专利名称：高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的镶嵌式高通量细胞芯片检测技术及试剂盒的制备方法。该技术快速灵敏、信息量大，制备方法简便、成本低，能同时检测样品中多种不同的蛋白、核酸分子、生物、化学分子、药物以及微生物或细胞等，可广泛用于生物和医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。
固相吸附、分离与合成技术在水质、水源、生物材料、生物体液(如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液，泪液、汗液、消化液、精液、分泌液、组织液、渗出液、呕吐物、粪便)、组织/细胞和微生物裂解液、不同来源的蛋白、核酸等生物、化学分子以及药物等的分析检测、分离和纯化以及寡核苷酸、多肽、先导化合物和药物的合成等方面被广为应用。
生物固相化技术主要是利用不溶的固相基质材料，通过表面吸附或结合以捕获液相被分析物和被纯化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等，经过一步或多步操作很方便的将未结合的分子(液相、游离相或流动相)与结合分子(固相)分离，以便获得纯的目的分子，或将靶分子从复杂的样品混合物或悬液中分离出来，用于进一步的分析研究。
在样品的检测分析、分离纯化、合成等实验中，大部分情况下需要在同一个容器里、同时进行两项或多项实验，以便对样品中多种不同成分的有无、含量和来源等做出平行的定性、定量、定位分析；或对单一种分子的多种不同特性(如单核苷酸多样性)进行平行检测与分析；或对多种物质同时进行分离纯化，或同时进行多种不同分子的合成。在此情况下，传统的固相吸附试验所存在的问题是对超过3种以上的不同被检测物，纯化物或合成物由于难以区分，很难同时进行。也就是说，用传统的固相技术或方法，在一个容器或试验中被检测物、合成物或分离物的数量受固相系统的限制或制约，更无法同时或连续进行合成、分离与检测。
细胞、细菌、真菌、支原体、立克次氏体和病毒等微生物体，通过核酸、蛋白多糖、酶类等生物分子携带有大量的，与其生物学特性相关的生物信息；基因工程菌、生物工程细胞、转化细菌、转染和感染的真菌和动植物细胞以及重组质粒或病毒等除带有与自身生物学特性相关的遗传基因和生物分子外，还可带有插入基因、重组基因、感染或转染病毒等所赋予的特殊生物分子，因此被广泛用于生物医学检测和分析及分子文库的构建等领域。
在现代基因组学、蛋白质组学、功能组学的分析研究和生物医学诊断和新药研究等领域，需要同时对同一样品中大量的、多种不同生物化学物质进行快速、灵敏的高通量分离、纯化与检测，以分析生物、化学物资的种类、数量、组成、变异以及多态性、翻译后修饰、结构、序列、不同生物分子间的相互作用，或个体用药特性与感染状态，个体免疫系统的功能状态、遗传差异等。传统解决办法是首先通过分离、提取、纯化或人工合成等技术工艺，分别制备大量的各种不同的生物探针(如核酸或寡核苷酸分子、蛋白与多肽、生长因子与受体、抗原与抗体等各种不同特性的生物分子)，再通过微阵列等技术将生物探针分别固相化在固相基质(如载玻片、微孔板或微载体等)的表面，再与样品中对应的化学物质、核酸、抗原/抗体反应，分析检测。由于合成与制备、分离纯化与检测分析等各个环节互不关联，因此如要检测十几种成分就需进行十几次不同的分离纯化，操作异常繁琐复杂。特别是在单克隆抗体、基因工程抗体以及疫苗等的大规模制备中，需要对大量的cDNA文库、抗体库以及噬菌体、细菌和酵母等各种展示文库进行高通量，大规模筛选；而现有的技术方法只能通过免疫细胞化学等方法逐一进行培养、固定、检测分析，操作异常复杂、繁琐，无法实现产业化。本发明的目的就是要运用位序编码技术和悬浮培养与固相分离技术，以期为多种不同物质成分、特别是核酸、蛋白分子以及药物及其前体等的分离与纯化、检测和筛选等提供一套制造成本低，便于产业化，而技术和工艺更为简便灵敏、快速准确；同时又可将二者有机结合，贯通一起的新的高通量筛选与检测分析技术。
本发明的主要技术特征是，将细菌、病毒或细胞等微生物体附着在微载体的表面获得不同的生物微球，经固定等处理后分别镶嵌在检测板的不同微孔中，微孔间有微管相连，并与进/出液口形成微流路与外界相通，样品通过微流路与生物微球表面病毒、细菌或细胞等微生物体中的生物分子反应，各孔的反应结果可用目测或用仪器记录分析，根据生物微球在检测板中的排列位置和顺序(位序编码)，对样品或生物标本中的化学物质、生物靶分子、核酸、寡核苷酸、药物等多种不同成分的有无、性质、含量、来源、组织和细胞学分布、定位等同时进行检测分析。
本项发明同时还提供了一种基于镶嵌式高通量细胞生物芯片检测技术的试剂盒的制备方法，其主要技术特征在于试剂盒由镶嵌有生物微球，带有微流路的多孔检测板及各种相关的配套试剂分别组成；根据检测板各微孔反应的有无与强弱，以及各微孔在检测板中的排列位置和顺序，对不同样品中多种不同成分同时进行比对分析，利用试剂盒中所提供的试剂和方法还可对样品与检测板中各孔所捕获的样品成分，做分子克隆、分子结构、亲和力、分子量、等电点、序列测定等分析。该试剂盒不仅大大简化了同一样品进行多因素检测分析的操作步骤，缩短了操作时间，降低了工作强度，更增加了检测结果的精确性、灵敏度、重现性和可比性，而且还可同时对检测样品中多种不同的物质成分做进一步的不同分析，使用更方便，操作更快捷，可广泛地应用于环境检测、疾病诊断、新药开发、疫苗研究、生物分子相互作用、基因组学、蛋白质组学和功能组学等技术、研究领域。
为了达到上述目的本发明所采用的技术方案其基本特征在于镶嵌式高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒的制备至少包括下述成分或步骤①一种检测板由微孔板(1)、生物微球(2)等组成；微孔板由板体(3)、板盖(4)、微孔(9)和微流路等结构组成；生物微球由微载体和其表面附着的不同或相同的细胞或微生物组成，并按一定的顺序镶嵌在不同的微孔中；②封闭用含有去垢剂、白蛋白、脱脂奶粉等成分的缓冲液处理生物微球，以封闭和去除微载体表面可能存在或残留的非特异性结合位点或内源性酶活性等；
③样品被检样品，如固/液体标本、生物体液、组织、细胞、微生物等经过处理，如稀释、组织/细胞的匀浆、裂解、去除颗粒性物质、分离纯化、反转录、PCR扩增、标记等；或不处理直接由进液孔沿微流路进入微孔板，流经微孔时与生物微球表面细胞或细菌等微生物体的各种生物分子相互作用；被检分子与固相的生物分子杂交或特异性结合并被吸附在生物微球表面；未结合的样品成分经出液孔流出；④标记用标记分子，如荧光素、同位素、生物素和半抗原，胶体金、酶、稀土离子及其螯合物等物质或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接标记被检样品；或用标记分子的不同标记产物，如荧光抗体等标记物标记被检样品；⑤漂洗借助微流路，用洗液，如含0.03-0.1％的Tween20或Triton X-100等的PBS，Tris-HCl，HEPES等缓冲液，流洗以去除检测板中残留的被检样品、标记样品和标记物等；⑥检测与分析目测或用扫描仪等检测各微孔中标记分子的有无与含量，如根据荧光、放射性、发光产物的有无，强弱或显色产物的有无，颜色的深浅等，分析被检样品中被检物的有无、含量、组成、来源、分子结构、亲和力、组织/细胞学定位以及核苷酸或氨基酸序列等；⑦标记物为酶时，如HRP(辣根过氧化物酶)，AP(碱性磷酸酶)、荧光素酶(Luciferin)等，观察结果前需先加入显色剂或发光试剂等底物试剂，如OPD(邻苯二胺)、DAB(二氨基联苯胺)或发光试剂(如鲁米诺、甲基伞形酮磷酸酯、对羟基苯乙酸)等。
本发明的特征还在于微孔板由板体、板盖、微孔和微流路等结构组成；板体和板盖为任何可加工成型的、透光的、不透光的、反光或不反光的硬质或软质材料，如玻璃、塑料、高分子合成材料、陶瓷、金属、非金属等多种不同材料或复合材料等，可加工成方形、长方形、园盘型或其它外观形状的实体结构；在板体和板盖上可分别具有进液孔、出液孔、密封圈、蠕动管、微孔、微管、驱动孔、定位孔和视窗等部分或全部结构；微孔按一定的格式排列，通过微流路与外界相通或形成闭合环路。微孔经处理表面可附着动植物细胞或细菌、病毒等微生物；板体和板盖分别或共同经不同的化学修饰或表面处理，①产生反光层，反射光信号；②获得惰性化学涂层，如辛胺、泰富隆(Teflon)涂层、硅化等处理以减少微流路对样品和/或标记物等的非特异性吸附。
本发明的特征还在于微载体是由任何可加工成型的材质，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、琼脂糖、高分子合成材料、纤维素、乳胶、硅胶、层析基质、陶瓷、磁性材料、金属或非金属等多种不同材料或复合材料，经加工而成的，大小均一、具有不同外观形状的多孔或实心体；微载体经处理表面可附着动植物细胞或微生物制成生物微球；各种微载体的处理至少包括下述不同方法①用多聚赖氨酸浸泡处理；②硅烷化处理，如丙氨基-三乙基硅烷(APES)等；③用固相合成技术在微载体上直接合成促进细胞附着的蛋白肽等活性片段，如细胞外基质的RGD片段等；
④用胶原蛋白或细胞外基质涂布微载体，如鼠尾胶原，纤粘连蛋白等；⑤通过化学修饰在微载体表面形成一层由活性基团组成的表面分子层，如DEAE基团；⑥微载体的加工原材料中加入具有化学活性基团(如DEAE基团)的材料。
本发明的特征还在于微流路由进液孔、出液孔、微管、密封圈、蠕动管等结构组成，可分别位于板体或板盖上，也可全部位于板体或板盖上，其在板体或板盖上的不同位置与组合，可形成具有不同几何特征，满足不同实验需求的微流路；微流路通过微管与微孔相连，并通过进液孔和出液孔与外界相通；蠕动管位于进/出液孔之间，需要时可将微流路连接成闭合环路，使液相环流以便固/液相成分充分反应；密封圈和蠕动管可位于检测板上也可以外置；蜂巢式微孔板可无微管和微槽，亦或也无进/出液孔等结构，使用时可通过视窗添加样品和漂洗；微流路经表面处理可获得不同的惰性表面涂层，以减少反应时的非特异性吸附。
本发明的特征还在于生物微球是指细胞或微生物等微生物体与微载体共培养并贴附在微载体上，获得的具有不同化学活性，可与样品中的被检物特异结合的生物微球；微生物体贴附在微载体表面后，可加入各种不同的试剂、药物、生物因子等处理适当时间，处理可分别在培养器皿中或同时在微孔板中进行；微生物体也可用组织细胞固定液(如含乙醇、甲醛、戊二醛等的固定液)分别进行固定处理或在微孔板中同时固定处理，使微生物体固着在微载体的表面；生物微球的种类和制备方法至少包括①动植物细胞在培养皿或发酵罐中与微载体共培养，在微载体表面长成单层，并融合成片，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；②动植物细胞在培养皿或发酵罐中与微载体共培养，在微载体表面长成单层，并达到适当密度后，给予药物、试剂、生物因子等不同理化因素的适当处理，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；处理、漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；③细菌等与微载体共培养，待细菌在微载体表面长成单层，并融合成片，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；④经病毒、噬菌体或质粒感染、转染或转化了的动植物细胞或细菌等与微载体在培养皿或发酵罐中共培养，待细胞微生物在微载体表面长成单层，并融合成片，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；⑤感染、转染或转化了的动植物细胞或细菌与微载体在培养皿或发酵罐中共培养，待细胞或微生物等在微载体表面长成单层，并达到适当密度后，给予药物、试剂、生物因子等不同理化因素的适当处理，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；处理、漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；
⑥将各种微生物体配成一定浓度的悬液，与微载体共育，待附着牢固或铺展后，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；⑦将各种微生物体配成一定浓度的悬液，与微载体共育，待附着牢固或铺展后，给予药物、试剂、生物因子等不同理化因素的适当处理，彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，漂洗去除残留固定液；处理、漂洗和固定可在培养器皿中分别进行也可在微孔板中同时进行；本发明的特征还在于以荧光染料(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等荧光素)、同位素(125I，32P，35S，3H等)、生物素和半抗原，胶体金、酶(HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，尿素梅和荧光素酶等)、稀土离子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu3+-DTPA)等标记分子或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接标记被检样品；或用标记分子的不同标记产物，如荧光抗体、酶标抗体、生物素化抗体、生物素化酶、Eu3+-DTPA-抗体等能与样品中的被检物特异性结合的、用指示性标记分子标记的标记物标记样品(间接标记)；标记可在试管中进行，也可在微孔板中进行。
本发明的特征还在于可采用下述方法进行定量分析①在同一块微孔板上细胞附着的微孔或镶嵌生物微球的孔数可有1个或1个以上的复孔；当样品逐孔流经各微孔及其复孔时，对应的被检测物被不断结合，并不断地从标本液中去除，因此，各微孔及其复孔的结合量，因前后排列顺序的不同逐渐减少；根据各微孔与复孔反应的有无与强弱变化，即可进行定量分析；②在进行定量分析时，可按①所述方法设定标准参照物，借助计算机分析绘出标准参照物的浓度-反应孔数量及其强弱变化曲线，对照标准曲线，结合标本体积，获得精确的样品定量分析结果。
本发明的特征还在于①提取的样品DNA，可用寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP和标记分子等，通过至少一个循环周期的PCR反应进行延长或扩增；PCR反应循环周期包括a)加热变性；b)退火，引物与模板或样品中的靶核苷酸杂交；c)DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列；②提取的样品RNA或mRNA，经反转录获得互补DNA(cDNA)，再通过至少一个循环周期的PCR反应进行延长或扩增；PCR反应循环周期包括a)加热变性；b)退火，引物与模板或样品中的靶核苷酸杂交；c)DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列；③样品按常规方法提取核蛋白、胞浆蛋白或膜结合蛋白等成分。
本发明的特征还在于试剂盒至少装有一块检测板，各微孔中至少镶嵌一粒微载体，微载体表面分别附着不同的动植物细胞或细菌等微生物体，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒①至少有一管组织/细胞或微生物样品处理液，用于微生物体的裂解和DNA或RNA，蛋白质等的提取；处理液可分别含有适量的去垢剂(如Triton X-100，NP40，Chaps等)、核酸酶抑制剂(如DNA酶和RNA酶抑制剂)、蛋白酶抑制剂，如PMSF，EDTA，TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等，以保证样品充分裂解和溶解，同时保证DNA、RNA或蛋白分子等不被降解；②至少各有一管分别为dNTP(三磷酸脱氧核苷)，引物和热稳定的DNA聚合酶等用于样品的扩增或捕获的样品核酸成分的基因克隆；③至少各有一管分别为dNTP和反转录酶，用于样品mRNA互补DNA的合成；④至少有一管含标记分子或其衍生物(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，地高辛和生物素、Cy5-dCTP，32P-dCTP等)或标记物(如荧光抗体、酶标抗体等)用于对样品的直接或间接标记；⑤在标记分子或标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物，如OPD或DAB与过氧化氢/脲、鲁米诺，甲基伞形酮磷酸酯，ATP等；⑥至少有一管洗涤液或其浓缩液，如含有适量BSA或小牛血清、鲑精DNA，脱脂奶粉、去垢剂等的缓冲液，可用于检测板的漂洗或流洗，以去除反应中的各种非特异性结合物；⑦至少有一管为蛋白质浓度检测分析试剂，如Folin一酚试剂，Bradford试剂等；⑧至少有一管为核酸内切酶(如EcoRI等)、蛋白水解酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶等)，用于核酸或蛋白的消解，以便进行蛋白质的质谱分析、核苷酸或氨基酸序列分析；⑨至少有一管为染色液，如革兰氏染液、H-E染液、姬姆萨染液等，用于细菌或细胞的染色或复染；⑩至少有一管为电泳样品缓冲液，如含适量SDS或尿素等不同蛋白质变性剂的SDS-PAGE电泳样品缓冲液或含有尿素或Chaps等的IEF电泳样品缓冲液及核酸电泳样品缓冲液等用于电泳分析。
本发明的特征还在于在完成基本检测分析后，还可用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对样品或检测板各不同孔所结合的样品成分分别做PCR、RT-PCR扩增、质谱分析、核苷酸/氨基酸序列测定、蛋白质磷酸化以及糖基化等进一步分析前的处理①直接在感兴趣的各微孔中加入核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂，对微孔和微球的结合物在原位做基因克隆或进一步分析前的样品处理；②将微孔中的生物微球取出，在微量反应器中分别加入对应试剂做基因克隆或进一步分析前的样品处理；③将新鲜样品分别与感兴趣微孔的复本微球或包被相同结合特性分子单体的微载体共育，以同样的条件重复微孔板的操作步骤，将样品中感兴趣的物质成分吸附在微球表面并与样品液分离，加入对应试剂，对结合物做基因克隆或进一步分析前的样品处理。
(4)样品的PCR，RT-PCR扩增反应和标记等处理可在试管中进行，也可在微孔板中进行。
本发明具有以下优点1信息量大。微球的大小可从毫米到微米，目前各种商售的固相基质颗粒和细胞培养专用微载体一般在几十微米到数百微米之间，如按200微米计算，1张标准载玻片大小的细胞芯片就可达1万枚左右。因此，如用于附着细胞表面展示系统转染或转化的细胞、细菌等微生物体，进行基因表达和翻译后修饰等的研究，经一次检测分析，就可同时获得成千上万种不同表达基因平行检测分析的结果与数据资料；此外还可同时获得定性、定量、细胞学定位与组织分布等数据资料。2.易于制备、成本低。本发明所述的微载体可选用各种商售产品为原材料，如多孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、各种层析基质、硅胶珠和细胞培养微载体Cytodex I、Cytodex II、Cytodex III等，本发明将悬浮培养与生物制品的分离纯化与生物微球的制备融为一体，省略了繁杂的生物分离纯化过程；3.自由组合，灵活易变。可完全依照使用目的的不同，自由组合，或灵活地改变微孔板中任何一孔镶嵌的生物微球的种类和结合特性以改变检测的内容，而无需变动全部排列顺序和格式；4.灵敏度高。本技术方法所用的固相基质采用了三维立体结构，即微载体与微孔均可或分别作固相。每个微载体相当于固化了配基/配体的亲和层析基质，与传统方法相比，有更大的比表面积和比结合容量。为提高反应灵敏度，还可采用大孔微球或/和微孔作固相，使比表面积远远超过现有技术和方法。当样品逐孔流过串珠样排列的微孔时，可与生物微球上细胞或细菌等的蛋白、多糖或核酸分子特异结合或杂交(具有过滤、亲和层析、分离与浓缩效用)；同时被固相吸附后的样品液不再与样品原液混合，减少了被检测物(如抗原/抗体等)因反复扩散、平衡而被稀释的影响，故更加灵敏；5.操作简便，节省样品与试剂。采用本发明所述的高密度微孔板进行检测分析，样品、标本、标记物、洗液和底物沿微流路逐一流经各孔，改变了传统和现有技术分别反应、清洗或在较大的容器中反应和浸洗的操作方式，因此可解决因样品不易获得和标记物价格昂贵所带来的困扰，可大量节约试剂，并且易于实现全自动化操作；6.定量分析更准确。本方法将数十种甚至数千种化学物质和生物分子的检测分析集中在一块检测板上同时进行，根据检测板中各微孔中荧光、胶体金沉积、发光的有无，或成色产物的生成与否，对照其排列位置，不仅可以确定样品的组成及各组分的来源、含量，组织/细胞定位，同时又便于不同样品间和同一样品不同成分间的平行比对。生物微球附着的细胞或细菌可同时在同一培养器皿中一次性大量制备，从而可保证各复孔和各检测板之间的检测结果的平行一致。在需要对某一成分进行定量分析时，通过增加镶嵌附着相同细胞等微生物体的相同生物微球的复孔数，配合微流路解决了定量分析的准确性、重复性和不同实验室及不同批次检测分析结果的可比对性问题；7.保留了传统和现有检测方法重复性好，准确性高、可靠性强等优特点。8.结果易于分析。由于微孔和生物微球的形状和尺寸相同，封闭式镶嵌立体结构可避免灰尘等引起的噪声信号，因而能获得均匀和最小的图像背景强度，同时每个微孔和微球的排列可与光电信号转换元件的排列一致，因此可获得最佳的细胞芯片图像。9.用途更广泛。本发明不仅可直接用于疾病的诊断、新药的开发和蛋白质组学等现代生命科学的研究与开发；而且对感兴趣的微孔还可直接在检测板中进行基因克隆、核苷酸序列分析、结合物的分子量、等电点、结构、功能、亲和力、组织/细胞及亚微或超微结构定位等进一步分析；对结合物的不同洗脱条件可用于后续的靶分子的分离纯化。
下面结合附图作进一步的说明
图1为检测板基本结构示意图。
图中所示为微孔板1，生物微球2，板体3、板盖4、进液孔5、出液孔6、密封圈7、蠕动管8、微孔9、微管10，其中微球2镶嵌在微孔9中；各微孔间的微管10将微孔9与进液孔5、出液孔6，相连并和密封圈7等结构组成微流路；图中微孔9与微管10、进液孔5、出液孔6和密封圈7形成微流路，再与蠕动管8构成闭合环路。图2为3种典型检测板的外观结构示意中2A，2B，2C分别为3种典型检测板的外观结构示意图，图中所示为微孔板1、进液孔5、出液孔6，驱动孔11，定位孔12和视窗13等结构。图2C所示的检测板也可为蜂巢式，微孔间可无微槽或微管，但保留进液孔5，出液孔6；或者无进液孔5，出液孔6等结构，使用时直接经视窗13添加样品和漂洗。图3是图2A中虚线框A部分的放大图。
图3A为平面图，图中所示为微孔9、不连续的微管10，镶嵌在微孔9中的生物微球2、密封圈7以及与微管10相通的进液孔5；图3B为图3A的A-A剖面图，图中所示为板体3、板盖4、微孔9、微管10、镶嵌在微孔9中的生物微球2，进液孔5、密封圈7等；图中微孔9上端的微槽14与板盖4形成微管10，并与下端的微管10将微孔9两两相连，与进液孔5、出液孔6等形成完整的微流路。实施中，板体3可分成不同的部分分别加工，最后整合一体成。图4是图2A中虚线框B部分的具有不同微流路结构的微孔板的局部放大图。
图4A为平面图，图中所示为微孔板1、微孔9、微管10，镶嵌在微孔9中的微球2；图4B为图4A的A-A剖面图，图中所示为板体3、板盖4、微孔9，镶嵌在微孔9中的生物微球2；图中微孔9两端的微槽14与板盖形成微管10将微孔9两两相连，与进液孔5，出液孔6等形成完整的微流路。图5是具有不同微流路的检测板的局部放大图。
图中所示为板体3、微孔9、微管10，镶嵌在微孔9中的生物微球2；图中两个相邻微孔的侧壁上有微管10，其上端的开口与微槽14相通，微槽14与板盖4形成与上下面平行的微管10；微管10上下两端的开口将微孔9两两相连，并可与进液孔，出液孔等形成完整的微流路。实施中可在微管10中接入传感器，微型采样装置，或在微孔板上下与微管对应的外置安装外置微检测装置，以观察细胞等微生物体对各种处理的生理与生物化学变化。图6是微载体外观形状与结构示意图。
图6A显示多面体微载体15，具有活性基团能促进细胞附着的表面分子层16；图6B是用纤维素膜或微孔膜制成的片状微载体17；图6C是多面体微载体15的剖面图，显示多孔结构，微载体15的表面可促进细胞附着的活性基团或分子所形成的表面分子层16；图6D是球状微载体15的外观结构示意图，16是可促进细胞附着的活性基团或分子形成的表面分子层，该分子层可以是活性基团、蛋白分子、多肽、多聚赖氨酸或多糖等。图7生物微球结构示意图。
图7A中是球状微载体15；可促进细胞附着的活性基团或分子形成的表面分子层16；通过表面分子层16附着在微载体15表面的细胞18。
图7B是图7A的局部放大图，图中固相微载体15；促进细胞附着的活性基团或分子形成的表面分子层16；附着在微载体15表面的细胞18。图8镶嵌式细胞生物芯片核酸检测分析工作原理示意图。
图8A，样品核酸分子20在试管中经荧光素分子21标记后，与微载体15表面细胞18的核酸分子19杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记分子21，根据各阳性孔的位序编码获得样品核酸分子在不同细胞的分布与表达水平或不同药物处理、不同作用时间对不同或相同细胞表达水平的影响等分析结果。
图8B，样品核酸分子在试管中，用末端经荧光素分子21标记的引物进行PCR扩增；扩增产物22与微载体15表面细胞18的核酸分子19杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记分子21获得检测分析结果。
图8C，寡核苷酸分子引物23和24(末端用荧光素分子21标记)与微载体15表面细胞18的DNA或RNA分子退火，并以之为模板经PCR或RT-PCR扩增；扩增产物25和26被结合在固相微粒表面，漂洗去除游离引物，检测标记分子21获得检测分析结果。
图8D和图8E，样品核酸分子或其扩增产物20在试管中经生物素分子27标记后，与微载体15表面细胞18的核酸分子19杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，加入酶29标记的抗生物素抗体28或亲合素32，反应完成后漂洗去除未结合的游离物，加入底物30，观察生色或发光产物31的有无或强弱；根据各阳性孔的位序编码获得检测分析结果。
图8F，样品核酸分子或其扩增产物20在试管中经半抗原分子33标记后，与微载体15表面细胞18的核酸分子19杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，加入酶29标记的抗半抗原抗体34反应，漂洗去除未结合的、游离的酶标记物，加入底物30，观察生色或发光产物31的有无或强弱；根据各阳性孔的位序编码获得检测分析结果。
图8G，样品核酸分子20在试管中经半抗原分子33标记后，与微载体15表面细胞18的核酸分子19杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，加入荧光素21标记的抗半抗原抗体34反应，漂洗去除未结合的游离标记物，检测标记分子21，根据各阳性孔的位序编码获得检测分析结果。图9镶嵌式细胞生物芯片免疫检测分析工作原理示意图。
图9A，样品抗体分子36用荧光素分子21标记后，与微载体15表面细胞18的抗原分子35特异性结合，未结合的样品抗体分子经漂洗去除，检测标记分子21，根据各阳性孔的位序编码获得样品抗体所识别的特异性抗原分子在不同细胞的分布与表达水平或不同药物处理、不同作用时间对不同或相同细胞特异性抗原分子表达水平的影响等分析结果。
图9B，样品抗体分子36和38分别用荧光素分子21和39标记后，与微载体15表面细胞18的抗原分子35和37特异性结合，未结合的样品抗体分子经漂洗去除，检测标记分子21和39，根据各阳性孔的位序编码获得样品抗体所识别的特异性抗原分子35和37在不同细胞的分布与表达水平或不同药物处理、不同作用时间对不同或相同细胞特异性抗原分子表达水平的影响等分析结果以及抗原分子35与抗原分子37之间的共表达或调控关系。
图9C，样品抗体分子36与微载体15表面细胞18的抗原分子35特异性结合，未结合的样品抗体分子36经漂洗去除，加入酶29标记的抗抗体40反应，漂洗去除未结合的游离物，加入底物30，观察生色或发光产物31的有无或强弱；根据各阳性孔的位序编码获得检测分析结果。
图9D，样品蛋白分子42用荧光素分子21标记后，与微载体15表面正常或转染细胞43表达或展示的靶分子44特异性结合，未结合的蛋白分子42经漂洗去除，检测标记分子21，根据各阳性孔的位序编码获得样品蛋白分子42所识别的特异性靶分子44在不同细胞的分布与表达水平或不同药物处理、不同作用时间对其表达水平的影响等分析结果。
图9E，药物分子47经荧光素分子48标记后，与微载体15表面细胞45的蛋白分子46结合，未结合的样品蛋白分子经漂洗去除，检测标记分子48的有无及强弱，获得分析结果。
图9F，以包裹荧光物质的固相微粒49为基质，经固相合成获得连接在荧光微粒表面的药物分子47；将药物荧光微粒与微载体15混合，药物分子47与微载体15表面细胞45的蛋白分子46结合并将荧光微粒49吸附在微载体15的表面，未结合的荧光微粒49经漂洗去除，检测荧光微粒49的有无及强弱，获得药物靶标分子(蛋白分子46)的组织细胞分布等分析结果。
图9G，带有分子标签50的药物分子47与微载体15表面细胞45的蛋白分子46反应，未结合的药物分子47经漂洗去除；加入荧光素分子21标记的抗分子标签抗体51，反应完成后漂洗去除未结合的游离物，检测标记分子21根据各阳性孔的位序编码获得药物分子47的高通量分析结果。
图9H，抗体分子54用荧光素分子21标记后，与微载体15表面细胞52上的受体分子53反应，未结合的抗体分子54经漂洗去除；检测标记分子21根据各阳性孔的位序编码获得受体分子53组织细胞分布的高通量分析结果。
图10镶嵌式细胞生物芯片蛋白一核酸相互作用检测分析工作原理示意图。
图中荧光素分子21标记的样品蛋白分子57与微孔中镶嵌微载体15表面细胞55的核酸分子56特异性结合，未结合的蛋白分子57经漂洗去除，检测标记分子21根据各阳性孔的位序编码获得核酸分子56组织细胞分布的高通量分析结果。
本发明在实施中的基本操作步骤和方法如下一.检测板的制备检测板的制备方法包括以下基本方法和步骤1.表面处理微载体可直接选用经表面处理的各种商售层析基质如DEAE-Sephadex或细胞培养微载体Cytodex等，也可选用聚苯乙烯珠、玻璃珠或控孔玻璃珠(美国应用生物系统公司，Sigma公司)等自行处理。微孔板和微载体的表面处理因所选材料的不同而略有不同，每种材料其具体处理方法和条件都有多种，本发明在此将《生物分子固定化技术及应用》(蒋中华等，1998年，化学出版社)及中国专利号为01207812.3和申请号为00120798.9专利引为主要参考文献。运用公知的各种生物大分子固相化技术，处理各种材料的微载体和微孔板，使其表面带有特定的活性基团，以便于细胞等微生物体的附着。
微孔板也可依据实验要求做不同的表面处理。如进行硅化处理或泰富隆(Teflon)涂层处理，仅仅作为反应容器或微流路，以减少实验中的非特异性吸附。聚苯乙烯珠或控孔玻璃珠等的具体的处理方法是①多聚赖氨酸处理经彻底漂洗处理的玻璃珠、控孔玻璃珠和聚苯乙烯珠用多聚赖氨酸(10-200ug/ml)处理15-120分钟或4℃过夜，蒸馏水或缓冲液漂洗后干燥备用。
②硅烷化处理；清洗处理的多孔玻璃微载体(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；2121)用2％丙氨基-三乙基硅烷(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目录号A3648)无水丙酮溶液处理20-120秒，丙酮漂洗后干燥备用；2.生物微球的制备将不同的细胞分别与微载体共育，使细胞附着在微载体表面，分裂增殖并达到一定的细胞密度。附着细胞的培养、增殖、固定以及计数等因其种属和组织来源等生物学特性的不同而有较大差异，在此引用Amersham Pharmacia Biotech公司的Cytodex产品的客户使用手册为主要参考资料。3.镶嵌微球人工或用全自动机械手系统，将生物微球按一定顺序分别嵌入微孔板的各个微孔中，除本发明所述的微孔板外，实施中也可选用中国专利号为01207812.3和申请号为00120798.9专利所述各种结构的微孔板。各微孔中的生物微球可以相同也可以不同，以便对不同的样品标本同时进行相同的检测分析，或对同一样品标本同时进行不同的检测分析。4.封盖使微孔、微槽与进/出液孔形成微流路，并只能通过进/出液孔与外界相通。5.封闭经进/出液孔加入封闭缓冲液，以封闭去除生物微球、微孔板或微流路等表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，以减少检测中可能出现的非特异性结合。由此即获得能与化学分子、生物分子、抗体和/或抗原，酶、核酸或寡核苷酸分子等特异性结合，并可用于对结合物进行检测的镶嵌式高通量细胞生物芯片。封闭液中常用的添加剂有鲑精或酵母DNA、聚蔗糖、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白(0.5-5％)、脱脂奶粉(0.1-6％)、酪蛋白(0.5-2％)、白明胶(0.1-0.5％)，正常动物血清(0.5-5％)和去垢剂等(如Tween 20，NP40，Triton X-100、SDS)。在实施中用酶显示结果时，添加剂种还需要加入，叠氮钠、过氧化氢、生物素或抗生物素等试剂以封闭内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶以及生物素等的活性，减除非特异性染色对检测结果的影响。蜂巢式检测板无微管/槽或也无进/出液孔，需封盖前封闭，使用时揭掉粘封的盖膜或除去板盖使用，漂洗方式采用浸洗。二.样品的检测分析样品的检测分析一般包括以下基本步骤和方法1.样品的制备根据检测目的不同，样品在检测前将分别进行不同的处理。常见样品处理方法包括①核酸提取物用DNA或RNA抽提液处理各种生物样品、生物体液或培养物以提取样品中的DNA或RNA等；②蛋白质等提取物生物样品、生物体液或生物标本等的分离提取物或组织细胞裂解液、超声粉碎或匀浆液；③人工合成产物运用各种人工合成技术获得的药物前体、先导化合物以及多肽、寡核苷酸等合成产物；④反转录合成的cDNA；⑤PCR或RT-PCR扩增产物等。2.样品的标记①直接标记。运用各种公知的生物分子标记技术，分别用生物素、酶、荧光素、胶体金、同位素或稀土离子及其螯合剂等物质或其衍生物等标记分子作为指示剂直接标记样品或生物标本；②采用间接标记。运用生物分子的特异性相互作用原理，用标记分子的标记产物(如荧光抗体，生物素-HRP等标记物)标记样品；③掺入标记，运用各种合成技术，如固相合成技术、PCR扩增等将标记分子或标记物掺入被标记分子中。3.加待检样品①将样品或处理样品经进液孔加入检测板中，使之与各孔中的微载体表面附着细胞的不同核酸分子或寡核苷酸分子等杂交。被检样品中互补或对应的生物分子被固相捕获或特异结合，剩余的和未结合的部分经出液孔流出检测板。②将寡核苷酸引物、dNTP，可掺入标记物和耐热DNA聚合酶等与微量的核酸样品加入微孔板中，进行至少一个循环的PCR或RT-PCR扩增反应。③样品中的抗原抗体、配基配体、细胞因子或药物分子等与微载体表面附着细胞的不同生物分子结合。4.漂洗借助检测板的微流路，用洗液流洗，蜂巢式检测板可经进/出液孔流洗或通过视窗(22)浸洗，以去除检测板中残留的被检样品(未结合物或称游离物)或标记物等。5.结果分析根据标记分子的不同，目测或用扫描仪等仪器观察并记录各孔反应的有无以及强弱(如生成产物颜色的深浅、胶体金沉积、荧光强度、放射强度等的强弱变化)。对照微孔的排列位置或生物微球位序编码，借助计算机分析即可以确定该样品中，被检测物的组成以及各组分的含量，结构序列等；或者获得靶分子在不同组织细胞的分布、与表达调控。但是在标记物为蛋白酶时，操作中必须增加添加底物等操作步骤才能观察检测结果，其检测结果为呈色反应或发光反应。
本发明在实施中，上述操作步骤依据细胞等微生物体或固相探针、被检测物、标记物和显示结果等的不同，可有多种不同的组合方式。各种生化反应可在微孔板中进行，也可部分或全部在试管中进行。在微孔板中进行时，各微孔中镶嵌的生物微球表面所附着的细胞可以相同(蜂巢式微孔板)，用于检测不同样品中的相同成分；也可以不同，用于对同一样品中的不同成分进行高通量的检测分析。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例I镶嵌式高通量细胞生物芯片在单克隆抗体研究中的应用。
在小鼠单克隆抗体的研究中，通常需要对抗体识别的抗原靶分子的组织细胞分布进行鉴定，如细胞表面的各种受体分子或CD分子等，在实施中的具体操作步骤如下1.微载体处理安砝码西亚公司细胞培养微载体Cytodex用无钙镁PBS或Hanks液溶涨，乙醇或高压消毒，用无菌的无钙镁PBS或Hanks液、培养液依序漂洗，1-5mg/ml加入培养液置培养容器中。2.生物微球的制备将不同的细胞按105/ml分别加入培养容器中与微载体充分混匀，37℃静置适当时间(10-90分钟)，使细胞附着在微载体表面，补足培养液按10-80rpm/分钟搅拌培养(2-5天)至所需细胞密度，终止培养，其间可收集细胞计数，并可视具体情况更换培养液。静置待微载体沉积后，弃上清液加入无钙镁PBS或Hanks液漂洗数次。加入固定液(如含3.7％的多聚甲醛和4％的蔗糖的PBS)适当固定(10-30分钟)后，漂洗数次即获得经固定处理的不同来源的组织细胞的生物微球。加适当体积的含防腐剂(如叠氮钠等)的无钙镁Hanks液，4℃保存备用。3.镶嵌微球人工或用全自动机械手系统，将生物微球按一定顺序分别嵌入微孔板的各个微孔中，除选用本发明所述的微孔板外，还可选用中国专利号为01207812.3和申请号为00120798.9专利所述的各种结构的微孔板。4.封盖使微槽与进/出液孔形成微流路，微孔只能通过进/出液孔与外界相通。5.封闭经进/出液孔用封闭缓冲液(无钙镁Hanks液含1-3％牛血清白蛋白)，以封闭去除微球、微孔板或微流路等表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，以减少检测中可能出现的非特异性结合。由此即获得能与抗体等特异性结合，并可用于对结合物进行检测的镶嵌式高通量细胞生物芯片。在实施中如用酶显示结果时，添加剂中还需加入叠氮钠或过氧化氢等试剂以封闭内源性过氧化物酶的活性，减除非特异性染色对检测结果的影响。6.加入样品取适量体积(50-150ul)的待鉴定杂交瘤细胞的培养液(含抗体)，经进液孔加入微孔板中，孵育适当时间(5-90分钟)，使抗体与细胞表面的抗原分子充分作用。为提高检测灵敏度，减少沉积和吸附引起的非特异性反应，可通过在进/出液孔之间，通过内置或外置式蠕动管形成的闭合回路，使样品液在微流路中循环流动。7.漂洗借助微流路，用洗液(PBS含0.03-0.1％的Tween20或Triton X-100)流洗以去除检测板中残留的被检样品(未结合的抗体)。8.标记经进液孔加入100-200ul的FITC标记的抗小鼠Ig抗体，孵育适当时间(15分钟)。9.漂洗借助微流路，用洗液流洗以去除检测板中残留的标记物(FITC-抗小鼠Ig)。10.结果分析荧光显微镜或生物芯片扫描仪等仪器观察并记录各孔荧光反应的有无对照阳性孔的排列位置或生物微球位序编码，借助计算机分析即可以确定该单克隆抗体所识别的抗原分子的组织细胞分布，或其组织细胞反应的特异性。根据荧光反应的强弱差异，可以推测不同细胞的抗原表达密度。实施例II 镶嵌式高通量细胞生物芯片在优生优育方面的应用。
真核基因和病毒蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效，而且成本低廉。然而，表达的蛋白因折叠方式不正确或效率的低下，常常活性很低，甚至没有活性。特别是蛋白的翻译后加工与修饰，原核细胞根本不能进行。风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、柯萨基病毒等是引起宫内感染并导致胎儿畸形的主要病原体；乙肝、梅毒和艾滋病等是可以通过垂直传播引起新生儿感染的传染性疾病的病原体。因此，对育龄和妊娠妇女开展上述病原体感染的检测诊断成为预防先天性畸形和新生儿感染的重要手段。在实施中具体操作步骤如下1.微载体处理细胞培养微载体Cytodex用无钙镁PBS或Hanks液溶涨，乙醇或高压消毒，用无菌的无钙镁PBS或Hanks液，培养液依序漂洗，1-5mg/ml加入培养液置培养容器中。2.生物微球的制备病毒感染细胞或基因转染细胞分别加入培养容器中与微载体充分混匀，37℃静置适当时间(10-90分钟)，使细胞附着在微载体表面，补足培养液按10-80rpm/分钟搅拌培养至所需细胞密度终止培养，其间可收集细胞计数，检测感染或转染病毒基因的抗原表达量，并视具体情况更换培养液。静置待微载体沉积后，弃上清液加入无钙镁PBS或Hanks液漂洗数次。加入固定液固定，漂洗后即获得经固定处理的，表达感染或转染病毒基因的细胞生物微球。加适当体积的含防腐剂的无钙镁Hanks液，4℃保存备用。3.镶嵌微球人工或用全自动机械手系统，将生物微球依序嵌入低密度微孔板的各微孔中。4.封盖使微孔、微槽与进/出液孔形成微流路，并只能通过进/出液孔与外界相通。5.封闭经进/出液孔用封闭缓冲液(无钙镁Hanks液含1-3％牛血清白蛋白)封闭去除微球和微流路等表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，以减少检测中可能出现的非特异性结合或吸附，由此即获得表达特异性病毒抗原的镶嵌式高通量细胞生物芯片。6.加入样品取适量体积(50-150ul)的待检者血清(含抗体)，经进液孔加入微孔板中，孵育适当时间(5-90分钟)，使抗体与细胞表面的抗原分子充分作用。7.漂洗借助微流路，用洗液流洗以去除检测板中残留的被检样品(未结合的抗体)。8.标记加入120ul的Cy3和Cy5标记的抗人IgG和IgM抗体，适当孵育(15分钟)。9.漂洗洗液流洗以去除检测板中残留的标记物(FITC-抗小鼠Ig)。10.结果分析荧光显微镜或生物芯片扫描仪等仪器观察并记录各孔荧光反应的有无，对照阳性孔的排列位置或生物微球的位序编码，借助计算机分析即可以确定该患者或被检者有无相应的病毒感染；根据Cy3和Cy5荧光强弱的差异(即抗原特异性IgG和IgM的含量与比例)以及复孔荧光强弱的变化，可以推测被检者是否处于感染的早期，以及有无传染性和机体的免疫力等。
镶嵌式细胞生物芯片把分子文库构建、分子表面展示技术、重组基因的转染与表达等通过微载体悬浮培养与生物芯片的高通量快速并行分析技术相结合，集数种技术的优点于一身，是一种全新概念的高通量生物学分析检测技术。具有信息量大、定量准确、灵敏度高、制造成本低，用途广等突出优点，可广泛用于生物学、医药学，环境科学、能源与材料科学等领域。
权利要求
1.一种可检测样品中的核酸、蛋白与化学分子等的高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒的制备方法，该技术和试剂盒至少包括下述成分或步骤；①一种检测板由微孔板和生物微球组成，微孔板由板体、板盖、微孔和微流路等结构组成；生物微球由微载体和其表面附着的不同或相同的细菌或细胞等微生物体组成，并按一定的顺序镶嵌在不同的微孔中；在一个载体表面通常只附着一种细胞；②封闭用封闭液处理生物微球，封闭或去除非特异性结合位点；③样品样品经处理或不经处理直接由进液孔进入微孔板，流经微孔时与生物微球表面细胞或微生物的各种生物分子相互作用；被检分子与固相的生物分子杂交或特异性结合并被吸附在生物微球表面；未吸附的样品成分经出液孔流出；④标记被检样品用指示性标记分子及其衍生物或标记物等进行标记；⑤漂洗用洗液或洗脱液洗脱与细胞上的生物活性分子结合或非特异结合的各种分子；⑥检测与分析对各微孔中指示性标记分子的有无、强弱或含量进行检测和分析；⑦标记物为酶时，观察结果前需加入底物。
2.根据权利要求1所述的微孔板由板体、板盖、微孔和微流路等结构组成；板体和板盖为任何可加工成型的、透光的、不透光的、反光或不反光的硬质或软质材料，可加工成方形、长方形、园盘型或其它外观形状；在板体和板盖上可分别具有微孔、微流路、驱动孔、定位孔和视窗等部分或全部结构；微孔按一定的格式排列，通过微流路与外界相通或形成闭合环路。微孔经处理表面也可附着动植物细胞或细菌等微生物体；
3.根据权利要求1所述的微载体是由任何可加工成型的材质，经加工而成的，大小均一、具有不同外观形状的多孔或实心体；微载体经处理表面可附着动植物细胞或微生物获得生物微球；各种微载体的处理至少包括以下不同方法①用多聚赖氨酸浸泡处理；②硅烷化处理；③用固相合成技术在微载体上直接合成促进细胞附着的活性肽片段；④用胶原蛋白或细胞外基质涂布微载体；⑤通过化学修饰在微载体表面形成有一定活性基团组成的表面单分子层；⑥在微载体的加工原材料中加入具有化学活性基团的材料。
4.根据权利要求1和权利要求2所述的微流路由进液孔、出液孔、微管、密封圈、蠕动管等结构组成，可分别位于板体或板盖上，也可全部位于板体或板盖上；微流路通过微管与微孔相连，并通过进液孔和出液孔与外界相通；蠕动管位于进液孔和出液孔之间，将微流路连接成闭合环路；蠕动管可位于检测板上也可以外置；蜂巢式微孔板可无微管或微槽，或也无进/出液孔等微流路结构；微流路经表面处理可获得不同的惰性表面涂层。
5.根据权利要求1和权利要求3所述的生物微球是指动植物细胞或细菌、真菌、立克次氏体、衣原体、支原体、病毒等微生物体与微载体共培养并贴附在微载体上，获得具有不同化学活性，可与样品中的被检物特异结合的生物微球；附着在微载体表面的微生物体，可用各种不同的试剂、药物、生物因子或物理因素等处理，处理可在培养器皿中分别进行或在微孔板中同时进行；微生物体也可用组织细胞固定液分别进行固定处理或在微孔板中同时固定处理，使微生物体固相化在微载体的表面；生物微球的种类和制备方法至少包括①动植物细胞在培养皿或发酵罐中与微载体共培养，在微载体表面长成单层，并融合成片；在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液；或用固定液处理固定后，用保存液彻底漂洗，去除残留固定液；②动植物细胞在培养皿或发酵罐中与微载体共培养，在微载体表面长成单层，并达到适当密度后，加入不同的药物、试剂、生物因子等分别或同时给予适当处理；在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液；加入固定液固定，保存液彻底漂洗，去除残留固定液；③细菌等与微载体共培养，待细菌在微载体表面长成单层，并融合成片，在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液，或固定液相互利固定细胞，用保存液彻底漂洗，去除残留固定液；④经病毒、噬菌体或质粒等感染、转染或转化的动植物细胞或细菌等与微载体共培养，待细胞或微生物在微载体表面长成单层，并融合成片，在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液，或加入固定液固定细胞，用保存液彻底漂洗，去除残留固定液；⑤感染、转染或转化了的动植物细胞或细菌等与微载体在培养皿或发酵罐中共培养，待细胞或微生物在微载体表面长成单层，并达到适当密度后，加入不同的药物、试剂或生物因子等分别或同时适当处理后，在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，用保存液彻底漂洗，去除残留固定液；⑥将各种细菌、细胞等微生物体配成一定浓度的悬液，与微载体共育，待附着牢固后或铺展后，在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液；或固定液处理，用保存液彻底漂洗，去除残留固定液；⑦将各种细菌、细胞等微生物体配成一定浓度的悬液，与微载体共育，待附着牢固或铺展后，加入不同的药物、试剂或生物因子等分别或同时给予适当处理；在培养器皿或微孔板中彻底漂洗去除残留培养液，或加入固定液固定细胞，用保存液彻底漂洗，去除残留固定液；
6.根据权利要求1所述的标记是指，用荧光染料、酶类、生物素、半抗原、胶体金、同位素、稀土离子及其螯合剂等指示性标记分子或其衍生物直接标记样品；或用能与样品中被检物特异性结合的、用指示性标记分子标记的标记物标记样品；标记可在试管中进行，也可在微孔板中进行。
7.根据权利要求1所述的检测方法与试剂盒，可采用下述方法进行定量分析在同一块微孔板上细胞附着的微孔或镶嵌生物微球的孔数可有1个或1个以上的复孔；当样品逐孔流经各微孔及其复孔时，对应的被检测物被不断结合，并不断地从标本液中去除，因此，各微孔及其复孔的结合量，因前后排列顺序的不同逐渐减少；根据各微孔与复孔反应的有无与强弱变化，即可进行定量分析；在进行定量分析时，可按此方法设定标准参照物，借助计算机分析绘出标准参照物浓度-反应孔数量及其强弱变化曲线，对照标准曲线结合标本体积，获得定量分析结果。
8.根据权利要求1、权利要求6和权利要求7所述的样品，可用下述方法之一进行处理①在经常规方法提取的样品DNA中，加入PCR试剂，通过至少一个循环周期的PCR反应进行延长或扩增；PCR反应循环周期包括a)加热变性；b)退火，引物与模板或样品中的靶核苷酸杂交；c)DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列；②按常规方法提取的样品RNA或mRNA，经反转录获得互补DNA，通过至少一个循环周期的PCR反应进行延长或扩增；PCR反应循环周期包括a)加热变性；b)退火，引物与模板或样品中的靶核苷酸杂交；c)DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列；③样品按常规方法提取核蛋白、胞浆蛋白或膜结合蛋白；
9.根据权利要求1和权利要求7所述的试剂盒，至少装有一块检测板，各微孔中至少镶嵌一粒微载体，各孔微载体表面分别附着相同或不同的动植物细胞或细菌等微生物体，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒①至少有一管为样品处理液；②至少各有一管为dNTP、引物和用于PCR扩增的热稳定的DNA聚合酶；③至少各有一管为引物、dNTP和反转录酶；④至少有一管为含标记分子或标记物的标记试剂；⑤在标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物；⑥至少有一管为洗涤液或其浓缩液；⑦至少有一管为蛋白质浓度检测分析试剂；⑧至少有一管为核酸内切酶或蛋白水解酶；⑨至少有一管为染色液；⑩至少有一管为电泳样品缓冲液；
10.根据权利要求1、权利要求6和权利要求9所述的检测方法和试剂盒，可以用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对样品或微孔板不同孔中各镶嵌生物微球所结合的样品成分分别做PCR、RT-PCR、基因克隆、质谱分析、序列测定、电泳等进一步分析前的处理(1)直接在感兴趣的微孔中加入PCR试剂或电泳样品缓冲液、染色液等试剂，对结合物在原位做进一步分析前的样品处理；(2)将微孔中的微载体取出，在微量反应器中加入PCR试剂或电泳样品缓冲液或染色液等试剂对结合物做进一步分析前的样品处理；(3)将新鲜样品分别与感兴趣微孔的复本生物微球或包被相同结合特性分子单体的微球共育，以同样的条件重复微孔板的操作步骤，将样品中感兴趣的成分吸附在生物微球上，充分漂洗去除未结合的样品混合物，加入PCR试剂、核酸内切酶或蛋白水解酶、磷酸酶、电泳样品缓冲液、蛋白质糖基化分析或染色液等试剂，对结合物做进一步分析前的样品处理和分析；(4)样品的PCR，RT-PCR扩增反应和标记等处理可在试管中进行，也可在微孔板中进行。
全文摘要
本发明公开了一种高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒的制备方法，该技术灵敏快速、信息量大，制造简便、成本低，可对样品中多种不同的核酸、蛋白和化学分子等同时进行检测分析。主要特征在于将附着不同细胞或微生物的微载体，分别镶嵌在检测板的不同微孔中，微孔间有微管相连，并同进/出液孔形成微流路与外界相通，样品经微流路可与附着在微载体表面的细胞或微生物所携带的生物分子杂交或结合。检测结果可用目测或仪器记录分析。本发明可广泛地用于医药研究、环境检测、疾病诊断、基因组/蛋白质组学和分子文库等领域的研究与开发。
文档编号G01N33/535GK1472339SQ0212591
公开日2004年2月4日 申请日期2002年8月2日 优先权日2002年8月2日
发明者赵翀, 赵 申请人:赵翀, 赵