专利名称：一种微区反射透射光谱仪的制作方法
技术领域：
本实用新型属于微区光学测量领域。
普通的光谱仪对于微米量级尺寸的光学及生物样品的测量，误差很大。因为微米级的样品很难进行固定和定位，特别是对入射方向灵敏的样品，如光子晶体、多层介质膜等，它们相对于入射光的方向在普通光谱仪上很难加以确认和调整(文献1，曾昭权、龚光林等，人体血细胞的显微光谱研究，光谱学与光谱分析，Vol.16，No.6，(51-54)1996)。文献1中给出的微区光谱仪虽然也能进行样品的微区透射谱测量，但是它对入射光源的大小及方向没有明确的限制，故不能将入射光源相对于样品表面的入射角限制在小的范围内，且不能测量微区样品的反射率。
本实用新型的目的在于提供一种微区反射透射光谱仪，用于测量线尺度为5μm-300μm的光学及生物样品的透射率及反射率。本实用新型由光源系统、倒置显微镜系统、成像及聚光系统、光栅光谱仪、光电倍增管及其电源、锁相放大器及斩波器、计算机实时控制及数据采集处理系统等组成。本实用新型因对入射光源的大小及方向的限制，可使入射光源的面积小于被测样品的面积，而且可使入射光源相对于样品表面的入射角限制在很小的范围内；本实用新型因使用锁相放大器，可检测出淹没在噪声中的微弱信号。
本实用新型的目的是这样实现的按
图1所示，本实用新型的透射光谱仪由光源1，斩波器2，双光阑3、4，聚光物镜5，载物台6，成像物镜7，半反镜8，限束光阑9，聚光透镜10，光栅光谱仪11，光电倍增管12，锁相放大器13，计算机实时控制及数据采集处理系统14组成。
此设备分为6部分光源系统包括光源1，双光阑3，4和聚光物镜5(可以根据不同的要求选择不同放大倍数的聚光物镜)，双光阑之间的距离为显微镜光学筒长；倒置显微镜系统主要由载物台6，成像物镜7，半反射镜8及目镜组成；成像及聚光系统包括位于成像处的限束光阑9和光栅光谱仪前的聚光透镜10；光栅光谱仪11为普通商用仪器；锁相放大器13及斩波器2；计算机14。
下面结合图1在描述测量过程中说明其构造在开启电源前，将斩波器2的斩波片部分插入光源1与双光阑3、4之间。开启设备的电源系统，将斩波器的输出信号接到锁相放大器13的参考信号输入端。将待测样品放在由两个盖玻片组成的样品池中，盖玻片之间的间距由被测样品的厚度决定。样品池放在聚光物镜5与成像物镜7之间的载物台6上。调节载物台与成像物镜之间的距离，使得样品的下表面成像清晰。然后调节光源系统相对于载物台的距离，使得光源灯丝成像于被测样品的上表面。去掉倒置显微镜目镜。在物镜的成像处放置一限束光阑9，用以限制被测样品成像范围以外的光进入光谱仪。入射光经成像物镜7透射到半反镜8上，该束光经半反镜反射到限束光阑9上。限束光阑9与聚光透镜10之间的距离根据光路调节的需要而定。聚光透镜10将从限束光阑9出射的光聚焦到光栅光谱仪11的入射狭缝，光谱仪的波长选择由计算机14通过RS-232接口控制。光栅光谱仪的出射狭缝处接光电倍增管12，光电倍增管的灵敏范围200-900nm。将光电倍增管的输出信号接入锁相放大器13的信号输入端。调节锁相放大器的相位按钮，使得锁相放大器输出信号最大。锁相放大器的输出信号经RS-232接口引入计算机14。通过计算机的实时控制及数据采集处理系统控制光谱仪光栅的转动，以及采集锁相放大器的输出信号。
在制作微区反射光谱仪时(如图2所示)，其它部分与上述制作微区透射光谱仪一致，但是需将光源系统中的聚光物镜5去掉，并将光源系统及斩波器2移至倒置显微镜另一端的反射光源端口，反射光源由一全反镜15引入倒置显微镜的成像物镜7。此时倒置显微镜的成像物镜同时起着聚光和成像的作用。调节光源系统的三维位置、及载物台与成像物镜之间的距离，使得光源灯丝成像于样品的下表面。
本实用新型可用于测量线尺度为5μm-300μm的光学及生物样品的透射率及反射率。
其原理为首先测出有样品时光对样品的透射谱或反射谱，再测出无样品时的光源谱，然后进行相应的除法处理求得样品的透射率与反射率。
光源系统由灯源，双光阑和聚光物镜组成。双光阑的孔径大小φ与聚光物镜的放大倍数m决定了入射到样品上的灯丝像直径d及入射到样品的半发散角α。当光阑孔径远小于物镜的通光孔径及物镜的焦距远小于显微镜的光学筒长时，它们间的关系可近似地表达为d=φm----(1)]]>tanα=φ2f----(2)]]>根据上述关系，可以选择不同光阑孔径φ，聚光物镜的放大倍数m以及双光阑之间的距离，使得灯丝像小于被测样品的线尺度，以及光束的半发散角α在所要求的范围内。
下面介绍具体的测量方法透过率的测量1)顺序开启各个系统电源。此时光谱仪的入射狭缝要置于关闭状态(开机之前，务必使计算机与光谱仪及锁相放大器通过RS-232接口保持连接状态)。2)用同轴电缆将锁相放大器参考信号输入端口与斩波器的输出信号端口相连，用同轴电缆将锁相放大器信号输入端口与光电倍增管的输出信号端口相连。3)将被测样品装入样品池，并将此样品池放在载物台上，调节载物台的横向位置，使被测样品位于光源系统与成像系统的光轴上。4)调节载物台与成像物镜之间的距离使得样品的下表面成像于倒置显微镜光学筒长的目镜端。然后调节光源系统相对于载物台的纵向距离，使得灯丝成像于被测样品的上表面。光的透射信号由限束光阑出射。限束光阑的孔径要略大于端口处样品像的尺寸。5)打开光谱仪的入射狭缝，并调节聚光透镜L的位置，使得限束光阑的出射光进入光谱仪的入射狭缝。6)启动计算机核心控制软件中的调整光路功能，微调聚光透镜L的三维位置，使得锁相放大器接收到的输入信号最大。7)启动计算机核心控制软件中的扫描功能，此时计算机能自动控制光谱仪光栅的扫描以及接收锁相放大器的输出信号。8)将此输出信号保存到计算机的硬盘上待处理。
反射率的测量将光源系统移至倒置显微镜下端的反射光源端口。调节光源系统的三维位置以及载物台与成像物镜之间的距离，使得灯丝成像于样品的下表面。其它部分的调节与透射率测量的成像部分相同。
本实用新型可将光源限定于比待测样品小的视场范围内，用于测量直径为5μm-300μm的光学样品及生物样品的透射率与反射率。对于要求入射光为垂直表面的平行光或准平行光的微米级样品的透射率与反射率同样可以测试，这在普通光谱仪上很难做到。本实用新型的信号处理系统使用的是锁相放大器，可以测出淹没在噪声中的微弱信号。计算机的实时控制及数据采集处理系统的处理功能包括信号平均，实时显示透射谱和反射谱，去除本底信号，调节光路时透射或反射信号随时间的变化曲线。本实用新型还可对高反射率的样品进行反射谱的测试。
以下结合附图及实施例对本实用新型做进一步说明图1是本实用新型作为微区透射光谱仪时的示意图。
图2是本实用新型作为微区反射光谱仪时的示意图。
图3是单个衣藻细胞的透射率测量图。在测试细胞时，聚光物镜的放大倍数为100，光阑孔径为0.5mm。衣藻细胞为8μm左右，样品放在含有培养液的池中。从其透射谱中可明显观察到在红外680nm处有一吸收峰。
图4是人工蛋白石光子晶体反射率测量图。光子晶体是由不同介电体周期排列的新型光学材料，具有带隙特征。在处于光子带隙波长的光不能透过光子晶体而全被反射回来。其带隙截止峰与入射方向与样品法线的夹角θ的关系2n·d·cosθ＝λ为其中n为平均折射率，d为层间距，λ为带隙的中心波长。在测量时要求入射光线限制在几度范围内。光源信号放于倒置显微镜下端的反射光源端口，被测面积为50μm。物镜的放大率为40，此时样品的入射光束发散角被限制在8°以内。在实际测试时，用上述的测量方法先测出反射谱，存入计算机硬盘，然后将一全反的银镜放在原样品池的位置处，测出本底信号，以此作为背景谱，用软件程序处理，将样品信号除以背景信号，测出反射率曲线。
实施例1按图1制作一台微区透射光谱仪。
开启电源前，将斩波器的斩波片部分插入灯源与双光阑之间。开启设备的电源系统，将斩波器的输出信号接到锁相放大器的参考信号输入端。将待测样品放在由两个盖玻片组成的样品池中，盖玻片之间的间距由被测样品的厚度决定。样品池放在聚光物镜与成像物镜之间的载物台上。调节载物台与成像物镜之间的距离，使得样品的下表面成像清晰。然后调节光源系统相对于载物台的距离，使得光源灯丝成像于被测样品的上表面。去掉倒置显微镜目镜，在物镜的成像处放置限束光阑9，用以限制被测样品成像范围以外的光进入光谱仪。入射光经成像物镜7透射到半反镜8上，该束光经半反镜反射到限束光阑9上。限束光阑9与聚光透镜10之间的距离根据光路调节的需要而定。聚光透镜10将从限束光阑9出射的光聚焦到光栅光谱仪的入射狭缝，光谱仪的波长选择由计算机通过RS-232接口控制。光栅光谱仪的出射狭缝处接光电倍增管12，光电倍增管的灵敏范围200-900nm。将光电倍增管的输出信号接入锁相放大器13的信号输入端。调节锁相放大器的相位按钮，使得锁相放大器输出信号最大。锁相放大器的输出信号经RS-232接口引入计算机。通过计算机的实时控制及数据采集处理系统14控制光谱仪光栅的转动，以及采集锁相放大器的输出信号。
以此透射光谱仪测得的直径8微米的单个衣藻细胞的透射率曲线见图3。
实施例2按图2制作一台微区反射光谱仪。
在制作微区反射光谱仪时，其它部分与实施例1一致，但是需将光源系统(此时需去掉图1中的聚光物镜5)及斩波器移至倒置显微镜另一端的反射光源端口，反射光源由一全反镜15引入倒置显微镜的成像物镜7。此时倒置显微镜的成像物镜同时起着聚光和成像的作用。调节光源系统的三维位置、及载物台与成像物镜之间的距离，使得光源灯丝成像于样品的下表面。在实际测试时，用上述的测量方法先测出反射谱，存入计算机硬盘，然后将一全反的银镜放在原样品池的位置处，镀银面朝向成像物镜的前光瞳，测出此时的本底信号，以此作为背景信号，通过计算机的实时控制及数据采集处理系统，将样品信号除以背景信号，测出反射率曲线。
以该设备测得的直径50微米的人工蛋白石光子晶体反射率曲线见图4。
权利要求1.一种微区反射透射光谱仪，其特征在于主要由光源系统、倒置显微镜系统、成像及聚光系统、光栅光谱仪(11)、锁相放大器(13)及斩波器(2)、计算机实时控制及数据采集处理系统(14)组成；其中光源系统包括光源(1)，双光阑(3)，(4)和聚光物镜(5)，双光阑之间的距离为显微镜光学筒长；倒置显微镜系统主要由载物台(6)，成像物镜(7)，半反射镜(8)及目镜组成；成像及聚光系统包括位于成像处的限束光阑(9)和光栅光谱仪前的聚光透镜(10)；光栅光谱仪(11)为普通商用仪器；其结合调试安装的构造如下在开启电源前，将斩波器(2)的斩波片部分插入光源(1)与双光阑(3)、(4)之间；开启设备的电源系统，将斩波器的输出信号接到锁相放大器(13)的参考信号输入端；将待测样品放在由两个盖玻片组成的样品池中，盖玻片之间的间距由被测样品的厚度决定；样品池放在聚光物镜(5)与成像物镜(7)之间的载物台(6)上；调节载物台与成像物镜之间的距离，使得样品的下表面成像清晰；调节光源系统相对于载物台的距离，使得光源灯丝成像于被测样品的上表面；去掉倒置显微镜目镜；在物镜的成像处放置一限束光阑(9)；入射光经成像物镜(7)透射到半反镜(8)上，该束光经半反镜反射到限束光阑(9)上；限束光阑(9)与聚光透镜(10)之间的距离根据光路调节的需要而定；聚光透镜(10)将从限束光阑(9)出射的光聚焦到光栅光谱仪(11)的入射狭缝，光栅光谱仪的波长选择由与此相连的计算机控制；光栅光谱仪的出射狭缝处接光电倍增管(12)，光电倍增管的灵敏范围为200-900nm；将光电倍增管的输出信号接入锁相放大器(13)的信号输入端；调节锁相放大器的相位按钮，使得锁相放大器输出信号最大锁相放大器的输出信号经RS-232接口引入计算机；通过计算机的实时控制及数据采集处理系统(14)控制光栅光谱仪的光栅转动，以及采集锁相放大器的输出信号。
2.按权利要求1所述的微区反射透射光谱仪，其特征在于还可以作如下改动，便成为一台微区反射光谱仪将光源系统中的聚光物镜(5)去掉，并将光源系统及斩波器(2)移至倒置显微镜另一端的反射光源端口，反射光源由一全反镜(15)引入倒置显微镜的成像物镜(7)；此时倒置显微镜的成像物镜同时起着聚光和成像的作用；调节光源系统的三维位置、及载物台与成像物镜之间的距离，使得光源灯丝成像于样品的下表面。
3.按权利要求1所述的微区反射透射光谱仪，其特征在于可用于测量线尺度为5μm-300μm的光学及生物样品的透射率及反射率。
专利摘要本实用新型属于微区光学测量领域。本实用新型提供的微区反射透射光谱仪可测量线尺度为5μm—300μm的光学及生物样品的透射率及反射率,由光源系统、倒置显微镜系统、成像及聚光系统、光谱仪、光电倍增管及其电源、锁相放大器及斩波器、计算机实时控制及数据采集处理系统等组成。本实用新型因对光源的限制使入射光源的面积小于被测样品,且可使光源的入射角限制在很小范围内。本实用新型还可检测淹没在噪声中的微弱信号。
文档编号G01N21/59GK2482688SQ0122999
公开日2002年3月20日 申请日期2001年7月12日 优先权日2001年7月12日
发明者程丙英, 周博, 郭红莲, 金崇君, 张道中 申请人:中国科学院物理研究所