingerBayrle，M.，Scheibe，R.，von Schaewen，A.(1997)表达豌豆叶绿体正义和反义Nmdh cDNA的转基因烟草。对NADP-MDH水平的作用，转化子稳定性，和植物的生长。植物生理学115，705-715。Gottlieb，M.and Chavko，N.(1987)琼脂糖胶上的自然和变性的真核DNA的银染色。
分析生物化学165，33-37。Hinze，K.，Thompson，R.D.，Ritrer，E.，Salamini，F.，andSchulze-Lefert，P。(1991)RFLP介导的大麦(Horcleum vulgare)分子抗性基因座的寻靶。美国国家科学院院报88，3691-3695。Mason，H.S，and Mullet，J.E。(1990)大豆的两个营养储藏蛋白基因在发育中和对水分缺乏，伤口和茉莉酸反应的表达。植物细胞2，569-579Mason，H.S.，DeWald，D.B.，and Mullet，J.E.(1993)大豆vspB启动子中甲基化茉莉酸反应结构域的鉴定。植物细胞5，241-251。Berger，S.，Bell，E.，Sadka，A.，and Mullet，J.E.(1995)拟南芥的Atvsp与大豆的编码营养储藏蛋白酸性磷酸脂酶的VspA和VspB基因同源，且受到甲基茉莉酸，伤口，蔗糖，光和磷酸相似地调节。植物分子生物学1995，2，933-942。Mètraux，J.P.，Ahl-Goy，P.，Staub，T.，Speich，T.，Steinemann，A.，Ryals，J.，and Ward，E.(1991)黄瓜对2，6-二氯异烟酸和病原反应的诱导抗性。Henneke，H.，und Verma，D.P.S.，等编辑，植物-微生物相互作用的分子遗传学进展，第一卷。Kluwer学术出版社，Dordrecht，荷兰，第432-439页。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。Taylor，C.B.(1997)了解共抑制。植物细胞9，1245-1249。Thompson J.D.，Higgins D.G.，Gibson T.J.(1994)CLUSTAL W通过序列权重，位置特异的缺口罚分和位置矩阵选择，提高累进的多序列排列的灵敏性。核酸研究22，4673-4680。
权利要求
1.一种选自序列(A)至(H)的DNA分子或其衍生物AACATGAAGAG CAGCGACGGC AAGGTCTACG ACTCCTTCAC CATCCACAGG 50GATTACCGCG ACGTGCTCAG CTGCGTGCAC GACAGCTGCT TCCCCACCAC100GCTCGCTAGC TAGCTCATAT CGTCCGGCCG TCATGTCAAT GTAATGGAGG150GTCATCCATC CAATAAAATT GTGGGCATGT GTTGAGTAAT AAAATTGGTC200AGCTGCACAA TTTATATGTG CTAGTAAAAA GATCATGCAA GAGGTGGGTG250TATGCTCGTT ATATATGCTT TGTAACTCCT TCATGTCATA TTWTTATGGG300TTAATAAAAA CATCCTTTAT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GCTTGT350BACAGTATTGG TTGATATGAT TGCTAATCCG GCCCTAGCTC GCGCAGTAAG 50GGCATCTCCA ATGATTGTAT GATCATCGTT GGTAATATTG CCACATAGAT100GATTTTGATG ACATGACGCC TAATAAAAGA AGAAAGAGAA TGAAATCGTA150TGAACTTGAA GCAACGGTTC ACGCACAAGC TCCGAGGCAA AGCATGGTTA200TTTCTTCCAT GTTTAGTGGA CCCGCAATGC ATGCATGGAG GTGTATCTTA250CGATTGATCG CAATTAATAA AGTGTTTCGG TACGATAGTA GCCACTTATCTTG AGCATGACAT TAGTCAGCAA ACATCCGGCG aTCATCAGAA 50GaTCTTACTA GCCTATGTGG GCATTCCACG CTACGAAGGT CCAGAGGTTG100ATCCCACTAT AGTGACACAT GATGCGAAGG ACCTCTACAA AGCTGGTGAG150AAGAAGCTGG GCACAGATGA GAAAACCTTC ATCCGCATCT TCACTGAACG200CAGCTGGGCA CACATGGCAG CTGTTGCTTC TGCTTACCAG CACATGTATG250MTCGGTCATT ACAGAAGGTT GTGAAGAGTG AAACATCTGG AAACTTTGAA300GTTGCTCTGA TaACTATCCT CAGATGTGCT GAGAATCCAG CTAAGTaTTT350TGCTAAGGTG TTAAGGAAGT CCATGAAAGG TCTAGGTEACAGAAGCTT GGACAGTTCC ACTCGGAAGC TTCGGTTCGC GCTACCGTTC 50CCGATGCTCG CCTACCCATT CTACTTGTGG TCAAGGAGTC CAGGGAAGTC100AGGCTCGCAT TTCCACCCGA GCAGCGATTT GTTCCAGCCG AACGAGAAGA150ACGACATACT GACGTCGACG ACATGCTGGC TTGCCATGGC TGGCCTGCTC200GCTGGGCTCA CTGCCGTGAT GGGCCCCCTT CAGATACTCA AGCTCTACGC250CGTCCCCTAC TGGATTTTTG TTATGTGGCT GGACTTTGTC ACCTACCTGC300ACCACCACGG CCACAACGAC AAGCTTCCCT GGTATCGCGG AAAGGCATGG350AGCTATCTGC GCGGGGGCCT GACAACGCTC GACAGGGACT ACGGGTGGCT400CAACAACATC CACCACGACA TCGGGACTCA CGTGATCCGC CATCTTTTCC450CGCAAATCCC GCATTACCAT CTAGTGGAGG CGACCGAGGC GGCGAACAGS500TGCTAGGGAA GTFACAAGCTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGTGG TAAACAACAA150CTGCTTCATA TGAACAACGG GCTTGACAAT CAAAATTCTT CCATATGTTG200TTATTATACA AAAAATTGCT TAGAGCCAGA GTGAAATTAC ATCAAAGGCC250TTTAAAACTT TGTTATAAAA TCTAGTCTCA AACTCCCCCT CGTCTACAGG300TGTTCTCCGA GATATTCTCC CCTTGCCTCC AGTGCGAAAT TTCTGCTATG350TCTATGCTCT ATTCACACGG ATGGTTTGTC CTTCCAATTC TGTGTTGTTG400AAAGTAGAAA CCACAGCTTC AACTTCCTCC TCTGAAGAAA ACGTGACAAA450ACCATATCCC TTGGACTTTG GGGTTCCCGG AATTCGGGAT ACCGTGGCAC500TGAGGACCTC CCCCTTTTCA GAGAAGAAGT TCTTGAGAAC TTCCGTCGTC550ACTTTCTTCG CAAGATTGCC AACATAAACC TTGTGGTCAAGTTCA CGCCTGCCGA ATCGAGGATG ASTGCGCCGC CCCAAAAGCC 50CCCGCCGGAG AGGAGAAGAA GACGTCATGG CCGGAGGTAG CGGGAAAGTC100CATCGAGGAG GCCAAGGAGA TCATCCTTAA GGACATGCCT GAAGCGGACA150TCGTCGTCCT CCCAGCCGGC TCGCCGGTGA CCCTCGACTT CAGGACCAAC200CGTGTCCGCA TCTTCGTCGA CACTGTCGCG TCCACTCCCC ACATTGGCTA250GCTAGCTTTG CAAGCAAAGG CAACATGGAT GCATTGTGGA TGCTGATGAA300TAAGTHCAGGATCATA GCTACAGGCG ACAATGCCCG GTCATCGACA ATCGCTGGCA 50GCGGCTTCTC TGAAGCTACC ATCTCTTCTG CTTCTGTGGA TCTTTAGCTG100GAACTGGGGG CATGCCGTGG CCAAGTTTGA TCCTGCAAAC ATGACGGAGC150TTCAGAAACA TGTCTCCTTT TTCGACCGGA ACAAGGATGG CTTCATCACT200CCTACAGAAA CCATCCAAGG GTTTGTTGCA ATCGGTTGCG AGTATGCATT250TGCTACTGCT GCCTCTGCCG CCATTCACGG TGCCCTTGCT CCTCAAACAA300CCCCGGCTGG TACACCACTG CCTCACTTGA CAATATACGT AGAGAATATC350CACAAAGCTA TGCATGGAAG TGATCCAGGT GTATATGATG CCAAAGGAAG400GTTTCTTCCC CAAAACTTTG AGGAATTATT CAAAACATAT GCAATACTCC450GACCAGATGC GTTGACTCTT GCGGAGATGC ATGTGATGCT CTTTGCAAAA500CGGGATCTAG ACCCTATATC ATGGGCACCA CCACAGGTTG AGTGGGGCCT550ATTATTCACG CTTGCAAGCG ATTGGCTTGG GTTCCTTCAC AAAGACAGTG600TTAGAGGTAT ATATGATGGA AGCCTGTTTA TCAAGTTGGA AAAGAAATGG650CACCCTTTTC AAAGTGCTAT GCGATGAACT TGGTGCTAGT TTAGAGTGAG700AGTTTGGATA TGGAAAGGTT TGTCCCGAAG AAGGTTTTCC TGCTATCTCC750AAATTCAACT AGAGTTTATT TTCTTTTCCT CCAAGTTGTA ATTGGTTTTA800TAAGACCTTC ATAGCCGATC AATACAACGA AGCAAGTTGG ATATATTTCC850CGACCTTGTA TTCTCTCTCA TGKGCCCCTT ATTATGTTTG CGCCATGAGC900GCCTACCCAA GAKGAGCCAT AAGCATAAGG CTCATCCACC TATTGGCCAC950GACTACTGTT GGAAATATTC CCTACAKGCA ATATTGKGAK GAWAAWATTT 1000ATCTATAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA
2.一种检测化合物，组合物或混合物在植物中诱导增强的抗性状态(ERS)之能力的方法，所说的方法包括(a)将植物或植物部分与化合物接触，该植物或植物部分包含表达可由SAR诱导化合物诱导的权利要求1中的序列(A)至(H)的基因片段，和(b)分析所述基因片段的表达，其中所述基因片段的表达表明所述化合物，组合物或混合物具有诱导ERS的能力。
3.按照权利要求2的方法，其中所述基因片段的表达是不能被植物病原菌诱导的。
4.按照权利要求2或3的方法，其中所说的基因片段的表达还能由ISR诱导化合物诱导。
5.按照权利要求2至4之任一权利要求的方法，其中所述基因片段是一种与权利要求1中给定的任何核苷酸序列，与权利要求1中限定的基因片段的突变体或与包含前面提到的基因片段和突变体的一个或多个部分的基因片段具有实质上的同源性的基因片段。
6.按照权利要求2至5之任一权利要求的方法，其中所述植物或植物部分选自下组植物原生质体，植物细胞，植物组织，愈伤组织，发育的小植株，不成熟的整株植物，成熟的整株植物和种子。
7.按照权利要求2至6之任一权利要求的方法，其中所述植物或植物部分是禾谷类，尤其是大麦属的植物或从其来源的植物部分。
8.按照权利要求2至7之任一权利要求的方法，其中权利要求1的(A)至(H)的基因片段包含一种编码指示蛋白或多肽的核苷酸序列，并且其中分析所述基因片段的表达通过监测编码指示蛋白或多肽的核苷酸序列的表达来进行。
9.一种筛选有能力在植物中诱导ERS的化合物，组合物或混合物的方法，其中使用权利要求2至8的任一方法，并且其中所述被筛选的化合物，组合物或混合物以化合物的合成组合文库形式和/或以天然产物的文库形式提供。
10.一种提供具有在植物中诱导ERS能力的化合物的方法，该方法包括以下步骤(a)产生化合物的一种合成组合文库，和(b)用权利要求9要求的方法筛选所述文库的化合物。
11.一种具有诱导ERS能力的新化合物，组合物或混合物，它们由权利要求10的方法获得。
12.权利要求11的化合物，组合物或混合物作为农用化学品，尤其是在植物中诱导ERS的农用化学品的用途。
13.一种如权利要求1所限定的任一DNA分子所编码的多肽或蛋白质。
14.一种特异性地识别和结合权利要求13所限定的多肽或蛋白的单克隆或多克隆抗体。
15.一种包含重组DNA序列的转基因植物，植物部分或种子，所述重组DNA序列含有权利要求1的DNA分子。
全文摘要
本专利申请公开了新的基因,其表达可由SAR诱导化合物诱导,并且在特定的实施方案中可由SAR诱导化合物和ISR诱导化合物两者诱导。这些基因使得能够建立一些有以下用途的新方法:检测化合物和天然产物在植物中诱导增强的抗性状态(ERS),尤其是SAR或ISR的能力;筛选多种化合物,以获得在植物中具有诱导ERS能力的化合物或组合物。本专利的公开使得能够在转基因植物中使用包含这些DNA分子的重组DNA分子赋予植物对病虫害生物体增强的耐性。
文档编号G01N33/50GK1370233SQ00809155
公开日2002年9月18日 申请日期2000年5月19日 优先权日1999年5月21日
发明者K－H·克格尔 申请人:巴斯福股份公司