专利名称：一种利用沙眼衣原体单克隆抗体来检测沙眼衣原体的方法
技术领域：
本发明涉及利用沙眼衣原体(CT)单克隆抗体制备的ELISA检测试剂和胶体金检测试剂，以及涉及利用沙眼衣原体单克隆抗体来检测沙眼衣原体的方法。
背景技术：
沙眼衣原体是人类眼部和生殖道感染的主要致病体。沙眼衣原体包括18个血清型，其中A、B、Ba、C四型可引起沙眼，是发展中国家的主要致盲原因，其中D-K型是西方世界生殖道感染最常见的病因。沙眼衣原体不仅与男性尿道炎、前列腺炎、附睾炎等有一定的关系，亦可引起女性子宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎等，从而导致不孕，异位妊娠及流产。因其普遍的流行性及高度的危害性引起了医疗界广大同仁的注意。自1982年stephens首次成功地制备抗沙眼衣原体的单克隆抗体以来，单克隆抗体成为研究沙眼衣原体不可缺少的试验材料，广泛应用于临床诊断、流行病学分型，以及沙眼衣原体诸膜抗原结构分析，致病机理探讨等方面，并且取得了许多重大进展。
目前，国内对沙眼衣原体的感染的实验室诊断以直接免疫荧光法和聚合酶链式反应(PCR)为主，且多为进口试剂，这两种方法本身的局限性限制了其在广大基层医院及防病部门的应用，使其难以成为一种临床常规检查项目及日常体检项目。酶免疫检测法以其快速、简单、经济、敏感、特异以及可同时检测大量标本而深受广大基层医院和卫生防病部门的欢迎及认可，本发明建立的双抗夹心酶联免疫吸附试验方法和胶体金检测方法将会满足这一需求。发明内容本发明的目的是提供利用沙眼衣原体(CT)单克隆抗体的ELISA检测试剂和胶体金探针检测试剂，以及涉及利用沙眼衣原体单克隆抗体来检测沙眼衣原体的方法。
本发明的实验原理是将抗原或抗体接种细胞后(培养)，当细胞内有包涵体时，采用泛影葡胺密度梯度离心法纯化，纯化后注射免疫动物，然后取动物脾细胞及骨髓细胞融合进行筛选鉴定(用ELISA法)。
在固相载体上，酶标记抗原与相对应的抗原或抗体形成酶标记的Ag-Ab免疫复合物，在底物参与下，复合物上的酶催化剂底物使其水解或还原成另一种有色物质。由于在一定的条件下，酶的降解底物和呈现色泽是成正比的。因此，可以用酶标仪进行测定，从而计算出参与反应的Ag或Ab的含量。
或者将特异性抗原(或抗体)先固定于硝酸纤维素膜的一区带，将金标记物吸附在结合垫上。当待测样品(尿液或血清)加入到样品膜上之后中，由于微孔滤膜的毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原(或抗体)的区域时，样品中相应在抗体(或抗原)即与抗原(或抗体)发生特异性结合，由于免疫胶体金可使该区域显示一定颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
根据本发明的一个方面，提供了沙眼衣原体单克隆抗体细胞株的制备方法，包括A、制备沙眼衣原体抗原；B、纯化抗原；C、用纯化抗原致敏小鼠；D、将致敏小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
根据本发明的另一方面，提供了沙眼衣原体单克隆抗体，包括从上述杂交瘤细胞培养液中分离纯化单克隆抗体。
根据本发明的还一个方面，提供了利用上述沙眼衣原体单克隆抗体的ELISA法检测沙眼衣原体的检测试剂及方法。
根据本发明的还一个方面，提供了利用上述沙眼衣原体单克隆抗体的胶体金免疫纸层析检测法检测沙眼衣原体的检测试剂及方法。
实验1一、材料1、CT标准抗原购置于中国医学科学院病毒研究所。
2、骨髓瘤细胞、HeIa-229及Mccoy购置于中国医学院病毒研究所。
3、RPMI-1640培养液、HAT培养液及HT培养液、聚乙二醇(PEG)溶液、GKN溶液，东丽区卫生防病站微生物室自制。
4、4-8周龄及8-12周龄的BALB/C小鼠，购置于中国医学科学院血液病研究所。
5、标本来源a天津市传染病医院性病专科门诊b天津市长征医院中西医结合皮肤病研究所c天津市民族医院性病专科门诊6、固相载体天津市有机玻璃厂生产聚苯乙烯板。
7、试剂包被液、洗涤液、保温液、TMB底物液、终止液均为本课题组自制。
8、酶标仪荷兰产Wellscan-MK-3型。
二、方法1、抗原制备。
a沙眼衣原体A型b培养细胞Hela-229细胞和Mccoy细胞c培养基RPMI-1640培养基2、抗原的纯化沙眼衣原体接种细胞后，48小时用倒置显微镜观察50-90％的细胞内有包涵体时，可收获细胞，采用泛影葡胺密度梯度离心法进行纯化。纯化的沙眼衣原体初体(EBS)悬浮于PBA溶液中，液氮缸中保存备用。
3、免疫动物选健康的4-8周的BAIB/C雄鼠，约重20g，第一次将纯化的EBS105-109倍稀释后，经腹腔和四肢腋下淋巴结分五点注射，总量共计1ml。间隔两周后分两组，其中一组取同样的抗原量，同部位加强免疫，一周后解剖小鼠取脾脏切碎进行细胞融合。另一组加强免疫，一周后经小鼠尾静脉注射同样抗原量，免疫3天后进行脾融合。第一组抗原免疫加完全佐剂，第二组抗原免疫加不完全佐剂。
4、骨髓瘤细胞株及细胞融合选用NS-1株骨髓瘤细胞(一)细胞悬液的制备a.骨髓瘤细胞悬液在杂交细胞融合前的48小时，用含20％小牛血清1640培养液，供融合的骨髓瘤细胞作增殖培养。融合前1天，再以同样培养液将骨髓瘤细胞换液一次，使细胞浓度于融合当日达到对数生长期时的105细胞/ml。
b.免疫小鼠脾细胞，取8-12周龄，与骨髓瘤细胞同系小鼠，于初次免疫后3天挖去眼球放血，再拉颈处死。留血清样品检测检测抗体用。用75％乙醇将小鼠浸没消毒，立即放超净台内，用消毒剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏。用pH值7.0-7.2无血清1640培养液将脾脏冲洗。立刻用镊子将脾脏放在消毒铜网上，置于玻璃培养皿内。然后倒入少量1640培养液，用5ml针筒芯子研磨脾脏使成浆状。将此浆吸入尖底刻度离心管内，于冰浴中静置5-10分钟，待大块脾组织沉到底部，轻轻吸取上层脾细胞悬液，移入另一支刻度离心管内，悬浮于30ml 1640培养液中。轻轻混匀，吸出少量悬液，进行细胞计数及活力检查，活细胞不应低于90％。1000r/min离心10分钟，倒去上清液。将底层脾细胞再悬浮于少量无血清1640培养液中。
c.小鼠腹腔巨噬细胞取12周龄与骨髓瘤同系小鼠。按照常规方法进行，细胞于1000r/min离心10min，弃上清液，加入含20％小牛血清1640培养液中。培养24小时后，用倒置显微镜观察，巨噬细胞体饱满，折光强，大部分细胞变成棱状。
(二)细胞融合融合过程均在37℃水浴中进行(无菌环境)。将上述已制备的脾细胞和瘤细胞按4∶1混合于刻度离心管中。经1000r/min离心10min，倒尽上清液，用力振动试管，将细胞打散混匀，然后把试管直立于操作环境中，用1min的时间，加入0.5ml 50％PEG。边加边摇动，加完后静置90s再用无血清1640培养液中止反应。前30s内加完3ml培养液，后30s加入3ml培养液，全过程在2min内加完15ml培养液。注意在加入培养液时不要多摇动，以免影响细胞融合率。补充培养液至30-40ml，1000r/min离心沉淀10min。轻轻倒去上清液，把沉淀细胞配于含20％小牛血清PH为7.2HAT1640培养液中，逐孔加入有巨噬细胞饲养层的培养板内，每孔0.1ml约5万个细胞，将培养板置于37℃ CO2培养箱中培养。
取少量细胞融合悬液于显微镜下观察其脾细胞与脾细胞的融合体，瘤细胞与瘤细胞的融合体以及脾细胞与瘤细胞的融合体。
5.筛选鉴定纯化的EBS包被微孔板，37℃ 1小时或4℃过液，弃去抗原液，加入阻断液37℃ 1-3小时，弃阻断液，加入杂交瘤细胞培养上清液，37℃ 1小时洗涤后加入过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白，然后加入底物进行测定。
6、按常规方法从单克隆抗体细胞株的培养液上清中分离纯化的单克隆抗体制备ELISA诊断试剂盒。
7、制备胶体金试剂盒(1)胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法等制备胶体金。
(2)抗体的制备、纯化采用反相吸附、亲和层析等方法制备、纯化抗体，并检验是否有交叉反应，如有交叉反应，则采用吸附法除掉交叉抗体。
(3)胶体金探针的制备采用目测法选择抗体最小稳定量，采用低温高速离心法纯化胶体金探针，采用免疫渗滤等方法对其活性进行检测。
(4)纸层析条的处理和组装采用BSA等对硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜等预处理，在处理好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜上分别点加胶体金探针、一抗、阳性对照(二抗或SPA)，然后组装成纸层析条。并筛选点样时胶体金探针、一抗、二抗或SPA等的最佳浓度。
实验2-18同实验1，只是用B、Ba、C，D-K型代替A型沙眼衣原体作为抗原免疫小鼠，获得了ELISA检测试剂和胶体金检测试剂。
实验19 临床应用(即实验观察)标本采集a.男性标本采集方法将龟头外部用生理盐水冲洗，然后用塑料棉试子插入尿道2～4cm，轻轻转动擦取。b.女性标本采集方法将外阴部用生理盐水冲洗，然后借助扩阴器用无菌塑料棉拭子探入宫颈1～2cm取样，即放入含PBS的无菌试管及时送检。
B.样本的测定应用ELISA法、DFA、PCR反应三种方法检测非淋菌性尿道炎标本300份，结果均检出阳性标本28份。符合率100％。
结论1、通过实验观察，本发明的酶联免疫吸附法较常规培养法、荧光免疫法及PCR方法检测CT具有标本处理简便，实验程序简捷，成本低，检出率高，敏感性强的特点，方法比较见表1。
表1
根据在实验中发现的问题，做了如下改进(1)一般情况下，包被抗体浓度范围0.1-30ug/ml，而在实验中实际使用浓度为20ug/ml。我们在实际工作中发现，蛋白浓度高吸附量却不能继续增加，有时反而下降。蛋白浓度过低，固相载体表面可能残留未吸附蛋白质的活性部位，就会吸附下一步加入的试剂(如抗体)。从而出现非特异性吸附造成的实验误差。
(2)试验过程中，如孵育洗涤后再加含0.5％BSA缓冲液浸泡半小时，以封闭载体表面残留的活性部位，这样则大大降低了非特异性吸附所造成的实验误差。
抗原及酶稀释液进行了多种比较，寻找一种理想的液体。
实验过程中在标本及结合物的稀释剂内加入4％聚乙二醇(PEG-6000)。它能够对抗原抗体反应有增强作用，能够帮助可溶性抗原抗体复合物形成沉淀。
在稀释酶标记过程中所使用的溶液极易失活，故应在12小时内使用完毕。
3、我们建立的ELISA双夹心法在检测速度、试验成本和试验条件方面优于传统的常规培养法、免疫法荧光(DFA)、PCR方法。经研究证明，ELISA夹心法用于CT患者的诊断是可行的。由于本方法研究证明，ELISA夹心法用于CT患者的诊断是可行的。由于本方法明显降低了试验成本，缩短了时间，因此便于基层实验室的推广应用。
酶联免疫吸附实验检测沙眼衣原体较PCR反应方法及荧光免疫法操作简便、经济、省时、特异性高、灵敏度好，无需特殊条件、设备和仪器。
权利要求
1.沙眼衣原体单克隆抗体细胞株的制备方法，包括A、制备沙眼衣原体抗原；B、纯化抗原；C、用纯化抗原致敏小鼠；D、将致敏小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
2.沙眼衣原体单克隆抗体，包括从权利要求1的杂交瘤细胞培养液中分离纯化单克隆抗体。
3.一种ELISA检测试剂，特征在于用权利要求2的单克隆抗体纯化后，选用最佳浓度包被酶标板，加入CT抗原，用酶标记PcAb，制备成ELISA检测试剂。
4.一种胶体金检测试剂，特征在于包括以下步骤(1)胶体金的制备例如采用柠檬酸三钠还原法等制备胶体金；(2)抗体的制备、纯化采用反相吸附、亲和层析等方法制备、纯化权利要求2的单克隆抗体，并检验是否有交叉反应，如有交叉反应，则采用吸附法除掉交叉抗体；(3)胶体金探针的制备采用目测法选择抗体最小稳定量，采用低温高速离心法纯化胶体金探针，采用免疫渗滤等方法对其活性进行检测；(4)纸层析条的处理和组装采用BSA等对硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜等预处理，在处理好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜上分别点加胶体金探针、一抗、阳性对照(二抗或SPA)，然后组装成纸层析条，并筛选点样时胶体金探针、一抗、二抗或SPA等的最佳浓度。
5.检测沙眼衣原体的方法，特征在于利用权利要求3或4的诊断试剂来进行检测。
全文摘要
建立沙眼衣原体单克隆抗体细胞株,应用ELISA夹心法和胶体金检测法检测沙眼衣原体。方法:采用细胞培养法建立CT单克隆抗体细胞株,将制备的CT单克隆抗体纯化后,选用最佳浓度包被酶标板,加入CT.E抗原,用酶标记PcAb,用夹心法确定最佳临床标本。结果:用沙眼衣原体直接免疫荧光法(DFA)、PCR方法与本研究建立的夹心ELISA法同时检测300份非淋菌性尿道炎标本,其中28份三种方法均阳性;另4份仅PCR检测阳性,DFA及ELISA检测阴性。结论:实验证实该方法克服了以往靠进口试剂检测CT的不足,为临床实验室提供了方便快捷检测CT理想的方法,降低了实验成本,便于基层单位推广应用。
文档编号G01N33/577GK1372142SQ0211640
公开日2002年10月2日 申请日期2002年4月2日 优先权日2002年4月2日
发明者孙克江, 郭宏, 张东发, 宋志荣, 崔祥, 晋光荣 申请人:孙克江