专利名称：用于研究分子相互作用的检测系统及其制备和应用的制作方法
描述本发明涉及的检测系统(
图1)包含支持物(成分a)；结合于支持物的检测单元(成分b)，所述检测单元包含恒定区A和毗连的可变区B；和包含与A区与B区互补的区和结合于此的效应物单元(适当时经合适接头)的成分c。本发明还涉及用于制备这种检测系统的方法和使用检测系统研究分子相互作用的方法。
在人细胞中，通常多达大约30,000种基因是有活性的，它们表征了细胞的当前状态。例如，在癌细胞中，细胞状态可能展示细胞分裂加强，而在疾病状态中通常是代谢活性改变。可以通过转录产物mRNA或翻译产物蛋白质来测定基因的活性。因此，细胞的mRNA或蛋白质分布型反映细胞的当前状态。
最近，根据蛋白质分布型来表征健康细胞或患病细胞对于研究疾病和寻找药理学活性化合物变得非常重要。早已开发了多种方法使得我们能够表征细胞的蛋白质分布型。
为了直接表征细胞中的蛋白质分布型，必须分离细胞蛋白质。有效的方法是例如双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)。在这种方法中，在第一个方向上根据等电点(IP)分离蛋白质，并在第二个方向上根据分子量进行分离。然后通过染色使2D凝胶中的蛋白质显影，在典型的2D凝胶中有大约1000-2000种蛋白质的染色斑点。结果是每一种细胞的重要蛋白质模式或分布型，它在蛋白质水平上反映了细胞的特定状态。细胞的每一种蛋白质在2D凝胶上占有特定位置，因此有可能产生细胞的“蛋白质组图谱(proteome map)”，进而产生整个生物体的“蛋白质组图谱”。为了确定细胞修饰(例如在疾病过程中)的分子起因，需要比较健康细胞与患病细胞的蛋白质分布型，以检测可能的差异。例如，可以以自动化方式通过合适的电脑方法进行这种比较(参阅例如M.R.Wilkins等人(编)，《蛋白质组研究功能基因组学的新领域》(Proteome ResearchNew Frontiers in Functional Genomics)，Springer Verlag，海德尔堡，1997；或I.Humphrey-Smith等人，电泳(Electrophoresis)181216-1242，1997)。然而，这种方法具有明显缺点，即为了进一步分析检测到的蛋白质，需要在蛋白质水平上对所述蛋白质进行测序，而且这种方法此刻仍然费时费钱。
用于测定细胞蛋白质分布型中可能差异的另一种方法是使用“阵列”，即矩阵系统。阵列是固定化检测物质的排列，它们在同时测定分析物的分析学和诊断学中具有重要作用。范例是核酸阵列(参阅例如Southern等人，基因组学(Genomics)131008，1992；美国专利5,632,957、WO 97/27317、或EP-A1-0 543,550)或肽阵列(Fodor等人，自然(Nature)364555，1993)。例如，WO 96/01836描述了具有不同序列的DNA分子阵列，可用于检测基因片段，并由此导致致病细菌的诊断学。专利公开US5,605,662、WO 96/01836、US 5,632,957、和WO 97/12030描述了可用于以电子可控方式进行生物学化合物(诸如核酸或蛋白质)与阵列形式特定可编址位点的特异性结合反应的半导体芯片和方法。例如，借助电场将样品中的核酸与半导体芯片上的核酸阵列进行杂交，然后通过简单倒转电场极性除去未结合的或非特异性结合的核酸。此时通过精确调整电场强度有可能检测到一个碱基对的错配。
本发明的一个目的是提供由配对系统-效应物融合分子群装配而成的检测系统，它有助于鉴定和表征所述分子群。本发明的另一个目的是用于研究效应物-结合配偶体相互作用的方法。
令人惊讶的是，现在已经发现，在所有情况下，包含具有恒定序列的A区和毗连A区且具有可变序列的B区的检测单元的适当集合，适用于通过与配对系统-效应物融合分子的特异性杂交来表征效应物分布型，然后鉴定效应物-结合配偶体相互作用。
本发明涉及的检测系统(图1)包含i)支持物(成分a)，和ii)至少一种检测单元(成分b)，优选结合于支持物的配对系统，其中所述检测单元包含具有恒定序列的A区和毗连A区且具有可变序列的B区，和iii)连接于此的配对系统-效应物融合分子(成分c)，其中所述配对系统-效应物融合分子包含与检测单元(成分b)互补的序列。
优选的是，检测单元(成分b)群在支持物(成分a)上形成阵列，其中每一个阵列位置可指定成分b的确定可变区B。由阵列表面的不同检测单元开始，可装配特定位置特定性检测系统(成分a-c)。
根据本发明，术语“检测单元(成分b)”指核酸或其类似物，特别是包含戊糖的类似物，优选吡喃戊糖或呋喃戊糖。戊糖通常选自核糖、阿拉伯糖、来苏糖、或木糖。合适核酸或其类似物的范例是DNA、RNA、特别是mRNA或pRNA(吡喃糖基RNA，参阅例如WO 99/15539)、氨基环己基核酸(CNA，参阅例如WO 99/15509)、肽核酸(PNA，参阅例如WO 92/20702；或科学(Science)2541497-1500，1999)、或非螺旋超分子纳米系统(参阅例如WO 98/25943)。
在这一点上，检测单元(成分b)与成分c中与A区与B区互补的区发生特异性杂交。成分c的范例是核酸-蛋白质受者(protein acceptor)衍生物，优选核酸-嘌呤霉素衍生物，或基因融合体(fusagene)，诸如核酸-蛋白质融合分子，特别是核酸-嘌呤霉素-蛋白质融合分子。特别优选由核酸RNA和DNA制成的融合分子，优选融合嘌呤霉素和蛋白质。根据本发明，术语“蛋白质”包括蛋白质和由翻译后修饰或化学修饰氨基酸合成的蛋白质结构，诸如糖基化、磷酸化、卤化、磷酯化氨基酸等，还有较短的肽氨基酸序列。
根据本发明，术语“恒定序列”(A区)指在所有检测单元(成分b)中相同的序列，优选RNA、DNA、或cDNA基础上的核酸序列，或者核酸类似物的序列，诸如pRNA、CNA、或PNA序列。
根据本发明，术语“可变序列”(B区)指在特定B区中不同但已知的序列，优选核酸序列。核酸可变序列是例如由随机事件或个别核苷酸排列形成的核酸序列。
A区和/或B区的长度优选相互独立地为大约5个-大约80个核苷酸，优选大约5个-大约30个核苷酸；特别是A区有大约10个-大约30个核苷酸，而B区有大约7-8个核苷酸；在特别优选的实施方案中，核苷酸是脱氧核糖核苷酸(d)、核糖核苷酸(r)、或2-羟甲基核糖核苷酸(hmr)。在下文的实施方案中，核酸序列的表述中不出现特定主链。因此，在任何情况中，所述核酸序列包含(d)、(r)、和(hmr)的实施方案。另外，不仅可以由核糖核苷酸还可以由2-羟甲基核糖核苷酸合成本发明的RNA。
例如，通过合适的核酸-蛋白质融合体来选择蛋白质，可成功表征蛋白质群体(例如细胞的蛋白质群体)的蛋白质分布型。例如，WO 98/31700描述了蛋白质受者(例如嘌呤霉素)经合适接头结合于核酸(优选mRNA)的系统。这能够在mRNA翻译成相应蛋白质结束前不久使合成的蛋白质共价结合其编码mRNA，由此更详细的表征之。序列已知的接头作为本发明核酸A区的结合区特别合适。有可能使用例如polyT15链作为A区来结合例如具有序列A27CC的核酸-蛋白质融合体的接头。为了产生核酸-蛋白质融合体，接头可以包含蛋白质受者，例如tRNA氨基酸类似物，诸如嘌呤霉素是特别合适的。DE 19646372C1、WO 98/16636、WO 91/05058、US5,843,701、WO 93/03172、或WO 94/13623描述了可用于本发明的例示性可比较系统。
为了能够覆盖配对系统-效应物融合分子(诸如核酸融合体，特别是核酸-嘌呤霉素-蛋白质融合体(基因融合体))群体的所有不同成分，检测单元(成分b)的B区可变序列必须包括所有可能排列。在这种情况中，可变序列(B区)的优选长度取决于群体的复杂性；根据经验，在原核细胞中较低，而在真核细胞中较高。例如在人细胞中，大约30 000种基因是有活性的，因此在阵列包括所有配对系统-效应物融合分子的情况中，包含长度为7-8个核苷酸的排列序列的B区核酸序列足以覆盖人细胞的所有有活性基因。n聚体寡核苷酸可能排列的数目是知道的，为4n，其中n是寡核苷酸中的核苷酸数目。因此，为了鉴定人细胞的所有有活性基因，优选结合于支持物且具有下列通式的核酸3’-(X)7-8-A区-5’，其中X是选自腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、或尿苷的任何核苷酸。
根据本发明，术语“支持物”指以固体或凝胶样形式存在的材料，特别是由半导体制成的芯片材料。合适支持物材料的范例是陶瓷、金属、特别是半导体、贵金属、玻璃、塑料、晶态材料或支持物(特别是所述材料)的薄层、或(生物)分子丝(诸如纤维素和结构蛋白质)。优选EP-A1-0543550或WO 99/15893，特别是US 5,605,662、WO 96/01836、US5,632,957、或WO 97/12030中所述支持物系统，它们可用于生产半导体芯片，这些芯片可用于以电子可控方式进行核酸与阵列形式特定可编址位点的特异性结合反应。这有可能借助电场以特别有利的方式使样品中需要特异性分离的核酸群体与核酸阵列(即本发明核酸在半导体芯片上的阵列)发生杂交，然后通过简单倒转电场极性除去未结合的或非特异性结合的核酸。因此，本发明检测系统特别优选的实施方案是电子芯片(electronic chip)。
支持物的装载方式通常是共价、或多或少的共价、超分子或物理、以及磁力(A.R.Shepard等人，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)25(15)3183-3185，1997)、在电场中或经分子筛、优选参照US5,605,662、WO96/01836、US 5,632,957、WO 97/12030、或WO 99/15893中所述方法。
本发明还涉及用于制备配对系统-效应物融合分子阵列(例如基因融合体阵列)的方法，包括下列步骤i)通过将包含具有恒定序列的A区和毗连A区且具有可变序列的B区的检测单元(成分b)附着于支持物(成分a)来制备阵列，其中每一个阵列位置可以指定具有特定B区的检测单元，并ii)将检测单元(成分b)与包含与检测单元(成分b)互补的序列的配对系统-效应物融合分子(成分c)进行杂交。
可以遵循WO 98/31700或Roberts-Szostak法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997)来制备成分c，诸如基因融合体文库(成分c)。
在本发明的方法中，通过使超过一种包含成分b和成分c的检测系统在空间上分开(例如在分开的室中)地结合于支持物(成分a)来制备阵列。在这一点上，检测单元(成分b)可以直接应用于支持物表面，例如经吸收或经熟练工作人员知道的间隔物。例如EP-A1-0543550或WO99/15893，特别是US 5,605,662、WO 96/01836、US 5,632,957、EP-B1-0373203、WO 97/12030、或WO 98/31700更详细的描述了具体的制备方法。
优选包括检测单元(成分b)B区所有可能排列的阵列。
本发明方法的优选实施方案包括此前早已更详细描述的检测系统。在本发明特别优选的方法中，检测系统装配在电子芯片上，而结合于支持物的检测单元(成分b)借助电场有利的结合样品成分(例如核酸融合体)，例如具有互补序列的成分c核酸区。例如EP-A1-0543550或WO99/15893，特别是US 5,605,662、WO 96/01836、US 5,632,957、或WO97/12030描述了这类电子芯片的详细描述及应用。
在优选的实施方案中，在第一步中，优选通过化学方法或借助合适的连接酶(例如T4DNA连接酶)，使合适的核酸接头(例如A27CC)与样品的mRNA群体融合；在第二步中，优选借助电场，使mRNA-接头融合体结合具有例示性通式3’-(X)7-8-(T15)-5’(其中X是选自腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、或尿苷的任何核苷酸)的检测单元(成分b)核酸；在下一步中，根据需要，优选借助极性倒转、场强低于第一步的电场，除去未结合的或非特异性结合的核酸。
本发明还涉及用于分离和鉴定优选来自复杂混和物的配对系统-效应物融合分子的方法(图2)，包括下列步骤i)制备配对系统-效应物融合分子文库(成分c文库)，优选基因融合体文库，ii)将配对系统-效应物融合分子(成分c)在包含成分a和成分b的阵列上进行杂交，其中成分b的B区包括所有可能排列，每一种排列特定指定一个阵列位置，iii)鉴定已形成成分b-成分c复合物的阵列位置，并iv)表征在iii)中鉴定的成分b-成分c复合物。
可以遵循WO 98/31700或Roberts-Szostak法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997)来制备成分c，诸如基因融合体文库(成分c)。
这种方法的特殊优势在于检测单元(成分c)的特异性构建同样有可能鉴定其中与成分b互补区的未知的配对系统-效应物融合分子，特别是基因融合体。实现这一目的的手段，一方面是配对系统的长度(使得能够进行严谨杂交)，另一方面是B区的长度，其可以调整杂交特异性(等同于成分c的分离)。
可以经成分c的标记来检测检测单元(成分b)与特定成分c杂交形成的复合物。此外，当使用电子芯片(成分a)时可以经电极处或附近的氧化还原过程或者经物理参数(诸如阻抗和直流电的测量，或者在金芯片的情况中经例如表面激元共振测量)来鉴定复合物。
通常，通过例如升高温度、改变局部盐浓度、或优选通过调整电子结合参数来打断与成分b的杂交，由各个鉴定的复合物顺序洗脱配对系统-效应物融合分子(成分c)。然后通过熟练工作人员知道的分子生物学方法表征这些基因融合体，诸如RT-PCR及随后的DNA测序。
该方法优选用于分析基因融合体文库。例如，有可能经以这种方式测定的核酸和/或蛋白质分布型来分析和/或比较多种细胞或组织样品的状态。另外，有可能检测群体中是否存在特定核酸或特定蛋白质。还可以鉴定多种细胞的可能表达状态。
本发明还涉及用于鉴定一种或多种对成分c特定效应物单元具有亲和力的结合配偶体(成分d)相互作用的方法(图3)。
根据本发明，“亲和力”指样品成分与成分c的效应物单元发生特异性相互作用。这种相互作用可以是特异性蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-核酸键，也可以是化学活性物质与蛋白质效应物之间的特异性结合。
该方法包括下列步骤i)将配对系统-效应物融合分子阵列与包含至少一种成分d的待分析物质混和物一起温育，ii)鉴定形成成分b-成分c-成分d复合物的阵列位置，并iii)表征在ii)中鉴定的成分b-成分c-成分d复合物。
通常经标记成分d来检测形成的复合物。此外，当使用电子芯片(成分a)时可以经电极处或附近的氧化还原过程或者经物理参数(诸如阻抗和直流电的测量，或者在金芯片的情况中经例如表面激元共振测量)来鉴定复合物。
通常，通过例如升高温度、改变局部盐浓度、或优选通过调整电子结合参数来打断与成分b的杂交，由各个鉴定的复合物顺序洗脱成分c-成分d亚复合物。然后通过熟练工作人员知道的分析方法表征成分d。
标记核酸、蛋白质、和/或化学活性物质的例示性方法是化学和/或物理化学、酶、蛋白质、放射性同位素、非放射性同位素、毒素、化学发光、和/或荧光标记。
熟练工作人员知道的适用于本发明进行化学标记的例示性化学物质是生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、或链霉亲和素。
熟练工作人员知道的例示性化学修饰是甲基、乙酰基、磷酸酯(phosphate)、和/或单糖基团的转移。
熟练工作人员知道的适用于参照本发明进行酶标记(例如以ELISA的形式)的例示性酶是苹果酸氢化酶、葡萄球菌核酸酶、△-5-类固醇异构酶、醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶、萤光素酶、或乙酰胆碱酯酶。
熟练工作人员知道的适用于进行本发明的蛋白质标记的例示性蛋白质或蛋白质片段是N端或C端(His)6、myc、FLAG、E标签、Strep标签、血凝素、谷胱甘肽转移酶(GST)、intein with a chitin、麦芽糖结合蛋白(MBP)、或者抗体或其抗原结合部分(例如Fv片段)。
熟练工作人员知道的适用于本发明的放射性同位素标记的例示性同位素是3H、125I、131I、32P、33P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、或109Pb。
熟练工作人员知道的适用于本发明的非放射性同位素标记的例示性同位素是2H或13C。
熟练工作人员知道的适用于本发明的毒素标记的例示性毒素是白喉毒素、蓖麻毒蛋白、或霍乱毒素。
熟练工作人员知道的适用于本发明的化学发光标记的例示性化学发光物质是鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香吖啶鎓(acridinium)酯标记、草酸酯标记、萤光素标记、吖啶鎓盐标记、咪唑标记、或水母发光蛋白标记。
熟练工作人员知道的适用于本发明的荧光标记的例示性荧光物质是152Eu、荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝素、邻苯二醛、Cy3、Cy5、绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(YFP、RFP)、或荧光胺(fluorescamine)。
还可以进一步鉴定或表征结合的核酸，例如通过EST(表达序列标签)数据库、在本发明检测系统上进行Northern印渍、或者在检测时或特异释放后进行测序，优选在预先通过PCR、RT-PCR、或克隆扩增之后进行。
熟练工作人员熟知本文未列出的可用于参照本发明进行标记的其它标记或分析方法，诸如质谱法、NMR光谱学、量热法、或电位测定法。
借助本发明，有可能以特别有利的方式鉴定、表征、和监测细胞的生理学状态和细胞的生物学过程。
由此，本发明还涉及本发明检测系统、本发明方法、或本发明检测单元的应用，所述检测单元包含具有恒定结构的A区和毗连A区且具有可变结构的B区，用于发现和/或鉴定和/或表征至少一种样品成分(成分d)，特别是样品中的核酸和/或蛋白质，或者用于寻找和/或鉴定细胞的或人工的结合配偶体，优选蛋白质、肽、核酸、化学活性物质(优选有机化合物)、药理学活性化合物、农作物防护剂、毒素(特别是毒物、致癌物质、和/或致畸物质)、除草剂、杀真菌剂、或杀虫剂。
在这一点上，非常感兴趣的是关于转录因子、阻遏子、或增强子相互作用的研究，或者关于酶(诸如激酶、磷酸酶、GTP酶、酯酶、糖基化酶、脂肪酶、氧化酶、还原酶、水解酶、异构酶、或连接酶)与其底物或调节剂(诸如诱导剂、第二信使，诸如cAMP或cGMP)相互作用的研究。其它研究对象是受体与其结合配偶体，诸如激素和细胞因子。
例如，若通过基因融合体(作为成分c)将一种细胞类型表达的基因总群体展现在本发明的检测系统阵列上，则可以经直接标记(例如35S同位素标记)作为阵列上的斑点鉴定各个蛋白质的结合配偶体(成分d)。
此外，有可能以三明治测定法的形式借助经标记成分d抗体鉴定成分d的结合配偶体，优选蛋白质。这种方法的特殊优势在于由此有可能由相互作用的物质集合(例如细胞提取物)特异性鉴定成分d的特异性相互作用的事实。
此外，同样有可能通过连续加入各因子来研究辅助因子、激活剂、和抑制剂对效应物与成分d相互作用的作用。
检测系统阵列的另一个重要应用领域是分析酶活性模式。因此，有可能例如借助阵列以简单方式鉴定利用AT32P作为磷酸供体的激酶的底物。
例如，若阵列包含以糖原核酶和/或磷酸化酶激酶作为效应物的基因融合体，则有可能在体外测定法中在阵列上研究效应物的作用，比如作为例如在糖原代谢中占据重要部分的蛋白激酶的底物。借助这种体外测定法，有可能根据两种效应物的磷酸化来显示例如通过加入cAMP激活的蛋白激酶。此外，有可能通过例如加入蛋白质磷酸酶1来研究各效应物上相应磷酸基团的消除。
本发明还涉及包含检测系统的缀合物，所述检测系统包含成分a-c、至少一种成分d，根据需要，还可包含诸如与成分d相互作用的物质，优选成分d抗体。
优选那些包含基因融合体作为成分c的缀合物。
作为成分d包含的缀合物优选蛋白质、肽、特别是转录因子、受体、酶和/或化学活性物质(优选有机化合物)、药理学活性化合物、激素、农作物防护剂、毒素(特别是毒物、致癌物质、和/或致畸物质)、除草剂、杀真菌剂、和/或杀虫剂。
图的描述下列附图意欲更详细的描述本发明而非限制。
图1描绘了本发明检测系统的示意图，该检测系统包含支持物(成分a(1))；结合于支持物的检测单元(成分b(2))，所述检测单元可以经间隔物(3)结合于支持物表面，且进一步包含恒定区A(4)和毗连的可变区B(5)；和包含与A区(4)与B区(5)互补的区的成分c(6)，所述成分c由合适接头(例如含嘌呤霉素(7)的核酸接头(8))和结合于接头的核酸部分(此处是RNA(9))形成。效应物单元(10)结合于核酸-嘌呤霉素接头(7，8)。
图2描绘了借助成分c所含标记物(11)对包含成分a-c的复合物的鉴定示意图。
图3描绘了借助标记物(例如成分d(12)所含标记物)对包含成分a-d的复合物的鉴定示意图，此处所示成分d(12)以效应物抗体作为范例。
实施例下列实施例意欲更详细的描述本发明，而非进行限制。实施例1例示性FLAG、MYC、STREP融合玻璃芯片的生成在使玻璃芯片表面硅烷化之前，首先将标准载玻片用丙酮在超声浴中处理5分钟以除去油污(设备微生物学使用的染色槽)；在空气中干燥后，将载玻片用0.1M NaOH溶液在超声浴中处理5分钟；然后用蒸馏水在超声浴中清洗5分钟，通过重复蒸馏水清洗过程除去最后残余的NaOH。
随后是硅烷化步骤，在95％含水乙醇(乙醇∶水95∶5v∶v)中制备2-3％(3-缩水甘油基氧基-丙基)三甲氧基硅烷溶液，用浓醋酸将硅烷的乙醇溶液调至pH4.9-5.2；加入并水解10分钟后，将玻璃表面用如此制备的硅烷化溶液在超声浴中处理2分钟；然后将硅烷化的载玻片用100％乙醇溶液在超声浴中进行清洗，在空气中干燥，并于80℃干燥20分钟。然后才有可能将氨基修饰的检测单元(成分b)固定在硅烷化玻璃表面。
参照标准方法(见下文)合成如此固定在芯片上的检测单元(成分b)。如下遵循Roberte和Szostak的方法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997)，产生编码FLAG、MYC、和STREP表位的RNA在PCR反应中借助Taq聚合酶(Promega，目录编号M166F)使用两种引物(SEQ ID NO2/3)扩增DNA模板序列(SEQ ID NO1)5′-GATTACAAGGACGACGACGACAAGGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGATC-TGGCAATGTGGAGCCACCCGCAGTTTGAGAAA-3′(Seq ID No1)5′-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGATTACAAG-GACGACGACGACAAGG-3′(Seq ID No2)5′-AGCGGATGCTTTCTCAAACTGCGGGTGGCTCCAC-3′(Seq ID No3)通过体外转录(Promega，目录编号P1300)将获得的双链DNA产物转录成相应的RNA序列5′-GGACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUGGAUUACAAGGACGACGACGACAAG-GAACAGAAGCUGAUCUCCGAAGAGGAUCUGGCAAUGUGGAGCCACCCGCA-GUUUGAGAAAGCAUCCGCU-3′(Seq ID No4)此外，将5’端携有磷酸酯基团而3’端携有嘌呤霉素残基(Pu)的接头(SEQ ID NO5)连接在表位编码RNA(SEQ ID NO4)的3’端。使用T4DNA连接酶(MBI，目录编号EL0333)并借助两种隔开分子(splint molecule)(SEQ ID NO6/7)(以80∶20％的比例混和在反应体系中)来进行连接反应。5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAANFAAAAAAAACCPu-3′(Seq ID No5)5′-GCGCGCTTTTTTTTTTAGCGGATGC-3′(Seq ID No 6)5′-GCGCGCNTTTTTTTTTAGCGGATGC-3′(Seq ID No7)另外，通过标准DNA固相合成法将荧光素衍生物(NF，Interactiva)掺入接头，该衍生物使得在与互补成分b的特异性杂交的情况中有可能经出现的荧光读出结合事件。
然后，通过变性6％TBE尿素凝胶纯化包含RNA(SEQ ID NO4)与接头(SEQ ID NO5)的连接产物而除去未连接的RNA。
遵循Roberts和Szostak的方法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997)，在体外翻译(Promega，目录编号L4960)中合成包含RNA(SEQ ID NO4)、表位编码肽(SEQ ID NO4)、与接头(SEQ ID NO5)的基因融合体，随后将翻译混和物与MgCl2(150mM)和KCl(530mM)一起温育。
MYCMDYKDDDDKEQKLISEEDLAMWSHPQFEKASA (Seq ID No4)FLAG STREP然后，通过ologo-d(T)纤维素(Amersham Pharmacia Biotech.目录编号27-5543-02)及随后的Strep-Tactin Sepharose(IBA.目录编号2-1202-005)将如此合成的基因融合体纯化至均质。
所用检测单元(成分b)在任何情况中包含具有序列5’-T15-3’的恒定区(A区)和包含8个核苷酸的可变区(B区)。对于成分b，选择了下列序列(SEQ ID NO8/9)成分(b)-15′-TTTTTTTTTTTTTTTAGCGGATG-3′(Seq ID No8)成分(b)-25′-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGA-3′(Seq ID No9)在这里，成分b-1在可变区B中包含与包含RNA(SEQ ID NO4)和接头(SEQ ID NO5)的分子互补的核苷酸序列，而成分b-2的可变区B对所述分子的靶序列没有特异性。通过标准固相DNA合成法制备成分b。为经3’端的固定，使用3’-氨基修饰的C3 CPG支持物(Glen Research，目录编号20-2950-10)；而对于5’端附着于玻璃表面，使用5’-氨基改性剂的C6亚磷酰胺(Glen Research，目录编号10-1906-90)。为了固定，分别将50μM成分b-1/2溶液(溶于0.1M NaOH)应用于硅烷化玻璃表面的位置1和2。温育至少2小时后，用温热的水清洗玻璃表面大约5分钟。随后用5×SSC缓冲液清洗芯片10分钟。
将用荧光素荧光标记poiyA区的基因融合体与成分b-1(位于位置1)的互补靶序列进行杂交将基因融合体溶于5×SSC缓冲液并转移至芯片，盖上盖片并于4℃温育5分钟；然后将芯片用5×SSC于室温清洗3次，并读取荧光素荧光；最后重复用0.5×SSC清洗，并再次读取荧光强度。据显示，只有在与成分b-1完全杂交的情况中，才有可能检测到荧光信号，而且没有发生任何基因融合体与成分b-2非特异性序列的相互作用。实施例2用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的例示性FLAG、MYC、STREP融合玻璃芯片的生成(使用荧光标记的特异性抗FLAG抗体检测FLAG表位)在使玻璃芯片表面硅烷化之前，首先将标准载玻片用丙酮在超声浴中处理5分钟以除去油污(设备微生物学使用的染色槽)；在空气中干燥后，将载玻片用0.1M NaOH溶液在超声浴中处理5分钟；然后用蒸馏水在超声浴中清洗5分钟，通过重复蒸馏水清洗过程除去最后残余的NaOH。
随后是硅烷化步骤。为此，在95％含水乙醇(乙醇∶水95∶5v∶v)中制备2-3％(缩水甘油基氧基-丙基)三甲氧基硅烷溶液，用浓醋酸将硅烷的乙醇溶液调至pH4.9-5.2；加入并水解10分钟后，将玻璃表面用如此制备的硅烷化溶液在超声浴中处理2分钟；然后将硅烷化的载玻片用100％乙醇溶液在超声浴中进行清洗，在空气中干燥，并于80℃干燥20分钟。然后才有可能将氨基修饰的检测单元(成分b)固定在硅烷化玻璃表面。
参照标准方法(见下文)合成固定在芯片上的检测单元(成分b)。如下遵循Roberte和Szostak的方法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997)，产生编码FLAG、MYC、和STREP表位的RNA在PCR反应中借助Taq聚合酶(Promega，目录编号M166F)使用两种引物(SEQ ID NO2/3)扩增DNA模板序列(SEQ ID NO1)。
通过体外转录(Promega，目录编号P1300)将获得的双链DNA产物转录成相应的RNA序列。
此外，将5’端携有磷酸基团而3’端携有嘌呤霉素残基(Pu)的接头(SEQID NO10)连接在表位编码RNA(SEQ ID NO4)的3’端。优选使用T4DNA连接酶(MBI，目录编号EL0333)并借助两种隔开分子(SEQ ID NO6/7)(以80∶20％的比例混和在反应体系中)来进行连接反应。5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCPu-3′(Seq ID No10)然后，通过变性6％TBE尿素凝胶纯化包含RNA(SEQ ID NO4)与接头(SEQ ID NO5)的连接产物而除去未连接的RNA。
遵循Roberts和Szostak的方法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997)，在体外翻译(Promega，目录编号L4960)中合成包含RNA(SEQ ID NO4)、表位编码肽(SEQ ID NO4)、与接头(SEQ ID NO10)的基因融合体，随后将翻译混和物与MgCl2(150mM)和KCl(530mM)一起温育。
然后，通过ologo-d(T)纤维素(Amersham Pharmacia Biotech.目录编号27-5543-02)及随后的Strep-Tact in Sepharose(IBA.目录编号2-1202-005)将如此合成的基因融合体纯化至均质。
所用检测单元(成分b)在任何情况中包含具有序列5’-T15-3’的恒定区(A区)和包含8个核苷酸的可变区(B区)。为成分b选择了下列序列(SEQ ID NO8/9)成分(b)-15′-TTTTTTTTTTTTTTTAGCGGATG-3′(Seq ID No8)成分(b)-25′-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGA-3′(Seq ID No9)在这里，成分b-1在可变区B中包含与包含RNA(SEQ ID NO4)和接头(SEQ ID NO10)的分子互补的核苷酸序列，而成分b-2的可变区B对所述分子的靶序列没有特异性。通过标准固相DNA合成法制备成分b。在经3’端固定的情况中，使用3’-氨基修饰的C3 CPG支持物(Glen Research，目录编号20-2950-10)；而对于5’端附着于玻璃表面，使用5’-氨基改性剂C6亚磷酰胺(Glen Research，目录编号10-1906-90)。为了固定，分别将50μM成分b-1/2溶液(溶于0.1M NaOH)应用于硅烷化玻璃表面的位置1和2。温育至少2小时后，用温热的水清洗玻璃表面大约5分钟。随后用5×SSC缓冲液清洗芯片10分钟。
将基因融合体与互补的成分b-1(位于位置1)进行杂交将融合蛋白溶于5×SSC缓冲液并转移至个别芯片，盖上盖片并于4℃温育5分钟；然后将芯片用5×SSC于室温清洗3次，加入先前用Cy5 Ab标记试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech.目录编号PA35000)荧光标记的抗FLAG抗体(Sigma Immunochemicals，目录编号F3040)溶液，并读取其荧光；最后重复用0.5×SSC清洗，并再次读取荧光强度。据显示，只有在与成分b-1完全杂交的情况中，才有可能检测到荧光信号，而且没有发生任何基因融合体或荧光标记抗体与成分b-2非特异性序列的相互作用。实施例3在电子可编址芯片上包含两种不同基因融合体的例示性基因融合体阵列的生成合成了两种彼此能够清楚区分且能够在可编址电子芯片上的杂交实验中表征的基因融合体(成分c)。为此目的，除了来自实施例2的基因融合体(成分c-1)，另借助模板DNA(SEQ ID NO11)、两种引物(SEQID NO12/13)、和隔开分子(SEQ ID NO14)，合成了包含RNA(SEQ IDNO15)、表位编码肽(SEQ ID NO15)、和接头(SEQ ID NO10)的另一种不同基因融合体(成分c-2)。
5′-GGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGAACAGAAGCT-GATCTCCGAAGAGGATCTGGCAATGTACAAGGACGACGACGACAAG-3′(Seq IDNo11)5′-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGGTGCGC-CGGTGCCGTAT-3′(Seq ID No12)5′-CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACATTGCCAGATCCT-3′(Seq ID No13)5′-TTTTTTTTTTCTTGTCGTC-3′(Seq ID No14)5′-GGACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUGGGUGCGCCGGUGCCGUAUCCG-GAUCCGCUGGAACCGCGUGAACAGAAGCUGAUCUCCGAAGAGGAUCUGG-CAAUGUACAAGGACGACGACGACAAG-3′(Seq ID No15)MYCMGAPVPYPDPLEPREQKLISEEDLAMYKDDDDKASA(Seq ID No15)E-TAG FLAG固定在电子芯片上的成分b是由标准DNA合成法获得的生物素标记成分b(SEQ ID NO16-28)。在这一点上，可以以3’端或5’端进行固定。在列出的实施例中，成分b通过3’端的生物素修饰附着于芯片表面。为此，在化学DNA合成法中使用生物素TEG CPG支持物(Glen Research，目录编号20-2955-10)，并合成具有适当生物素修饰且包含15个胸苷的恒定区(A区)和8个核苷酸的可变区(B区)的下列成分b成分(b)-35′-TTTTTTTTTTTTTTTGGATGCTTBio-3′(Seq ID No16)成分(b)-45′-TTTTTTTTTTTTTTTCTTGTCGTBio-3′(Seq ID No17)成分(b)-55′-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGABio-3′(Seq ID No18)根据其特定可变区B，成分b-3和成分b-4分别与相关成分c-1和成分c-2互补。成分b-5对成分c-1和成分c-2的互补靶序列在B区方面没有特异性。
将成分b-3-5固定化在50mM组氨酸缓冲液中制备特定成分b的1μM溶液；在每种情况中，将50μl适当成分b加到由半导体材料制成且包含3×3个位置的芯片上。于室温进行固定化。如下选择在芯片上占据的位置(行，列)1，1成分b-3；1，2成分b-4；2，1成分b-3；2，2成分b-4；3，1成分b-5；3，2成分b-5；1，3成分b-3；2，3成分b-4；3，3成分b-5。
将后包含SEQ ID NO4+10(成分c-3)和SEQ ID NO15+10(成分c-4)的连接核酸或者基因融合体(成分c-1和成分c-2)进行杂交将它们溶于50mM组氨酸缓冲液，并在适当芯片位置(行，列)在室温进行特定的杂交实验。
1，1成分c-1；1，2成分c-2；2，1成分c-1；2，2成分c-2；3，1成分c-1；3，2成分c-2；1，3成分c-3；2，3成分c-4；3，3无成分c。
然后通过下列步骤来表征芯片上发生的杂交事件。向位置1，1和1，2加入特异性识别FLAG表位且先前用Cy5 Ab标记试剂盒(AmershamPharmacia Biotech.目录编号PA35000)荧光标记的抗FLAG抗体(SigmaImmunochemicals，目录编号F3040)；向位置2，1和2，2加入识别E标签表位且先前用Cy5 Ab标记试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech.目录编号PA35000)荧光标记的E标签抗体(Amersham Pharmacia Biotech.目录编号27-9412-01)。向位置3，1、3，2、1，3、2，3、和3，3加入荧光标记的抗FLAG抗体或抗E标签抗体，以检测抗体可能的非特异性结合事件。
在所有情况中，读取荧光强度借助荧光标记的抗FLAG抗体作为荧光探针显示，在成分b与互补的成分c-1/2完全杂交的情况中，在芯片位置1，1和1，2发生了特异性阳性结合事件；在抗E标签抗体(位于位置2，1和2，2)相互作用的情况中，只有在携带成分c-2(加了E标签表位)的位置2，2检测到荧光强度增强。这些实验清楚显示相关抗体特异性识别起始的成分c-1/2。一个对照实验首先调查两种融合基因能够与可变区(B区)无论如何与成分c(位于位置3，1和3，2)不互补的成分b发生非特异性相互作用的可能性。加入抗FLAG抗体后，没有检测到荧光，所以能够推定没有发生成分c的非特异性杂交。另外，进行另一个对照实验以排除抗FLAG抗体与双链核酸发生相互作用的可能性。为此目的，将不含肽表位的相关成分c-3/4加到位置1，3和2，3，并加入抗FLAG抗体或抗E标签抗体，显示没有发生荧光变化。最后，还有可能显示荧光标记的抗FLAG抗体或抗E标签抗体无论如何对单链成分b没有亲和力(位置3，3上的实验)。作为概要，下表概述了实验结果芯片位置 成分c/成分b 抗体 荧光信号1，1 1/3 FLAG+1，2 2/4 FLAG+2，1 1/3 E标签 -2，2 2/4 E标签 +3，1 1/5 FLAG-3，2 2/5 FLAG-1，3 3/3 FLAG-2，3 4/4 E标签 -3，3 -/5 E标签 -
序列表<110>Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG<120>用于研究分子相互作用的检测系统及其制备和应用<130>99F030PCT1<140>PCT/EP00/04791<141>2000-05-25<150>DE 19923966.5<151>1999-05-25<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述模板<400>1gattacaagg acgacgacga caaggaacag aagctgatct ccgaagagat ctggcaatgt 60ggagccaccc gcagtttgag aaa 83<210>2<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatggatta caaggacgac 60gacgacaagg70<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3agcggatgct ttctcaaact gcgggtggct ccac34<210>4<211>120<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述转录本-蛋白质<400>4ggacaauuac uauuuacaau uacaauggau uacaaggacg acgacgacaa ggaacagaag60cugaucuccg aagaggaucu ggcaaugugg agccacccgc aguuugagaa agcauccgcu120<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述嘌呤霉素-接头<400>5aaaaaaaaaa aaaaaaaana aaaaaaacc 29<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述隔开物<400>6gcgcgctttt ttttttagcg gatgc 25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述隔开物<400>7gcgcgcnttt ttttttagcg gatgc 25<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述成分b-1<400>8tttttttttt tttttagcgg atg23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述成分b-2<400>9tttttttttt tttttgtagg cga23<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述嘌呤霉素-接头<400>10aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacc 29<210>11<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述模板<400>11ggtgcgccgg tgccgtatcc ggatccgctg gaaccgcgtg aacagaagct gatctccgaa60gaggatctgg caatgtacaa ggacgacgac gacaag 96<210>12<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>12taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatgggtgc gccggtgccg60tat 63<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>13cttgtcgtcg tcgtccttgt acattgccag atcct 35<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述隔开物<400>14tttttttttt cttgtcgtc 19<210>15<211>123<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述转录本-蛋白质<400>15ggacaauuac uauuuacaau uacaaugggu gcgccggugc cguauccgga uccgcuggaa60ccgcgugaac agaagcugau cuccgaagag gaucuggcaa uguacaagga cgacgacgac120aag 123<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述成分b-3<400>16tttttttttt tttttggatg ctt23<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述成分b-4<400>17tttttttttt tttttcttgt cgt23<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述成分b-5<400>18tttttttttt tttttgtagg cga23<210>19<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述FLAG-MYC-STREP表位<400>19Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu1 5 10 15Glu Asp Leu Ala Met Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ala Ser Ala20 25 30<210>20<211>36<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述E标签-MYC-FLAG表位<400>20Met Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Glu Gln1 5 10 15Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Met Tyr Lys Asp Asp Asp Asp20 25 30Lys Ala Ser Ala3权利要求
1.一种检测系统，其包含i)支持物(成分a)，和ii)结合于支持物的至少一种检测单元(成分b)，其中所述检测单元包含配对系统，该配对系统含有具有恒定序列的A区与毗连A区且具有可变序列的B区，和iii)与其连接且包含与检测单元(成分b)互补的序列的配对系统-效应物融合分子(成分c)。
2.权利要求1的检测系统，其中A区长度是5个-大约80个核苷酸或核苷酸类似物，优选5个-大约30个核苷酸或核苷酸类似物，特别是10个-30个核苷酸或核苷酸类似物。
3.权利要求1或2的检测系统，其中B区长度是5个-30个核苷酸或核苷酸类似物，优选5-10个核苷酸或核苷酸类似物，特别是7-8个核苷酸或核苷酸类似物。
4.权利要求1-3的检测系统，其中核苷酸是脱氧核糖核苷酸(d)、核糖核苷酸(r)、或2-羟基-甲基核糖核苷酸(hmr)。
5.权利要求2的检测系统，其中核苷酸类似物是p-RNA、CHA、或PNA单体。
6.权利要求1-4任一项的检测系统，其中A区包含polyT链，优选T7-15链。
7.权利要求1-6任一项的检测系统，其中成分c选自核酸-蛋白质受者融合分子和/或核酸-蛋白质融合分子，特别是核酸-嘌呤霉素衍生物和/或核酸-嘌呤霉素-蛋白质融合分子。
8.权利要求1-7任一项的检测系统，其中支持物包括陶瓷、金属、特别是半导体、贵金属、玻璃、塑料、晶态材料或支持物特别是所述材料的薄层、或(生物)分子丝诸如纤维素、结构蛋白质，或所述材料的联合。
9.权利要求1-8任一项的检测系统，其中检测系统装配在电子芯片上。
10.用于制备权利要求1-9任一项的检测系统的方法，包括i)通过将包含具有恒定序列的A区与毗连A区且具有可变序列的B区的检测单元(成分b)附着于支持物(成分a)来制备阵列，其中每一个阵列位置可以指定具有特定B区的检测单元，并ii)将检测单元(成分b)和包含与检测单元(成分b)互补的序列的配对系统-效应物融合分子(成分c)进行杂交。
11.用于分离并鉴定包含配对系统-效应物融合分子的溶液中个别成分的方法，包括i)制备配对系统-效应物融合分子文库(成分c文库)，优选基因融合体文库，ii)将配对系统-效应物融合分子(成分c)在包含成分a和成分b的阵列上进行杂交，所述成分b的B区包括所有可能排列，有可能为每一个别成分b特异性指定一个阵列位置，iii)鉴定形成成分b-成分c复合物的阵列位置，iv)表征iii)中鉴定的成分b-成分c复合物。
12.权利要求10或11的方法，其中使用A区长度是5-80个核苷酸或核苷酸类似物，优选5-30个核苷酸或核苷酸类似物，特别是10-30个核苷酸或核苷酸类似物的成分b。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中使用B区长度是5-30个核苷酸，优选7-8个核苷酸的成分b。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中使用包含polyT链，优选T7-15链，或与核糖体结合位点互补的链的A区。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中支持物包括陶瓷、金属、特别是半导体、贵金属、玻璃、塑料、晶态材料或支持物特别是所述材料的薄层、或(生物)分子丝诸如纤维素、结构蛋白质，或所述材料的联合。
16.权利要求10-15任一项的方法，其中所述方法是在电子芯片上进行的。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中样品成分像成分b或像成分c般借助电场与结合于支持物的检测单元结合。
18.权利要求10-17任一项的方法，其中所用成分c是配对系统-效应物融合分子，其包括核酸和/或其类似物，优选DNA、RNA特别是mRNA、RNA-嘌呤霉素衍生物、和蛋白质。
19.权利要求10-18任一项的方法，其中优选借助电场，使样品的至少一种RNA-蛋白质融合分子与结合于支持物且具有通式3’-(X)7-8-(T7-15)-5’的至少一种核酸结合，其中X是选自腺苷、胸苷、尿苷、鸟苷、或胞苷的任何核苷酸，而根据需要，在下一步中，优选借助极性倒转且场强低于第一步的电场，除去未结合的或非特异性结合的核酸。
20.权利要求10-19任一项的方法，其中在第一步中，通过化学方法或借助合适的连接酶，优选T4DNA连接酶，使合适的核酸接头，优选dA27dCdC接头与样品的RNA群体融合，然后翻译，随后诱导RNA-接头-蛋白质融合体的形成，在第二步中，优选借助电场，使RNA-接头-蛋白质融合分子结合本发明检测系统的核酸，其优选具有通式3’-(X)7-8-(T27GG)-5’，其中X是选自腺苷、胸苷、尿苷、鸟苷、或胞苷的任何核苷酸，而根据需要，在下一步中，优选借助极性倒转且场强低于第二步的电场，除去未结合的或非特异性结合的核酸。
21.用于鉴定对成分c的特异效应物单元具有亲和力的一种或多种结合配偶体(成分d)相互作用的方法，包括i)将配对系统-效应物融合分子阵列与包含至少一种成分d的待分析物质混和物一起温育，ii)鉴定已形成成分b-成分c-成分d复合物的阵列位置，并iii)表征在ii)中鉴定的成分b-成分c-成分d复合物。
22.权利要求21的方法，用于寻找和/或鉴定和/或表征至少一种样品成分，特别是样品中的核酸和/或蛋白质，或者用于寻找和/或鉴定细胞的或人工的结合配偶体，优选蛋白质、肽、核酸、化学活性物质优选有机化合物、药理学活性化合物、农作物防护剂、毒素特别是毒物、致癌物质、和/或致畸物质、除草剂、杀真菌剂、或杀虫剂。
23.权利要求21或22的方法，其中至少一种成分d是直接标记的。
24.权利要求21-23任一项的方法，其中使用经标记的特异结合配偶体诸如抗体检测至少一种效应物结合的成分d。
25.权利要求21-24任一项的方法，其中通过加入影响相互作用的其它物质诸如辅助因子、辅酶、激活剂、或抑制剂来改变步骤ii)中效应物与成分d之间的相互作用。
26.权利要求21-25任一项的方法，其中测定酶活性模式。
27.包含检测系统(成分a到c)和成分d的缀合物。
28.权利要求27的缀合物，其中成分d是基因融合体。
29.权利要求27或28的缀合物，其中成分d是蛋白质、肽、特别是转录因子、受体、或酶诸如激酶、磷酸酶、GTP酶、酯酶、糖基化酶、脂肪酶、氧化酶、还原酶、水解酶、异构酶、或连接酶及其底物或调控剂诸如诱导剂、第二信使诸如cAMP或cGMP、和/或化学活性底物优选有机化合物、药理学活性化合物、激素、农作物防护剂、毒素特别是毒物、致癌物质、和/或致畸物质、除草剂、杀真菌剂、和/或杀虫剂。
全文摘要
本发明涉及包含下述的检测系统(a)支持物(成分a)；和(b)至少一种检测单元(成分b)，优选结合于支持物的核酸，其中所述检测单元(成分b)包含具有恒定结构的A区，和毗连A区且具有可变结构的B区。本发明还涉及用于分离样品中个别成分的方法，其中在适当条件下结合于支持物的至少一种检测单元(成分b)结合样品中至少一种成分。本发明还涉及本发明检测系统和方法用于定位和/或鉴定或表征样品中的核酸和/或蛋白质或者用于定位和/或鉴定细胞的或人造的结合配偶体的应用。
文档编号G01N33/53GK1413262SQ00809231
公开日2003年4月23日 申请日期2000年5月25日 优先权日1999年5月25日
发明者D·博肯坎普, H－U·霍普, P·伯格斯塔勒, D·孔茨, U·沃克, M·皮格诺特, P·瓦格纳 申请人:希兹利昂两合公司