专利名称：抗人肝癌单克隆抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和医学领域。更具体地，本发明涉及抗人肝癌的特异性单克隆抗体及其应用。
背景技术：
原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，严重危害人类的健康和生命。目前，就世界范围而言，其发病率呈上升趋势，作为一种高死亡率的疾病，肝癌的病因、发生、演化、诊断、治疗都越来越引起人们的关注。其中，肝癌的早期诊断对于患者的转归以及预后都具有十分重要的意义。
目前，肝癌诊断的标志物首推AFP，用于肝癌的血清学诊断已沿用多年，最近又用于肝癌血液转移的基因诊断。但此方法在特异性和敏感性上仍存在问题。就特异性而言，对于HCC患者，干扰诊断准确性的因素主要是因为部分伴有肝硬化或慢性肝炎的患者血中可检出AFP蛋白以及mRNA。权威统计表明，血清AFP阳性率在急性黄疸性肝炎为19.8％，慢迁肝为19.9％，慢活肝为34.4％，而肝炎后肝硬化可达44.6％，上述非癌肝病的血清AFP浓度多在25-200ng/ml之间。对比肝癌及癌旁肝组织的Northern杂交和免疫组化结果，常发现癌旁肝组织有AFP的弱阳性表达，因此常有血清AFP蛋白的假阳性结果。当这些病人由于某种原因如炎症、坏死导致部分肝细胞脱落入血时，还可造成血液中AFP mRNA的假阳性结果。Matsmnura等的一组研究显示在15％的肝硬化患者和12％慢性肝炎患者中可检出AFP mRNA阳性。另一组实验中，Jiang等则在11例慢性肝炎患者中检出6例AFP mRNA阳性，2例急性肝炎患者中检出1例AFP mRNA阳性。就敏感性而言，大约1/3的HCC患者，其血清AFP阴性(＜20ng/ml)，在分化好(I级)及分化极差(IV级)的HCC内AFP的阳性率也较低，因此对这些肿瘤患者不能有效地检出。这就说明AFP在肝癌诊断中存在相当的漏诊率和误诊率，所以，要提高肝癌的早期诊断率需要有敏感性更高和特异性更强的新的标志物。
由于目前尚缺特异性强的检测和/或治疗肝癌的有效方法，因此，本领域迫切需要开发特异性抗人肝癌单克隆抗体，以及检测和治疗肝癌的有效方法。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗人肝癌标志性抗原的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种特异性检测人肝癌的试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种特异性治疗人肝癌的治疗剂。
在本发明的第一方面，提供了一种免疫球蛋白，其特征在于，它特异性地结合于MXR7蛋白。较佳地，所述免疫球蛋白特异性地结合于去除了N端的MXR7蛋白(例如，缺失了N端50-100个氨基酸，较佳地50-80个氨基酸后的MXR7蛋白)更佳地，所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的MXR7蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或是缺失了N端55个氨基酸的MXR7蛋白。
在本发明的一个实例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。
在本发明的另一实例中，所述的免疫球蛋白由小鼠杂交瘤细胞系MF4C4，CCTCC No.C200111所产生。
在本发明的第二方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有特异性地结合于MXR7蛋白的免疫球蛋白和选自下组的偶联部分药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。
在本发明的第三方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤细胞系MF4C4，CCTCC No.C200111。
在本发明的第四方面，提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
图1用单克隆抗体MF4C4，通过western印迹法检测人胚肝细胞MXR7蛋白的表达。
图2用单克隆抗体MF4C4，通过免疫组化方法检测肝癌组织中MXR7的表达。
具体实施例方式
本发明人经多年研究发现，MXR7基因与肝癌有十分密切的联系，可以作为肝癌特异性敏感标志基因。在此发现基础上，从胎盘cDNA文库分离得到MXR7基因，表达MXR7蛋白，并研制成功一种杂交瘤单克隆抗体，即抗人肝癌单抗MF4C4。此抗体经研究证实稳定性好，和肝癌抗原结合的特异性强。
MXR7是1996年Lage等人通过差异杂交方法分离克隆的。同期，本发明人在研究肝癌特异性敏感标志基因时，从肝癌cDNA文库分离得到MXR7基因。该基因全长cDNA序列为2263bp，定位于人染色体Xq26，由8个外显子组成，编码由580个氨基酸组成的硫酸类肝素蛋白聚糖，分子量66kDa，通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)锚连接于细胞膜，属于蛋白聚糖家族。MXR7基因在胚胎时大量表达于中胚层组织，合成于胎儿肝脏、肺脏和肾脏，在胎盘组织内低水平表达，其它组织内则不表达，被认为参与发育期形态发生和生长调控，一旦形态发生完成，转录呈负调节，断奶后就不能检测到。
研究表明，MXR7与肝癌的发生发展有密切关系，不仅在肝癌的早期有较高的检出率，而且随着肝癌的进展，其检出率也随之增高。本发明人检测到76.7％(23/30)肝癌组织内有MXR7表达，其中13.3％(4/30)癌旁组织有MXR7弱阳性表达，而另外7例肝癌组织内MXR7表达阴性的病人，其癌旁组织MXR7也表达阴性。重要的是在血清AFP阳性的病人肝癌中88％表达MXR7 mRNA，而在血清AFP阴性的病人肝癌中仍可发现有73％呈MXR7 mRNA表达阳性。在直径＜3cm肝癌中，MXR7 mRNA阳性表达率为77％，显著高于血清AFP水平升高率43％和肝癌中AFPmRNA表达率41％。MXR7在肝腺瘤、胆管细胞癌、肝转移癌和12种常见实体瘤以及21个非肝癌细胞系中均未检测到MXR7表达，表明MXR7是一个肝癌内特异表达的基因，其特异性明显高于目前仍用于肝癌诊断标志物的AFP，并且比AFP更敏感、检出率更高，尤其在AFP阴性的肝癌患者中有较高的检出率。因此MXR7是一新的肝癌标志物，能与AFP互补协同用于肝癌的早期诊断。
另一方面，由于MXR7在肝癌的恶性进展中的表达水平逐渐增高，而可能成为用于判断肝癌的预后或抗肝癌转移和复发的重要的靶基因。
MXR7基因是目前在肝癌中发现的与X染色体相关的两个基因之一。肝癌具有十分明显的家族聚集性和遗传易感性，男性发病率约是女性的10倍，流行病学调查已证明母亲患肝癌对子代的遗传影响远大于父亲患肝癌对子代的影响。MXR7基因是否肝癌易感性遗传的主基因尚需研究。
MXR7与肝癌的关系十分密切，其作用的分子机理仍不清楚，有待进一步研究。MXR7基因在胎肝高水平表达，成人关闭，肝癌时复苏，与AFP基因表达的时空分布很相似，但MXR7 mRNA表达比AFP更敏感，阳性率更高。该基因以GPI锚连接于细胞表面，是IGF-2的共同受体(co-receptor)。因此与该家族其它成员一样可以脱落入血，在肝癌患者血液中可检测到，以此作为肝癌早期血清学诊断的特异性标志物。
在上述研究基础上，本发明人利用杂交瘤技术制备了抗人MXR7的单克隆抗体MF4C4。
本发明的MF4C4单抗或其片段可用于肝癌的放射性定位的诊断成像，还可用于免疫治疗，例如通过直接或间接地将MF4C4单抗或其片段与化学治疗剂、或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。
本发明包括具有MF4C4单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有MF4C4单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与MF4C4单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与MF4C4单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与MF4C4单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如131I-MF4C4，MTX-MF4C4偶联物等。
对于本发明MF4C4单抗重链和轻链序列，可以用常规方法测定。MF4C4单抗V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与MF4C4单抗CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab′)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了编码肝癌标志性抗原的cDNA。本发明的MF4C4单抗的抗原的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据肝癌标志性抗原的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以如上用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系MF4C4(CCTCC No.C200111)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
此外，本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。一种人肝癌诊断试剂盒，已完成临床实验193例，检测阳性率高达74％。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于肝癌的治疗。此外，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α等。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的MF4C4免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明不仅提供了产生高效价抗人MXR7单克隆抗体的杂交瘤细胞系，还提供了单抗检测临床病人血清中MXR7蛋白的含量。根据文献检索，目前国际国内均无相同工作的报道。本发明的单克隆抗体可成功地应用于原发性肝细胞肝癌的血清学诊断(临床适用)，特别是对α-FP阴性肝癌的鉴别诊断和判断肝癌病人的预后极有意义。本发明抗体还能应用于肝癌的免疫治疗，提高肝癌的综合治疗疗效。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人MXR7 cDNA编码序列的获得按MXR7基因的序列，合成分别位于阅读框上游和下游的引物，从胎盘cDNA文库扩增分离得到如下MXR7基因的编码序列(SEQ ID NO1)。
1 cagcacgtct cttgctcctc agggccactg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc61 gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcaggat ggccgggacc121 gtgcgcaccg cgtgcttggt ggtggcgatg ctgctcagct tggacttccc gggacaggcg181 cagcccccgc cgccgccgcc ggacgccacc tgtcaccaag tccgctcctt cttccagaga241 ctgcagcccg gactcaagtg ggtgccagaa actcccgtgc caggatcaga tttgcaagta301 tgtctcccta agggcccaac atgctgctca agaaagatgg aagaaaaata ccaactaaca361 gcacgattga acatggaaca gctgcttcag tctgcaagta tggagctcaa gttcttaatt421 attcagaatg ctgcggtttt ccaagaggcc tttgaaattg ttgttcgcca tgccaagaac481 tacaccaatg ccatgttcaa gaacaactac ccaagcctga ctccacaagc ttttgagttt541 gtgggtgaat ttttcacaga tgtgtctctc tacatcttgg gttctgacat caatgtagat601 gacatggtca atgaattgtt tgacagcctg tttccagtca tctataccca gctaatgaac661 ccaggcctgc ctgattcagc cttggacatc aatgagtgcc tccgaggagc aagacgtgac721 ctgaaagtat ttgggaattt ccccaagctt attatgaccc aggtttccaa gtcactgcaa
781 gtcactagga tcttccttca ggctctgaat cttggaattg aagtgatcaa cacaactgat841 cacctgaagt tcagtaagga ctgtggccga atgctcacca gaatgtggta ctgctcttac901 tgccagggac tggtgatggt taaaccctgt ggcggttact gcaatgtggt catgcaaggc961 tgtatggcag gtgtggtgga gattgacaag tactggagag aatacattct gtcccttgaa1021 gaacttgtga atggcatgta cagaatctat gacatggaga acgtactgct tggtctcttt1081 tcaacaatcc atgattctat ccagtatgtc cagaagaatg caggaaagct gaccaccact1141 attggcaagt tatgtgccca ttctcaacaa cgccaatata gatctgctta ttatcctgaa1201 gatctcttta ttgacaagaa agtattaaaa gttgctcatg tagaacatga agaaacctta1261 tccagccgaa gaagggaact aattcagaag ttgaagtctt tcatcagctt ctatagtgct1321 ttgcctggct acatctgcag ccatagccct gtggcggaaa acgacaccct ttgctggaat1381 ggacaagaac tcgtggagag atacagccaa aaggcagcaa ggaatggaat gaaaaaccag1441 ttcaatctcc atgagctgaa aatgaagggc cctgagccag tggtcagtca aattattgac1501 aaactgaagc acattaacca gctcctgaga accatgtcta tgcccaaagg tagagttctg1561 gataaaaacc tggatgagga agggtttgaa agtggagact gcggtgatga tgaagatgag1621 tgcattggag gctctggtga tggaatgata aaagtgaaga atcagctccg cttccttgca1681 gaactggcct atgatctgga tgtggatgat gcgcctggaa acagtcagca ggcaactccg1741 aaggacaacg agataagcac ctttcacaac ctcgggaacg ttcattcccc gctgaagctt1801 ctcaccagca tggccatctc ggtggtgtgc ttcttcttcc tggtgcactg act(SEQ ID NO1)全长为1853bp，其中ORF位于第109-1848位，编码由580个氨基酸组成的硫酸类肝素蛋白聚糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，分子量66kDa，通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)锚连接于细胞膜，属于蛋白聚糖家族。
MAGTVRTACL VVAMLLSLDF PGQAQPPPPP PDATCHQVRS FFQRLQPGLK 50WVPETPVPGS DLQVCLPKGP TCCSRKMEEK YQLTARLNME QLLQSASMEL 100KFLIIQNAAV FQEAFEIVVR HAKNYTNAMF KNNYPSLTPQ AFEFVGEFFT 150DVSLYILGSD INVDDMVNEL FDSLFPVIYT QLMNPGLPDS ALDINECLRG 200ARRDLKVFGN FPKLIMTQVS KSLQVTRIFL QALNLGIEVI NTTDHLKFSK 250DCGRMLTRMW YCSYCQGLVM VKPCGGYCNV VMQGCMAGVV EIDKYWREYI 300LSLEELVNGM YRIYDMENVL LGLFSTIHDS IQYVQKNAGK LTTTIGKLCA 350HSQQRQYRSA YYPEDLFIDK KVLKVAHVEH EETLSSRRRE LIQKLKSFIS 400FYSALPGYIC SHSPVAENDT LCWNGQELVE RYSQKAARNG MKNQFNLHEL 450KMKGPEPVVS QIIDKLKHIN QLLRTMSMPK GRVLDKNLDE EGFESGDCGD 500DEDECIGGSG DGMIKVKNQL RFLAELAYDL DVDDAPGNSQ QATPKDNEIS 550TFHNLGNVHS PLKLLTSMAI SVVCFFFLVH580(SEQ ID NO2)
其中，与公布的MXR7基因相比，在913位(请根据新的序列确定位置)存在a→g的改变(氨基酸由M→V)。
实施例2人MXR7蛋白片段的表达本发明人对MXR7的表达进行了多次尝试，发现去除其N端可有效表达和纯化MXR7蛋白。
在该实施例中，用下列PCR引物引物15′-cggaattctgccaggatcagat-3′(SEQ ID NO3)引物25′-cgctcgagtcagtgcaccag-3′(SEQ ID NO4)通过PCR法，从人胎盘cDNA库(CLONTECH，Human Placenta cDNA)中克隆人MXR7 cDNA(523aa，缺失N端57aa)，将其连接到6×His融合表达载体pPROEXHT(GIBCO BRL，10711-018)中，经IPTG诱导表达后，用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化MXR7蛋白。
实施例3MF4C4单抗的制备和纯化(1)杂交瘤的制备以实施例2中纯化的MXR7蛋白免疫BALB/c小鼠初次免疫时将弗氏完全佐剂与抗原100μl(50-100μg)等体积混合，充分乳化，腹腔注射。3周后对小鼠进行加强免疫，抗原量减半，并改用弗氏不完全佐剂，注射体积和方法不变。待小鼠血清效价达到要求后准备进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行冲击免疫(50μg抗原)。
在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580)。
将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养(以小鼠腹腔巨噬细胞为滋养细胞)。
接着，用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清以纯化的MXR7蛋白(2μg/ml)包被酶标板，每孔100μl，4℃，过夜。室温封闭后，加待检上清100μl，37℃孵育1h。洗涤3遍，加酶标二抗(抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育45min。甩掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。结果用酶标仪测定波长450nm值，OD值高于阴性对照2倍以上者可视为阳性。
然后，将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为滋养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。
一种阳性杂交瘤细胞为人肝癌杂交瘤细胞系MF4C4，该杂交瘤细胞系于2001年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)No.C200111。
(2)MF4C4单抗的制备和纯化将上述杂交瘤细胞MF4C4接种至小鼠腹腔，制备腹水，再从腹水中提取单抗。
单抗MF4C4的纯化采用protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和层析柱，用PBS平衡柱子后，取含抗MXR7单抗的腹水或杂交瘤细胞培养上清过柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以50mmol/L的甘氨酸-HCl溶液(pH2.3)洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析浓缩后用于制备酶标抗体。
实施例4MF4C4单抗的鉴定用实施例3中制备的MF4C4单抗，通过常规蛋白印迹杂交(Western blot)实验检测人胚肝细胞中MXR7蛋白的表达。结果显示，单抗与66KD位置的一条蛋白带特异性结合(图1)。
用MF4C4单抗，按常规方法对肝细胞癌组织切片进行免疫组化染色。结果如图4所示，其中图4A-4D分别为不同放大倍数，结果表明在肿瘤包膜区进展性癌巢中胞浆中着色明显。说明抗MXR7单克隆抗体具有较好的特异性和敏感性。
实施例5用实施例3中制备的MF4C4单抗，通过间接竞争ELISA方法检测肝癌病人(100例)、非肝癌肝胆疾病患者(43例)和正常人(50例)血清中MXR7蛋白的含量。结果显示，74％肝癌病人血清中MXR7蛋白高表达，非肝癌肝胆疾病患者中仅有18.60％MXR7蛋白为阳性，且蛋白表达水平较肝癌病人低，而正常人血清中MXR7蛋白的含量很低。这说明该抗MXR7单克隆抗体具有较好的特异性和敏感性。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>王，红阳<120>抗人肝癌单克隆抗体及应用<130>014717<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1853<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(109)..(1848)<400>1cagcacgtct cttgctcctc agggccaetg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc-60gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcagg atg gcc ggg 117Met Ala Gly1acc gtg cgc acc gcg tgc ttg gtg gtg gcg atg ctg ctc agc ttg gac 165Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp5 10 15ttc ccg gga cag gcg cag ccc ccg ccg ccg ccg ccg gac gcc acc tgt 213Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys20 25 30 35cac caa gtc cgc tcc ttc ttc cag aga ctg cag ccc gga ctc aag tgg 261His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp40 45 50gtg cca gaa act ccc gtg cca gga tca gat ttg caa gta tgt ctc cct 309Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro55 60 65aag ggc cca aca tgc tgc tca aga aag atg gaa gaa aaa tac caa cta 357Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu70 75 80aca gca cga ttg aac atg gaa cag ctg ctt cag tct gca agt atg gag 405Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu
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权利要求
1.一种免疫球蛋白，其特征在于，它特异性地结合于MXR7蛋白。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的MXR7蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者所述的MXR7蛋白缺失N端50-100个氨基酸。
3.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系MF4C4，CCTCC No.C200111所产生。
5.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有特异性地结合于MXR7蛋白的免疫球蛋白和选自下组的偶联部分药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。
6.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系MF4C4，CCTCC No.C200111。
7.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白或权利要求5所述的免疫偶联物。
8.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白或权利要求5所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种抗人肝癌标志性抗原的特异性单克隆抗体MF4C4。该单克隆抗体具有与肝癌抗原结合的特异性强的特点。本发明还提供了MF4C4免疫球蛋白、及其片段和免疫偶联物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶联物的药物组合物。本发明还提供了一种检测肝癌的检测试剂盒。
文档编号G01N33/574GK1412201SQ01131940
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月17日 优先权日2001年10月17日
发明者王红阳, 陈正军, 吴秀菊, 吴孟超 申请人:王红阳