专利名称：一种检测醋酸甲羟孕酮含量的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测醋酸甲羟孕酮含量的试剂盒及其检测方法，特别是涉及一种检测动物性食品及饲料中醋酸甲羟孕酮的免疫检测试剂盒及其检测方法。
测定醋酸甲羟孕酮残量的方法，主要有小白鼠生物活性法，色谱法，放射免疫法，酶免疫分析法等，国内外文献已有许多报导，但是寻求操作更为简便，精确度更高，特异性更强的检测方法，一直是广大科研工作者致力研究的方向。
一种醋酸甲羟孕酮酶免疫检测试剂盒，它包括盒体；酶标板；装有标准醋酸甲羟孕酮试剂的试剂瓶A；装有醋酸甲羟孕酮抗体稀释液的试剂瓶B；装有酶标抗原试剂的试剂瓶C；装有酶标抗原稀释液的试剂瓶D；装有含吐温-20的磷酸盐固体的试剂瓶E；装有邻苯二胺的试剂瓶F；装有醋酸钠-柠檬酸缓冲液的试剂瓶G；装有H2O2溶液的试剂瓶H；装有硫酸溶液的试剂瓶I。
所述试剂瓶B中的稀释液为含10g/L BAS，0.01mol/L，pH7.4的PBST溶液；所述试剂瓶C中的酶标抗原试剂为醋酸甲羟孕酮-辣根过氧化物酶或酶标羊抗兔抗体或酶标猪抗兔抗体；所述试剂瓶D中的酶标抗原稀释液为含1％明胶，0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液。
为了使试剂盒中的试剂瓶放置得更加稳固并不易破碎，所述试剂盒内还设有海棉托架。所述海棉托架上制有9个安放试剂瓶的孔和凹槽，所述试剂瓶A、B、C、D、E、F、G、H、I均装在海棉托架内相应的孔和凹槽内。
所述酶标板由塑料支架和若干各自分开的带孔穴的塑料条组成。
试剂盒应放在2-8℃条件下贮存。
本发明的第二个目的是提供一种利用本发明上述醋酸甲羟孕酮酶免疫检测试剂盒检测醋酸甲羟孕酮的方法。
为实现这一目的，本发明采用酶免疫吸附(ELISA)竞争法的原理检测样品中的醋酸甲羟孕酮，其技术方案包括以下步骤1)处理被检测样品；2)将多克隆或单克隆醋酸甲羟孕酮抗体包被在酶标板上，酶标板放在2℃-8℃冰箱过夜；3)在A试剂瓶中加入20-30ml B试剂瓶中的稀释液混匀；4)在C试剂瓶中加入10-20ml D试剂瓶中的酶标抗原稀释液，溶解混匀，在2-8℃下保存；5)在E试剂瓶中加入去离子水配制成洗涤液，用该洗涤液洗酶标板2-4次，每次间隔3-4分钟，洗后用吸水纸拍干；6)在酶标板小孔中分别加入配制好的A试剂瓶和B试剂瓶中的试剂以及处理过的样品稀释液，A试剂瓶和B试剂瓶中的试剂作为阳性和阴性对照，然后加入配制好的C试剂瓶中的试剂进行竞争免疫反应，在37-38℃条件下温育1.5小时后，再用E洗涤液洗板4-6次，每次间隔3-4分钟，拍干；7)向酶标板小孔中分别加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃避光作用15-20分钟，显色；8)向酶标板小孔中分别加入I试剂瓶中的终止液中止反应，目测或用酶标仪测定A490nm值。
所述酶底物混合液是在使用前半小时内用试剂瓶F、G、H中的试剂配制的，配制的方法是，G试剂瓶和F试剂瓶的试剂按体积份数比为7-9∶3-1的比例混合，并按每毫升该混合液中加入14μl H试剂瓶中的H2O2配制而成。
利用本发明所提供的试剂盒可以简便、快速、灵敏、准确地检测动物性食品或饲料中是否含有醋酸甲羟孕酮，价格低廉，样品前处理简单，提取后就可直接测定，并且一次可测定大量样本。用本发明的方法检测醋酸甲羟孕酮，最低检测限可达100ng/kg尤其适用于肉奶蛋制品的MPA残留检测。
2、免疫动物采用BALB/C小白鼠或兔作为免疫动物，免疫抗原剂量为50-100ng，皮下注射，3-4周后，腹腔注射加强免疫2-4次取脾细胞。
3、细胞融合将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞在聚乙烯醇的溶剂中进行细胞融合，在HAT培养液中作选择培养。
4、杂交瘤细胞克隆化采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
5、单克隆抗体(McAb)的保存在液氮或-20℃保存，使用时37℃水浴快速解冻。
6、McAb的生产和提纯光小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5ml/只，7-10天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106/只，7-10天后采集腹水。经硫酸铵盐析法进行纯化，小瓶分装待用。
实施例2、被检样品牛奶的处理1、牛奶样品3500rpm离心10分钟去脂；2、吸取并弃去上层脂肪层；3、取5ml去脂牛奶加入150μl革瑞氏液I，摇匀后振荡再加入150μl革瑞氏液II，迅速摇匀；4、3500rpm离心10分钟；
5、移去上清液，再用缓冲液将其1∶1稀释(1份上清液+1份缓冲液)；6、取50μl用于检测。
实施例3、被检肉样的处理1、用均质器或捣碎机将肉样或肾脏进行均质；2、取均质后样品5g，加20ml乙腈水溶液(84份乙腈+16份水)提取10分钟；3、3000rpm离心10分钟；4、用3ml去离子水稀释3ml上清液，再用4.5ml乙酸乙酯提取；5、3000rpm离心10分钟；6、将乙酸乙脂层吹干；7、用1.5ml缓冲液将残渣溶解，再加入1.5ml正乙烷或正庚烷去脂；8、彻底移去上层的正已烷或正庚烷层；9、取50μl下层液用于检测。
实施例4、用本发明试剂盒检测醋酸甲羟孕酮1、处理被检测样品；2、将多克隆或单克隆醋酸甲羟孕酮抗体包被在酶标板上，酶标板为12×8孔，每孔50-100μl，37℃，温育2hr，用10g/L明胶封闭。包被后的每条酶标板用铝箔袋封好，放在4℃冰箱过夜；3、在A试剂瓶中加入25ml B试剂瓶中的稀释液混匀；A试剂瓶中为标准醋酸甲羟孕酮试剂，B试剂瓶中为含10g/L BAS，0.01mol/L，pH7.4的PBST溶液；4、在C试剂瓶中的醋酸甲羟孕酮-辣根过氧化物酶中加入15ml D试剂瓶中的酶标抗原稀释液，溶解混匀，在4℃下保存；D试剂瓶中的酶标抗原稀释液为含1％明胶，0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液；5、在含0.1％吐温-20(Tween-20)的磷酸盐(PBS)的E试剂瓶中加入200ml蒸馏水配制成E洗涤液，用于酶标板洗涤。用该洗涤液洗酶标板3次，洗液不得溢出，每次间隔3分钟，洗后用吸水纸拍干；6、底物混合液配制临用前半小时内，根据每次所需用量，用F试剂瓶中的邻苯二胺和G试剂瓶中的醋酸钠-柠檬酸缓冲液按 体积比G∶F＝8∶1的比例混合，再按每毫升此混合液加入14μl H试剂瓶中的双氧水的比例配制成底物混合液；7、将试剂盒平衡至室温，在酶标板小孔中分别加入配制好的A试剂瓶和B试剂瓶中的试剂以及处理过的样品稀释液，A试剂瓶和B试剂瓶中的试剂作为阳性和阴性对照，然后加入配制好的C试剂瓶中的试剂进行竞争免疫反应，具体如表1所列，依次加入配制好的试剂及待测样品稀释液，1-3号孔为标准对照孔，4-12号孔为样品测定孔，每批测定时，可以每孔置一只待测样品，也可几只孔置同一只待测样品，进行平行测定，也可用另一块酶标板同时检测，其1-12孔扩大均为样品孔，可视具体待测样品的数目多少而灵活决定。
表1
按上表在4-12样品测定孔中，先后加入待测抗原和酶标抗原，而在1-3标准对照孔中，仅加或不加酶标抗原。在37℃条件下温育1.5小时后，再用E洗涤液洗板4-6次，每次间隔3分钟，拍干；8、向各酶标板小孔中分别加入50μl酶底物混合液，混匀，37℃避光作用15分钟，显色；9、向酶标板小孔中分别加入I试剂瓶中的硫酸终止液中止反应(2mol/L；50μl/孔)；10、测定先比较1-3号孔颜色，1号孔最深，2号孔次之，3号孔接近无色，说明标准正确。
目视法比较样品孔与2号孔颜色，若比2号孔颜色浅，则为阳性，反之为阴性。若颜色与2号孔接近，则用酶标仪测A490nm值，以达到准确检测的目的。
权利要求
1.一种醋酸甲羟孕酮酶免疫检测试剂盒，其特征在于它包括盒体；酶标板；装有标准醋酸甲羟孕酮试剂的试剂瓶A；装有醋酸甲羟孕酮抗体稀释液的试剂瓶B；装有酶标抗原试剂的试剂瓶C；装有酶标抗原稀释液的试剂瓶D；装有含吐温-20的磷酸盐固体的试剂瓶E；装有邻苯二胺的试剂瓶F；装有醋酸钠-柠檬酸缓冲液的试剂瓶G；装有H2O2溶液的试剂瓶H；装有硫酸溶液的试剂瓶I。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂瓶B中的稀释液为含10g/L BAS，0.01mol/L，pH7.4的PBST溶液；所述试剂瓶C中的酶标抗原试剂为醋酸甲羟孕酮-辣根过氧化物酶或酶标羊抗兔抗体或酶标猪抗兔抗体；所述试剂瓶D中的酶标抗原稀释液为含1％明胶，0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒内还设有海棉托架。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述海棉托架上制有9个安放试剂瓶的孔和凹槽，所述试剂瓶A、B、C、D、E、F、G、H、I均装在海棉托架内相应的孔和凹槽内。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标板由塑料支架和若干各自分开的带孔穴的塑料条组成。
6.一种利用权利要求1所述试剂盒检测醋酸甲羟孕酮的方法，包括以下步骤1)处理被检测样品；2)将多克隆或单克隆醋酸甲羟孕酮抗体包被在酶标板上，酶标板放在2℃-8℃冰箱过夜；3)在A试剂瓶中加入20-30ml B试剂瓶中的稀释液混匀；4)在C试剂瓶中加入10-20ml D试剂瓶中的酶标抗原稀释液，溶解混匀，在2-8℃下保存；5)在E试剂瓶中加入去离子水配制成洗涤液，用该洗涤液洗酶标板2-4次，每次间隔3-4分钟，洗后用吸水纸拍干；6)在酶标板小孔中分别加入配制好的A试剂瓶和B试剂瓶中的试剂以及处理过的样品稀释液，A试剂瓶和B试剂瓶中的试剂作为阳性和阴性对照，然后加入配制好的C试剂瓶中的试剂进行竞争免疫反应，在37-38℃条件下温育1.5小时后，再用E洗涤液洗板4-6次，每次间隔3-4分钟，拍干；7)向酶标板小孔中分别加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃避光作用15-20分钟，显色；8)向酶标板小孔中分别加入I试剂瓶中的终止液中止反应，目测或用酶标仪测定A490nm值。
7.根据权利要求6所述的检测醋酸甲羟孕酮的方法，其特征在于所述酶底物混合液是在使用前半小时内用试剂瓶F、G、H中的试剂配制的，配制的方法是，G试剂瓶和F试剂瓶的试剂按体积份数比为7-9∶3-1的比例混合，并按每毫升该混合液中加入14μl H试剂瓶中的H2O2配制而成。
8.根据权利要求6所述的检测醋酸甲羟孕酮的方法，其特征在于所述试剂瓶B中的稀释液为含10g/L BAS，0.01mol/L，pH7.4的PBST溶液；所述试剂瓶C中的酶标抗原试剂为醋酸甲羟孕酮-辣根过氧化物酶或酶标羊抗兔抗体或酶标猪抗兔抗体；所述试剂瓶D中的酶标抗原稀释液为含1％明胶，0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液。
全文摘要
本发明公开了一种检测醋酸甲羟孕酮含量的试剂盒及其检测方法，目的是提供一种结构简单，操作方便，价格便宜的醋酸甲羟孕酮酶免疫检测试剂盒。本发明的试剂盒，包括盒体；酶标板；装有标准醋酸甲羟孕酮试剂的试剂瓶A；装有醋酸甲羟孕酮抗体稀释液的试剂瓶B；装有酶标抗原试剂的试剂瓶C；装有酶标抗原稀释液的试剂瓶D；装有含吐温－20的磷酸盐固体的试剂瓶E；装有邻苯二胺的试剂瓶F；装有醋酸钠－柠檬酸缓冲液的试剂瓶G；装有H
文档编号G01N33/53GK1472533SQ02125370
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月29日 优先权日2002年7月29日
发明者丁宏标 申请人:中国农业科学院饲料研究所