专利名称：用于核酸分析的容器的制作方法
技术领域：
本发明为采集样本的容器，尤其是血液样本，采集的血液样本在此容器内保持稳定，能够用于分离和分析核酸。
从采集标本时样本内核酸就要保持稳定的状态，要达到这一目的似乎不太可能。从现有的血液采集及贮存的角度来看有以下几点原因细胞内含有的核酸酶(一种生物酶)可在接触底物(如RNA，DNA)的同时马上破坏核酸。细胞在正常人体环境中，细胞内外的核酸酶处于生理调控下。血液的采集过程或多或少会导致细胞内的核酸变化，故核酸酶在细胞内和/或细胞未溶解时，其核酸酶被释放出来。另外，核酸的合成会增多或减少。特别是长时间保存血标本更会导致细胞的老化或破坏。
用常规方法采集的血标本经过长期保存后的另一个问题是样本物质剧烈变化。这些变化包括细胞的溶解可导致分离核酸的标准方法达不到满意的效果，核酸也无法再生。
除开标本内核酸的稳定保存问题外，常规的采血方法还存在其他问题。在核酸分离过程中，常规的抗凝剂分离的纯度不够，故对后续的核酸分析如PCR扩增(多聚酶链反应)造成一定的影响。例如，肝素即是一种普遍了解的PCR的抑制剂。
最后，核酸的容量分析还引发了一个问题，那就是从样本采集到核酸分析这整个过程中如何才能进行标准化控制。最理想的是一种在质量和数量上都已确定的标准化核酸，在采集标本过程中就已被加入样本物质中，所以其存在于从采集到检测样本的整个过程中。而常规采集方法也达不到此目的。
常规采血方法的另一个缺点是有传染样本的危险，而且分离核酸需手工进行。与潜在传染的细菌接触是不可避免的。
以下以现有的例子来讲述一种方法。从病人(EP0818542A1)体内采血后直接将血样本与胍酸盐混合。运用此方法时，胍酸盐本来为粉末状以保持其更高的稳定性。然而，此方法有较大的缺陷。如，胍酸盐必须首先在血标本中进行溶解。此溶解过程受环境特别是温度的影响，不能在用过的非透明样本中进行控制。故用于诊断/医疗目的的相应产品则存在很大的问题。
核酸酶的活性非常高，仅在高度变性状态下才能抑制其活性。其变性依赖于溶解的胍酸盐的浓度。根据在EP0818542中描述的方法，并未在一开始就提供具有抑制浓度的已溶解的胍酸盐。因此，在胍酸盐溶解的过程中核酸的降解无法控制。此外，上述方法中无还原性物质加入，无该物质的加入则有效的抑制，特别是RNA酶，通常无法得到保证。
常规方法采集的样本不能直接用于固相分离核酸。胍酸盐的应用不符合内部核酸标准。而这些标准对控制分析过程和准确的容量来说是必不可少的。
这一发明提供了一种标本接收容器，内装有一种溶液，能使核酸保持稳定，并提供可连接核酸的固相物质。
此发明有以下优点1.样本，特别是血样本，在采集时就已溶解，因为此容器内已盛有相应样本溶解液，同时此溶解液也是核酸稳定剂。2.核酸稳定剂有以下作用样本物质，特别是其内的核酸在接触此溶液后就可稳定保存下来。3.核酸稳定剂是选择性的，用具处理的标本在其下的分离方法中可直接运用。4.核酸稳定剂溶解能在后面分离过程中被有效的除去，故不会对，如PCR等过程产生抑制。5.核酸稳定剂中可加入内标物质，从而可以控制从采集样本到检测核酸的整个过程。6.容器内的固相物质对于连接其上的核酸物质特别适合其后期的分离。而且，核酸结合到固相物质上后易化了后续的分离过程，因为在容器内即已完成分离样本核酸和其他物质的第一步。
核酸稳定剂可有选择性，故在细胞溶解后核酸可直接与相应的层向进行连接，或在添加其他物质后进行连接。前者如预先用胍酸盐提供一层光滑固相层。后者如预先提供一种生物素包被的表面，而后加一种能结合核酸的链霉素。
此容器在外形上类似于常规的采血标本容器(如小试管)，其内盛有一定体积的核酸抑制剂和固相的核酸连接物质。这种小试管内有少量气体，造成低压状态，故其内仅可采集一定量的血样本。用普通的采集方法即能用于此小试管。其内盛有的溶液含有以下物质，故有上述优点。一种胍酸盐，如二巯基；及合适的缓冲系统，如枸橼酸盐，tris，MES或HEPES。含有以上成分的溶液被装入小的真空管中，此溶液能在此管中保存而不会丧失其保持核酸稳定的性能，特别是对于供血者，此系统在采血过程中一般没问题，非常安全。
此溶液中含有胍酸盐，其作用为溶解细胞，并保持核酸稳定，而核酸连接固相物质，缓冲系统，还原剂和去污剂，在贮存中是稳定的，此溶液将新鲜采集的血标本转化成为一种物质，此物质能稳定保存，并且能直接用于其他的分析，如核酸分离。
硫氢酸胍和/或氯化胍是胍酸盐中较为常用的物质。
胍盐的推荐浓度为1-8.0M。
Tris或枸橼酸钠可用于缓冲液系统，其PH值用HCI来调节了。其他可能的缓冲液有HEPES，MOPS，MES，枸橼酸盐和磷酸盐缓冲液，如PBS。
提供核酸结合的物质为固相，最适合的是采用玻璃颗粒，核酸结合多聚物，包被有核酸结合物质的颗粒，或包被氧化硅的颗粒。另外，核酸结合的固相物质的表面可包被特异性结合分子(如链霉素，寡聚核甘酸，核酸肽链(PNAS)等，它们可与核酸分子的标志分子或直接与核酸结合。这类物质的形状与采血系统和后续的分离方法有关。采血后核酸进行额外处理，此后能直接应用的外形尤为合适。适用于常规分离方法的表面也特别合适，如磁珠分选。
合适的固相物质可以购得，如包被氧化硅的磁性颗粒，在血/骨髓标本mRNA分离试剂盒中即含有此颗粒。
缓冲剂的离子浓度为10-300M，最合浓度为10-100M。
去污剂最好选择Triton-X-100，还可选择NP-40，Tween20，Polydocanol或其他去污剂。
去污剂浓度一般为5-30％(w/v)，最好为10-20％(w/v)。
还原剂用DTT较好，然而，亦可应用β-巯基乙醇，TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)或其他还原剂。
还原剂的浓度一般为0.1-10％(w/v)，最好为0.5-2％(w/v)。
溶液的PH值为3.0-9.0，最佳为4.0-7.5。
溶液的PH值要特别选择，故加入样本物质后。调节的PH值为5.0-7.5。由于试管内存在一个低气压环境，故样本采集容器有限，在采集样本前加入一定浓度的缓冲液，并保持一定溶液体积，采集一定体积样本后即可得到相应的PH值环境。采集样本后PH最佳值为6.3-6.9。
溶液内含有4.5M二硫氰酸胍，50mMtris/HCI，15％Triton-X-100，100mMDTT，玻璃珠或包被氧化硅的磁珠作为固相物质，采血后PH值调节为6-7.5，这是最适合的环境。
此容器的另一优点为采学时其内有一低压，在对血管穿刺后，固定体积的血液可被采集入此容器内，血液体积可根据能力进行调节。相应的抽真空容器均能在市面上买到。
此容器装入血标本后能迅速用来作其他的分析，或为保持较长时间(最多为数天或数周)而不会影响标本的质量。
此方法的创新之处在于新鲜采集标本可直接注入上述的血液采集容器的溶液中，所以防止了一切可能造成核酸物质改变的过程。容器内核酸已直接与固相物质连接，或在后续反应步骤中与固相物质结合。
后续核酸分析所证实的核酸数据就真实反映了采集血液时期核酸的量和核酸的种类。
容器内采集的血量最佳为溶液量的0.1-4倍，后者量通常为0.5-5.0ml。因此，加入血液后胍盐的最终浓度为1.0-5.0M，最好为1.0-3.0M。
如果血标本是用于作核酸分析的话，所发明的容器则最宜用于采血。
上述采血系统的溶液部分可保证细胞的迅速溶解和通过抑制样本核酸酶的活性而保持样本的稳定性。用此法采得的血样甚至能在室温下保持数天。此系统在从采血到核酸的分离和分析过程中均能保证无污操作，排除污染样本的可能。对于传统的核酸分离系统，其他的操作步骤(如将血样本转移到核酸分离体系中等)是必要的，这有可能会造成样本污染。
即使保存较长时间，核酸结合到固相上以后仍能非常容易地从标本中分离出来。溶解标本时，由于固相物质的存在可使核酸立即结合到其表面上，这样就能避免由于保存较长时间而形成沉淀造成的损失，并且结合有核酸的固相表面能容易地从此系统中被分离出来。
用此采血系统采集的标本能用常规的方法进行核酸分离。若用的是包被有氧化硅的磁性颗粒，可用现有标准方法分离核酸(磁性分选，洗涤，提纯核酸)。
现有的发明包括样本接收系统，它的构造可使其达到以下目的1.控制采样和自动稳定标本中的核酸(DNA，RNA)。2.采集标本过程中无需应用抗凝剂。3.使核酸与系统中的固相物质结合(直接或在另一步骤后)。4.用此采样系统采集后的标本可完整转入分离核酸系统中进行处理。5.包括采样后的此系统在储存时是稳定的。
此外，用上述的采集系统采集并保存的样本令人惊奇的能保存较长时间而保证核酸无降解。
图2凝胶分析(1％琼脂糖)28S和18SrRNA在样本采集系统中保存不同的时间后的图形示例。栏1采样后立即分离纯化RNA(无贮存期)。栏2在-20℃保存一个月后。栏3在4℃保存6天后。其RNA的量为采血量120μl获得的量。
图3在采样系统中保存不同时期后的DNA用凝胶(1％琼脂糖)分析的图示。栏1采样后立即分离(无贮存期)。栏2在-20℃保存一个月后。栏3在4℃保存6天后。DNA的量为采集量10μl获得的量。
图4分离出的MS2-RNA在与血清/稳定剂(含或不含DTT)，在40℃下，孵育180分钟后，对其进行凝胶分析的图示。栏1阳性对照MS-2RNA；栏2DNAmarker；栏3-栏5与含有DTT的稳定剂(3倍浓度)孵育后MS-2RNA；栏6-栏8与不含DTT的稳定剂孵育后的MS-2RNA(3倍浓度)。
图5MS2-RNA分离出后，与血清/稳定剂在40℃下孵育3天后用凝胶分析的图示。加入血清后(RNA即在其中孵育)稳定剂中二硫氰酸盐含量(GTC含量)在相应的栏中的标本。栏12.70M GTC，栏22.5M GTC，栏32.36M GTC，栏42.2M GTC，栏52.08M GTC，栏61.94M GTC，栏71.80M GTC，栏81.66M GTC。
图6MS2-RNA在分离后，与血清/稳定剂在40℃下孵育1-8天后，经PCR扩增后的产物的凝胶分析图示。栏11天后分离的RNA扩增产物，栏28天后分离出的RNA的扩增产物，栏3DNA marker，栏4MS2-RNA阳性，对照0.8μg溶于10μl RT(1∶50倍稀释)，取1μl进行扩增。
图7在血清/稳定剂中在常温下保存6天(栏2-12)和13天(栏14-19)后分离MS2-RNA进行凝胶分析的图示。在混合血清和稳定剂后其PH值在每栏中均有标记。栏1，13，20DNAmarker，栏2PH8.0，栏3PH7.7，栏4PH7.5，栏5PH7.35，栏6PH7.18，栏7，14PH7.07，栏8，15PH6.94，栏9，16PH6.8，栏10，17PH6.72，栏11，18PH6.68，栏12，19PH6.7。栏12，19中的稳定剂中的RNA与栏11中的RNA有相同的PH值，然而，前者的GTC含量为5M，后者为4M。
图8标准凝胶分析(1％琼脂糖)证实RNA和DNA存在的图示。栏1分子量标记，栏2-4分离后的核酸，栏2含MS2 RNA(7天)的全血lysate中分离的核酸，栏3含MS2RNA(0天，对照)的全血lysate中分离的核酸，栏4全血lysate的核酸(7天)，栏5全血lysate(0天，对照)的核酸。上层带显示DNA(在4个标本中均容易辨别)，栏2，3中低位条件显示为添加的和分离后的MS2RNA。
下面的例子将解释本发明例1.
血液采集系统要有以上的优点，血液采集系统应由以下组成一根盛有体积固定的核酸稳定液的小试管，其内还有核酸连接固相物质和一定体积的真空，并用隔膜封口。构建此隔膜应与目前的样本采集试剂盒相容(cannula等)。用已有的例示预先备好2.2ml试剂，调整真空体积使得采集样本的过程中恰好流入2.2ml血液，血液流入试管后其中的核酸立即转化为稳定的形式。
对以下示例给予评估如果没有特别提到，在所有示例中核酸稳定物质(N-sS)由以下物质组成45mMtris，5M二硫氰酸胍，0.8％(w/v)dithriothreitol，18％(w/v)Triton-X-100，PH6.0。
在所有提到的示例中，核酸固定物质与样本以1∶1的比例混合(1体积N-sS加1体积样本物质)在所有示例的采集过程中，通过直接采集血液注入小试管中而使其保持稳定。
例2.
样本与N-sS混合后核酸的稳定性用二氧化硅衍生颗粒从样本裂解物中分离DNA和RNA。
材料和方法样本物质采集后，在4℃下储存6天，-20℃下储存1月，然后进行DNA和RNA的分离。可用高纯度RNA分离试剂盒(Boehringer Mannheim，Cat-No1808665)来进行RNA的分离。内说明书所述的步骤的修改如下2.4毫升样本裂解物加入4个等量的600ul的柱上，这样2.4ml样本裂解物都得到运用，RNA最后用100ul洗脱缓冲液进行洗脱。
用QiaAmp Blood试剂盒(Qiagen-Cat-No29104)来分离DNA(图示3)，在说明书所述的标准步骤在不同点进行修改400ul样本直接上柱，未予使用试剂盒中的结合剂，加入25ul蛋白酶K消化液，室温下孵育10分钟，然后将柱子转入收集皿中，按说明书进行离心。除开乙醇的使用外，所有其它的步骤均按说明书上所述进行，洗脱液的体积为200ul。
例3.
用于RNA的长时间稳定的稳定剂中的还原剂(例如DTT)的重要性材料和方法可用的稳定溶液4.0MGTC；13.5％Triton-X-100，45mMtris/HCl，120mMDTT(亦可不加)，700ul血清与700ul稳定液混合，孵育2分钟后加入MS2-RNA(0.8ug/ul，从RocheDiagnostics购得)，在40℃孵育180分钟，然后根据实验1将其分成400ul一等分与高纯度RNA试剂盒(Roche)反应，将样本以50ul洗脱液洗脱，冷冻于-20℃，经琼脂糖凝胶分析证明有效。
结论在稳定剂中不加入还原剂不能获得RNA长时间的稳定。
例4.
在血清/稳定剂中MS2-RNA的稳定对GTC浓度的依赖材料和方法可用的稳定液3-5MGTC；13.5mM Triton-X-100，50mMDTT，42mMtris/HCl；溶液的PH值大约4.0；加入血清后的溶液PH值大约为6.7。
2ml血清与2ml稳定液混合，孵育2-5分钟，加入90ulMS2-RNA(0.8ug/ul，Roche)并在40℃孵育。根据实验1按常规间歇采集400ul样本，应用高纯度RNA试剂盒(Roche)，按样本50ul洗脱液洗脱后冷冻于-20℃，取20ul洗脱液加入1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析RNA完整性，通过腺病毒逆转录和PCR分析证明有效。通过腺病毒逆转录(Roche)对10ul的洗脱液进行逆转录，然后在子循环上通过量化PCR进行分析。
逆转录混合液4.0ul腺病毒逆转录缓冲液2.0ul dNTP’s(终浓度10mM)0.5ul RNA酶抑制剂(Roche，20单位)1.0ul 引物2827(终浓度1uM)1.9ul DMPC水0.6ul 逆转录腺病毒(Roche，15单位)10ul 模板RNA20ul在子循环机上运行PCR程序，其退火温度为61℃，采用SYBR-Green作为检测系统。所有在20个循环后的样本为阴性，因为所有检测到的信息均是由于引物二聚体产生的。此结论可被子循环机上的溶解曲线证实。逆转录产物以1∶50的双蒸水稀释，取1ul进行PCR操作，体系为10ul，如下PCR体系1.6ul MgCl2(储存浓度为25mM)5.9ul DMPC水0.25ul 引物2827(储存浓度20mM)0.25ul 引物2335(储存浓度20mM)1.0ul SYBR-Green-Mastermix(Roche)1.0ul 逆转录混合物10ulPCR扩增产物完全用2％琼脂糖凝胶进行分析(见图示6)结论图示5示40℃孵育30天后琼脂糖凝胶能检测到的纯化的MS2-RNA，所有的RNA样本在40℃经过8天后，仍可被扩增和检测到产物，但与GTC反应的RNA完整性在三天后就有明显的差异。相应的血清/温度剂中盐的浓度小于2M对RNA的完整性有帮助。
MS2-RNA在血清中加入RNA酶后2分钟可被完全降解，不能被检测出，此资料未提供。而加入稳定剂后RNA的降解可被明显延迟也证实了这一点。40℃下8天后，保存在血清/稳定剂中的MS2-RNA仍能用PCR检测出。(图示6)例5血清稳定剂中MS2-RNA的稳定性，决定于含稳定剂的样品的PH值。
材料和方法所用的试剂4M(5M)GTC14.4％ Triton-x-10050mM DTT45mM trisHcl加入血清后PH值在6.7-8.0之间2.0ml血清于2.5ml稳定剂混匀，加入90ulMS2RNA(0.8ug/ml，Roche)后样品在室温下孵育。500ul样品中的RNA用Rocheviral RNAkit提取50ul洗脱液洗脱(按例4进行)。20ul洗脱液用琼脂糖凝胶检测(见图7)结论血清稳定剂的PH值和稳定剂的缓冲范围决定了RNA的稳定性，当PH为8.0时，2天后完整RNA不能检测到，而PH6.6至7.0时，室温下孵育13天仍可检测到完整的RNA。
除了PH值，GTC的最佳浓度也很重要(见例4)。GTC的终浓度为2.2M时比2.8M时更能使RNA长期保持稳定。
例6通过应用包被了二氧化硅的磁性颗粒可显示稳定剂中核酸连接表面的稳定性。
材料和方法4.5M GTC所用溶液 15％ Triton-X-100
100mM DTT50mM MES血/骨髓的mRNA分离试剂盒中取出以二氧化硅包被的磁性颗粒，颗粒的量约为35mg/ml。血液采集系统包括小采样管，内装有已在室温下保存14天的稳定剂和磁性颗粒。
然后，用上述系统采集全血，另外用一个新鲜制成的采样系统(小试管，稳定剂，磁性颗粒)用来做对照。样本内核酸分离在上述两种系统中均可行。用磁场将磁性颗粒分离出后去除余下物质，然后将磁性颗粒重新悬浮于50％的乙醇，10mMTris，PH7.0，以同种液体洗涤数次后，最后将磁性颗粒在10mM Tris/HCl(PH7.0)中加热至70℃，此时核酸可从磁性颗粒上分离下来。将颗粒从磁场中分离出来，而其余含有核酸的物质用标准琼脂糖凝胶进行分析，结论
表1在保存14天后，固相物质的核酸连接能力未受损，样本以及对照显示了相同的核酸结合能力。
例7DNA和RNA在与包被有二氧化硅的磁性颗粒连接后7天，其稳定性以及可分离纯化的证据。
材料和方法4.5M GTC15％ Triton-X-100所用体系100mM DTT50mM MES35mg/ml 颗粒共有4种血液采集系统(小试管)均含有1ml上述液体，均与1ml全血混合。其中2小管加有25ugMS2-RNA(全血裂解物)，均在分离核酸后立即加入(例6示)另外2管则先在室温下储存7天后在提取核酸。洗脱后的体积为200ul/200ul全血。用标准琼脂糖凝胶进行核酸分析。
结论染色体DNA和MS2RNA的稳定性在样本采集系统(溶液，固相物质)保存7天后仍被证实(图8)
权利要求
1.一种用于接受标本的容器，内装有核酸稳定剂和能连接核酸的固相物质。
2.根据权利要求1所述的容器，其特征在于核酸稳定剂为水溶液，含有以下物质--胍盐--缓冲物质--还原物和/或--去污剂
3.根据权利要求2所述的容器，其特征在于胍盐可为二硫氰酸胍或氯化胍。
4.根据权利要求2或3所述的容器，其特征在于胍盐的浓度可为1-8M。
5.根据权利要求2-4之一所述的容器， 其特征在于在加入样本后，溶液的PH值为4-7.5，缓冲物质可为tris，HEPES，MOBS，MES，枸橼酸钠和磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1-5之一所述的容器，其特征在于固相物质分别可为羊毛状物，滤器，颗粒，胶，小球，栓子，和/或小棒，而且可直接与容器连接。
7.根据权利要求2-6之一所述的容器，其特征在于缓冲物质的浓度为10-300mM。
8.根据权利要求2-7之一所述的容器，其特征在于去污剂可为Triton-X-100，NP-40，Polydocanal和Tween20。
9.根据权利要求2-8之一所述的容器，其特征在于去污剂浓度为5-30％质量体积百分比浓度。
10.根据权利要求2-9所述的容器，其特征在于还原剂可为dithiothreitol，2-巯基乙醇和TECP。
11.根据权利要求2-10之一所述的容器，其特征在于还原剂的浓度为0.1-10.0％质量体积百分比浓度。
12.根据权利要求2-11之一所述的容器，其特征在于溶液的PH值为4.0-7.5。
13.根据权利要求2-12之一所述之容器， 其特征在于溶液含有以下成分-4.5M二硫氰酸胍-50mMMES-15％(w/v)Triton-X-100-100mMDTT在加入血标本后PH值为6.0-7.5。
14.根据权利要求2-13之一所述的容器，其特征在于其内存在一利于接受标本的低压环境，特别是血标本。
15.根据权利要求2-14之一所述的容器，其特征在于其内可采集全血标本。
16.一种采血的方法，含有直接将全血注入根据权利要求1-14之一所述的容器内这一步骤。
17.根据权利要求16所述的采血方法，其特征在于采血量是容器内溶液体积的0.1-4.0倍。
18.根据权利要求17所述的采血方法，其特征在于在采血加入容器后其胍盐的终浓度为1.0-5.0M。
19.一种从全血标本中稳定和/或分离核酸的方法，含有将全血直接导入根据权利要求1-14之一所述的容器内这一步骤，而且如果需要的话，还可分离与固相物质连接的核酸。
20.根据权利要求16-19之一所述的方法，其特征在于加入样品后PH值在4.5-7.5之间。
21.用于采集全血，特别是人类的全血的，根据权利要求1-14之一所述的容器的用途。
22.在标本容器内，特别是在采血容器内含有胍盐，缓冲物质，去污剂和/或还原剂，以及核酸连接固相物质的溶液的用途。
23.在标本容器内，特别是在采血容器内的核酸连接固相物质的用途。
24.在标本容器内，特别是在采血容器内的权利要求22所述的溶液和权利要求23所述的固相物质的用途。
全文摘要
此发明与采样容器有关，此容器内装有核酸稳定溶液和核酸连接固相物质。此容器特别适用于采集血样后进行核酸分析。
文档编号G01N33/48GK1434746SQ01805250
公开日2003年8月6日 申请日期2001年2月15日 优先权日2000年2月15日
发明者艾尔克·黑尔弗滕本 申请人:抗原生物技术股份有限公司