专利名称：一种利用酶－比色法测定乳粉中l－肉碱含量的方法
技术领域：
本发明涉及到一种利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法，属于食品比色分析技术领域。
本发明的技术方案是这样实现的这种利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法，包括测定游离肉碱和总肉碱，其基本方法包括(1)、样品处理，所述的样品处理(1)是溶解乳粉后用高氯酸溶液沉淀乳脂肪和沉淀乳蛋白，加水定容，过滤收集滤液用于制备样品溶液；
(2)、样品溶液和标准溶液制备，所述样品和标准溶液的制备包括(2)-1、测定游离肉碱的样品用KOH调节pH值5-6，定容，过滤；(2)-2、测定总肉碱的样品用KOH调节pH值至12，加热水解酯化肉碱，冷却，用高氯酸调节pH值5-6，定容；(2)-3、所述标准溶液是冷冻贮存的L-肉碱HCL溶液，根据样品含量稀释定量的工作溶液；(3)、测定试剂包括DTNB试剂、乙酰辅酶A溶液、肉碱乙酰转移酶溶液、DTNB工作溶液；(4)、比色测定，所述的比色测定包括分别取样品溶液(2)-1、(2)-2、标准溶液(2)-3，分别加入DTNB工作溶液，在412nm读出A1；再分别加入肉碱乙酰转移酶溶液，进行酶反应20min，在412nm读出A2，计算结果。
所述的利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法中所述的样品处理(1)是在5.0-10.0g样品水溶液中加入0.1-0.2M的高氯酸40ml混合，静置60min，加水定容，过滤，弃去初滤液，取定量的滤液用于制备样品溶液。
所述的利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法所述的测定试剂配制(3)包括(3)-1、所述的DTNB试剂是30.0mg DTNB、9.0g Tris、9.2g EDTA-Na，加水定容500ml，分为6ml一份，pH值7.5；(3)-2、所述的乙酰辅酶A溶液是8.3mg乙酰辅酶A溶解于25ml水中，分为3ml一份，冷冻贮存；(3)-3、所述的肉碱乙酰转移酶溶液是100μL酶溶液加水1.0ml；(3)-4、所述DTNB工作溶液是一份冷冻的乙酰辅酶A加入一份DTNB经缓化混合。
所述的利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法所述的比色测定包括(4)-1、分别取样品溶液(2)-1、(2)-2、标准溶液(2)-3各100μl，空白试剂水100μl于比色管中，用250μl水稀释，用于平行样测定；(4)-2、分别加入DTNB工作溶液800μl，在412nm读出A1；(4)-3、再分别加入肉碱乙酰转移酶溶液25μl，进行酶反应20min，在412nm读出A2，(4)-4、结果计算L-肉碱＝A2-A1本发明的技术进步效果表现在排除乳粉中蛋白和脂肪的干扰利用相对比较简单的比色法直接测定乳粉中L-肉碱含量，其检测成本较高压液相色谱大大降低，检测程序简单方便，检测结果准确可靠。有利于企业在线控制产品质量或技术监督部门抽检。
1、样品处理1-1、精确称取乳粉或配方乳粉样品5.0-10.0g(根据样品中L-肉碱的含量确定)于100ml容量瓶，溶于40ml水中，1-2、加入0.1-0.2M高氯酸溶液40ml，混合，静置60min，沉淀乳脂肪和沉淀乳蛋白；1-3、加水定容100ml，过滤(初滤液弃去)；1-4、取2份25ml滤液于烧杯中用于制备样品溶液。
2、样品溶液和标准溶液的制备2-1、测定游离肉碱的样品制备用1.0M的KOH调节pH值5-6，需要不断搅拌避免水解反应；转移至50ml容量瓶定容，用0.45μm膜过滤。
2-2测定总肉碱的样品制备用1.0M的KOH调节pH值至12，样品出现浑浊；将烧杯置于40℃加热60min，溶液颜色变黄；室温冷却，用高氯酸调节pH值5-6；转移至50ml容量瓶定容。
2-3标准溶液和工作溶液的制备肉碱标准溶液取14.7mgL-肉碱HCL溶解在100ml水中，分为1ml一份，冷冻贮存不超过6个月；肉碱工作溶液将上述标准溶液缓化，(根据样品含量稀释定量)取0.5ml，并用4.5ml水稀释，制备成浓度为45.0和22.5μmol/l的工作溶液，用后弃去；3、试剂配制3-1、DTNB试剂30.0mg DTNB(5，5‘dithiobis-2-nitrobenzoicacid)、9.0g Tris、9.2g EDTA-Na，溶解在400ml水中，用HCL调节pH值7.5加水定容500ml，分为6ml一份；3-2、乙酰辅酶A溶液8.3mg乙酰辅酶A溶解于25.0ml水中，分为3ml一份，冷冻贮存，可达3个月；3-3、肉碱乙酰转移酶(CAT)溶液100μl酶溶液(5mg蛋白/ml，80M/mg)加水1.0ml，现用现配；3-4、DTNB工作溶液一份冷冻的乙酰辅酶A加入一份DTNB试剂经缓化混合，使用后弃去。
4、比色测定(测定游离肉碱和总肉碱方法相同)4-1、分别取测定游离肉碱和总肉碱的样品溶液(2)-1、(2)-2、标准溶液(2)-3各100μl，空白试剂水100μl于比色管中，用250μL水稀释，用于平行样测定；
4-2、分别加入DTNB工作溶液800μl，在412nm用1cm比色皿读出A1；4-3、再分别加入肉碱乙酰转移酶溶液25μl，进行酶反应20min，在412nm读出A2，4-4、结果计算L-肉碱＝A2-A1用μmol/l或mg/100g样品表示结果。
计算公式mg/100g＝M×161.2×0.01×N/(m×V)公式中M-为标准曲线上的读数(μmol/l)；N-为样品溶液定容的体积(ml)；m-为样品量(g)；V-为吸取滤液的体积(ml)；161.2-为肉碱的分子量；0.01-单位转换系数。
L-肉碱测定的原理
2.
权利要求
1.一种利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法，包括测定游离肉碱和总肉碱，其基本方法特征包括(1)、样品处理，所述的样品处理(1)是溶解乳粉后用高氯酸溶液沉淀乳脂肪和沉淀乳蛋白，加水定容，过滤收集滤液用于制备样品溶液；(2)、样品溶液和标准溶液制备，所述样品和标准溶液的制备包括(2)-1、测定游离肉碱的样品用KOH调节pH值5-6，定容，过滤；(2)-2、测定总肉碱的样品用KOH调节pH值至12，加热水解酯化肉碱，冷却用高氯酸调节pH值5-6，定容；(2)-3、所述标准溶液是冷冻贮存的L-肉碱HCL溶液，根据样品含量稀释定量的工作溶液；(3)、测定试剂包括DTNB试剂、乙酰辅酶A溶液、肉碱乙酰转移酶溶液、DTNB工作溶液；(4)、比色测定，所述的比色测定包括分别取样品溶液(2)-1、(2)-2、标准溶液(2)-3，分别加入DTNB工作溶液，在412nm读出A1；再分别加入乙酰辅酶A溶液，进行酶反应20min，在412nm读出A2，计算结果。
2.根据权利要求1所述的利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法，其特征在于所述的样品处理(1)是在5.0-10.0g样品水溶液中加入0.1-0.2M的高氯酸40ml混合，静置60min，加水定容，过滤，弃去初滤液，取定量的滤液用于制备样品溶液。
3.根据权利要求1所述的利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法，其特征在于所述的测定试剂配制(3)包括(3)-1、所述的DTNB试剂是30.0mg DTNB、9.0g Tris、9.2g EDTA-Na，加水定容500ml，分为6ml一份，pH值7.5；(3)-2、所述的乙酰辅酶A溶液是8.3mg乙酰辅酶A溶解于25ml水中，分为3ml一份，冷冻贮存；(3)-3、所述的肉碱乙酰转移酶溶液是100μL酶溶液加水1.0ml；(3)-4、所述DTNB工作溶液是一份冷冻的乙酰辅酶A加入一份DTNB经缓化混合。
4.根据权利要求1所述的利用酶—比色法测定乳粉中L-肉碱含量的方法，其特征在于所述的比色测定包括(4)-1、分别取样品溶液(2)-1、(2)-2、标准溶液(2)-3各100μl，空白试剂水100μl于比色管中，用250μL水稀释，用于平行样测定；(4)-2、分别加入DTNB工作溶液800μl，在412nm读出A1；(4)-3、再分别加入肉碱乙酰转移酶溶液25μl，进行酶反应20min，在412nm读出A2，(4)-4、结果计算L-肉碱＝A2-A全文摘要
本发明提供一种利用酶－比色法测定乳粉中L－肉碱含量的方法。这种利用酶－比色法测定乳粉中L－肉碱含量的方法,包括测定游离肉碱和总肉碱,其基本方法包括:(1)、样品处理,所述的样品处理(1)是溶解乳粉后用高氯酸溶液沉淀乳脂肪和沉淀乳蛋白,加水定容,过滤收集滤液用于制备样品溶液;(2).样品溶液和标准溶液制备,(3).测定试剂包括DTNB试剂、乙酰辅酶A溶液、肉碱乙酰转移酶溶液、DTNB工作溶液;(4).比色测定,本发明的技术进步效果表现在排除乳粉中蛋白和脂肪的干扰利用相对比较简单的比色法直接测定乳粉中L－肉碱含量,其检测成本较高压液相色谱大大降低,检测程序简单方便,检测结果准确可靠。有利于企业在线控制产品质量或技术监督部门抽检。
文档编号G01N21/25GK1362620SQ0210058
公开日2002年8月7日 申请日期2002年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者生庆海, 田文华, 王玉良, 朱俊平, 杜宝亭 申请人:石家庄三鹿集团股份有限公司