专利名称：氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功试验技术的制作方法
技术领域：
医学检验，氯丙嗪法/诊断应用，血清γ球蛋白/分析。
本发明以新颖的氯丙嗪为试剂，涉及该试剂的制备方法、用该试剂简易、快速、微量分离测定血清蛋白(γ)含量，检测肝实质功能损害程度的试验技术(简称CPZ法)。
二、现有技术状况肝病对人体健康危害最大，它一直缺临床理想的诊断指标。本世纪二十年代初，前人就研究用一种试剂与血清蛋白形成絮凝(浊度)的方法作肝功试验。1960年Reiphold综述报道已研试过的各种试剂达80余种(不含盐酸氯丙嗪)，有金属和多种有机化合物，胶体等，到六十年代常用的只有少数几种，如我国有麝香草酚、锌等。此类电解质部份沉淀球蛋白，迄今未找到分离白蛋白与球蛋白的理想方法。自蛋白电泳的建立，证实凡肝病血清γ球蛋白常有增高，监测血清γ的改变，对肝功测定具有极重要的意义，更新人们对肝功试验的认识。
自1992.7国家卫生部淘汰ZnTT等352项检测法，肝功试验仅剩ALT、BIL两项，在该领域内是一项空白，至今对比研究尚未深入。据查新结果国内外未见对此项目的研究，在此之前未找到简易、快速、体外分离测定血清蛋白(γ)含量的试剂和方法。血清蛋白电泳就成唯一检测法，但电泳受条件及诸多因素影响，重复性差，测定结果(γ％)常有差异，设备贵，方法复杂(血清T.P、AIb、蛋白电泳三种联合检测法测得其含量)。以下两地化验单为当前肝功试验模式，其检出率≤50％，检测时间长(1～2天)，检测费高(40～80元/次)。
华西医科大学附属第一医院检验科生化报告单项 目 缩写测定值 单位参考范围 丙氨酸氨基转移酶(ALT)18.00 IU/L5-40
川北医学院附属医院检验科生化检验申请单代码 检验项目05050 55元 肝功1(ALT+AST+AIP+TP+ALB+CLB+TBIL+DBIL+GGT+LDH)05051 45元 肝功2(ALT+AST+ALP+TP+ALB+GLB+TBIL+DBIL)05052 35元 肝功3(ALT+AST+ALP+TP+ALB+CLB)05061 30元 血清蛋白电泳上单用美国贝克曼Cx7型生化分析仪(100万/台)测肝功，其项目仅增加四种酶，此类酶测定在肝功试验中特异性差，较ALT临床意义小。
a.酶(ALT)测定酶活性增高是细胞受损的速率，而不是受损程度的指征。特异性与稳定性差，测定结果常有差异。急性肝病酶可升高，慢性肝病(伴感染外)酶活性趋于正常或降低，基层(地区以下)仅作酶一项，病人受害。
b.血浆蛋白测定①白蛋白与球蛋白(除γ外)由肝细胞合成(先天产生)，白蛋白半寿期20～26天，肝代偿力强，故肝病早期可无明显改变，只有当肝损害达到一定程度和病程后血清T.P、AIb、A/G的改变才有意义，而临床上最重要的问题是肝病的早期诊断。②白蛋白与球蛋白PI相近(a15.66，a25.06，β5.12)，迄今未找到分离白蛋白与球蛋白的理想方法。1971 Doumas提出溴甲酚氯法(BCG)，反应式pH4.2＜白蛋白与球蛋白PI(a1a2β)，距白蛋白PI较近(0.68)，慢反应有球蛋白(γ外)，测定结果常有差异。
本项与国内外已有的同类技术全面综合对比情况肝病早期体征多缺乏特异性，临床症状表现不明显，常依靠肝功测定，血清γ增加与肝实质损伤的范围和程度相平行。综上所述，目前肝功测定项目检出率低，本项用于体外测定血清γ含量，同时具有敏感、特异、简易、快速、微量等特点的诊断指标。通过Maclagan标准曲线推算出一个单位的常数值，其推算值与当今公认的价值最大的蛋白电泳无显著差异，有较好的相关性(P＜0.001)。本项对324例病人与蛋白电泳测定血清γ比较分析，结果表明CPZ法的敏感性、准确度，特异性均高(＞95％)，故对肝病的诊断具有很高的实用价值。肝穿病人常不易接受，痛苦又不安全。
同国内外检测法相比较，CPZ法将传统式的用无机沉淀蛋白质的阳离子为有机的阴离子，盐酸氯丙嗪是理想的γ球蛋白沉淀剂，其pH5.8～6.0与球蛋白PI相近，氯丙嗪是较好配位剂的有机显色剂，其选择性和灵敏度高，干扰因素少(CPZ法对Hb CE0.02329＜Eu0.3＜0.5)。加入适量的醋酸铵作缓冲剂使体系的pH稳定，确保测定的可靠性，故是当今检测肝病最理想简易的方法。
本发明的目的在于提供一类新的具有检测价值的氯丙嗪试剂。
本发明的另一目的是提供一种由氯丙嗪组合的本发明试剂的方法。
本发明进一步的目的是提供一种简易、快速、敏感、特异测定血清蛋白(γ)含量的试剂和方法，检测肝实质损害程度及临床理想的诊断指标。作肝病的诊断，转归，疗效的观察，健康群体肝病的筛查和早期诊断，恶性瘤早期预测。
本发明的另一目的是提供上述试剂分离血清蛋白(γ)在预防、治疗病毒性肝炎的用途。
发明人由盐酸氯丙嗪注射液(chlorpromazini HCl)组成一种新的试剂，该试剂具有多种有价值的生化特性，这些特性是现有化合物所不具备的。
本发明新的氯丙嗪试剂用下述通式(1)表示其中CPZ表示氯丙嗪。
本发明试剂由盐酸氯丙嗪注射液组成，该方法包括以下步骤a.将盐酸氯丙嗪注射液(chlorpromazimi HCl)加入蒸馏水中，所述蒸馏水必须新鲜或冷却煮沸过；b.上液，向其中加入醋酸铵(NH4Ac)缓冲剂，除此缓冲剂不得加入任何电解质；c.CPZ试剂pH5.8～6.0；d.置棕色瓶内保存。
本发明新的测定血清蛋白(γ)含量的CPZ法，该方法包括以下步骤a.定量血清，向其中加入CPZ试剂，置室温10min；b.测吸光度，用721型分光光度计，波长650nm，测得各管吸光度查标准曲线即得单位数；c.计算方法，单位数×常数(1.5108765g/L)＝γg/L。
本发明新的分离血清蛋白(γ)的CPZ法，该方法包括以下步骤a.制备CPZ法沉淀物；b.定量血清，向其中加入CPZ试剂，置室温10min；c.离心，弃去上清液，用CPZ试剂充分洗涤，解聚；d.作醋纤膜电泳和免疫单扩法分析；e.以0.85％NaCl为解聚剂。
三、本技术方案的效果发明人发现本发明试剂分离血清(γ)球蛋白，对肝病具有预防、治疗作用，并增进肝脏解毒和免疫功能的肝保护剂。
本发明试剂测定血清蛋白(γ)含量，在临床检验中显示出优异的对早期肝病的诊断作用，疗效观察，转归，恶性瘤早期预测的作用，它比目前美国生化仪测定肝功，蛋白电泳，肝穿作病理观察效果好。
本发明试剂，简易、快速(10min)、敏感、特异检测肝功，特别具有健康群体肝病的普查和筛选作用。
本发明用醋纤膜电泳及免疫单扩法证实肝实质损害是以IgM(急慢性)、IgG(慢性)为主的Ig的增高，这说明免疫反应是致肝脏病变的重要因素(继发性良性无性细胞系Ig血症)，是B淋巴细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞的分泌产物。血清中相对恒定的各种Ig含量的异常，即血清蛋白(γ)增高，血清蛋白电泳时，Ig抗体活性主要在γ球蛋白部位。病原(病毒、有害物)→刺激肝脏_Ig细胞异常增殖→Ig增高(后天产生，不受肝代偿力的影响)→肝病变。因产生Ig的无性细胞系的浆细胞发生增殖，故在病人血清中检出异常增高的1-2种或以上的异常Ig(此Ig的结构是均一性的，抗体活性极低)，称M蛋白(M成份)。IgM是最大的Ig(巨球蛋白，分子量19万，沉降系数19s)，血清M成份随肝病治愈而逐渐消失，即血清γ球蛋白降低或正常。
血清γ球蛋白持续异常增高1～5年疗效不显时，预示有恶性瘤产生。因产生Ig的某一无性细胞系发生癌性增殖(恶性无性细胞系Ig血症)，单无性细胞系常见多发性骨髓瘤等，多无性细胞系多见恶性淋巴增生性和恶性浆细胞病。
乙肝病人血清γ球蛋白异常增高，预示血清DNA、HBeAg阳性(DNA主存地)，在乙肝持续感染中，乙肝病毒DNA同化到肝细胞DNA中，可发生肝癌，故血清γ异常对乙肝转归，肝癌发生有预测作用。
本发明化合物简易而理想分离γ球蛋白的方法，对肝病提供新的治疗途径(不用肝脏解毒)，并增进肝脏免疫功能。据国外医学报导，有关各种剂量的γ球蛋白在防治传染性肝炎上的应用。作者在莫斯科以1％和10％γ剂量为1ml，无显著差别，以1％制剂对12岁以下儿童预防接种，效果更明显。
本发明临床效果好，应用前景广阔，经我地(92-97.7)和贵州乙肝专科医院(94.10)多年临床验证，检测数万例病人取得明显的效果和临床医生的信赖。就该方法的试验条件及良好的临床效果讲，是一种极具推广价值的方法，特别是试验条件较差的基层和偏远地区。
本发明的经济和社会效益显著①本项目成本低(0.3元试剂检测333人)，按每年我国1亿人(学生、兵、干部)作体检查肝功、成本费100万元，以本发明有效价值最低收费10～16.5元/每人，即可创收1～1.65亿元，故开发本技术对群体健康普查和肝病的筛选，必取得可喜的经济和社会效益。
②本发明CPZ法早期诊断肝病。达到早诊早治，减少死亡率，提高民众健康水平，有很好的社会效益。
四、本方案的技术特征
A.采用的技术原理蛋白质亲水胶体所固有的二个稳定因子，即颗粒表面的水化层和电荷。加入脱水剂，调节pH至等电点，除去二个稳定因素，蛋白质凝集而析出。γ球蛋白分子量最大，带电荷最少，利于沉淀形成。水化作用是蛋白质稳定不沉淀的主要因素，而球蛋白的水化作用强。根据难溶化合物KsP值的不同，控制沉淀条件(种类和浓度)，选择有机沉淀剂盐酸氯丙嗪液，对水的亲和力大，易破坏蛋白质水化层，改变浓度为100mg/L，使蛋白质沉淀分离完全。pH对球蛋白水化作用影响大，在等电点时分子呈电中性，水化作用最弱，溶解度最低。本测定pH5.8～6.0与球蛋白PI相近，小于γ而大于其它球蛋白PI(α1，α2，β)。距γPI远(1.3～1.5)，荷电量大，易导致胶体稳定性试验阳性。反应式在此条件下，γ带正电且别的球蛋白带负电荷，与阴离子氯丙嗪相结合，盐酸氯丙嗪的盐析作用及分子的特殊化学结构，以范德华力使血清蛋白溶解度降低，氯丙嗪分子中有电负性较强的氯和氮原子，其上有未成对的n电子，苯环上有大π键的电子云，这些易与分子量最大的γ相结合形成稳定的复合物，此种变化的程度与血清蛋白(γ)的质和量相关，测定该复合物浓度即可推测肝实质损害的程度。
(1)盐析作用盐析力主要与离子的种类相关，特别是阴离子的作用，本法以含有盐酸的氯丙嗪液作试剂，加入适量的醋酸铵作缓冲剂，盐酸氯丙嗪液含有＞4CH2COO-＞5Cl-两种盐析力较强的阴离子，增强了盐析力。
(2)加入的沉淀剂与γ的生成物能否析出，溶解度起决定性的作用。范德华力是决定物质溶解度的重要因素，取向力和诱导力可发生在氯丙嗪与γ球蛋白这两种极性分子之间，使球蛋白溶解度降低而沉淀。
(3)盐酸氯丙嗪分子的特殊化学结构(分子的极性强)，所含HCl是一个极性分子，电子云偏向氯原子一边，形成一个偶极子 成键两原子的电负性差值大(0.9)，共价键的极性大。原子的电负性越大，吸引电子的能力越强，生成阴离子的倾向性越大，氯丙嗪分子中有电负性较强的氯和氮原子(电负性3)，硫原子(2.5)。
(4)氯丙嗪属苯稠杂环化合物，其结构特点是组成环系的碳原子和杂原子以sp2杂化轨道参与成键，分子中未成对的n电子(s.p)形成苯环大π键体系，所形成的大π键电子云具有较大的流动性，易发生极化而变形，活动性大，电子云能量较高，化学反应活跃。
(5)氯丙嗪是较好配位剂的有机显色剂，分子的特殊化学结构，如两个取代基(2.10)，卤代基即助色团 等，此有机显色剂又是配位剂，可与γ生成稳定具有特征颜色的复合物，其选择性和灵敏度高。
B.关键技术及创造点(技术实质，创造性的贡献，最佳措施等)本项目的技术关键(1)全面、准确地对健康人群调研与实验测量，归纳找出正常参考值范围1.407～5.817(X＝3.612，S＝1.125)，与ROC曲线6.5U/L相近；(2)全面分析血清球蛋白检测法的各种状况，提出反映实际情况的数学模型；(3)确定试验方法，在最大程度上减少理论与实际数据的偏差，确保方法的可靠性及敏感性；(4)与标准诊断法及方法学进行评价批内CV2.2～3.7％，批间CV4.2％。敏感度97.6％，准确度95.4％，特异性94.6％。
本项目的创造点(1)首次开发出CPZ法对肝功试验的表达价值，用醋纤膜电泳及免疫单扩法证实生成物为γ球蛋白，即肝实质损害是Ig的异常(IgM＞IgG＞IgA)。
(2)以胶体化学理论阐明了测定机理，在理论上有新的发展，为肝功试验开辟新的途径。
(3)优选出对γ亲和力高，特异性强的亲和剂和缓冲剂，用含有盐酸的氯丙嗪液作试剂，以适量的HAc-NH4Ac作缓冲剂确保方法的可靠性及科学性，较当今肝功试验先进。
(4)根据Maclagan标准曲线推算出一个单位相当于γ1.5108765g/L的常数值，其推算值与蛋白电泳无显著差异，有较好的相关性，为简易快速测定γ提供一项有实用价值的新技术。
(5)在临床应用上主要成果有①从相关分析中，首次与蛋白电泳对照分析，阐明CPZ法与血清蛋白电泳呈显著正相关的论点，促进了血清蛋白研究工作的迅速发展。②三种肝功试验与蛋白电泳对照分析，揭示了传统式的TTT、ZnTT测定的本质，证实了这类方法的不完全性。③与标准诊断法及方法学评价的探讨，证实了CPZ法的精密度、准确度、特异性均达当今同类先进测定水平，具有快速、微量、敏感、特异等特点。④本试剂易得，成本低廉，适用于各级医卫单位肝功常规检测。⑤简易而理想分离γ，为肝病的防治提供一项新技术。
本项目的最佳措施(1)以含有盐酸的氯丙嗪液作试剂，加入适量的醋酸铵作缓冲剂，选择性和灵敏度高。(2)试剂避光保存(置棕色瓶内)，防氧化。(3)pH5.8～6.0与球蛋白等电点相近，γ带正电荷(PI＝6.58～7.5)效果最好。(4)选择终时间10min，终浓度100mg/L，不同的蛋白质盐析时所需盐析剂的浓度不同，根据实验当改变浓度为200mg/L的盐酸氯丙嗪液，过多的沉淀剂使沉淀溶解度反而增加不沉淀，使用100mg/L其pH与球蛋白PI相近，提高了灵敏度。且盐类中带相反电荷的离子，能降低球蛋白的稳定性，加入适量醋酸铵作缓冲剂使体系的pH值稳定。确保测定的可靠性。
C.CPZ法测定血清蛋白(γ)含量的肝功试验血清氯丙嗪试验(Chlorpromazine test)测定原理肝实质病变时血清蛋白发生质和量的改变，γ球蛋白升高，氯丙嗪与γ球蛋白生成难溶性的复合物。盐酸氯丙嗪因盐析作用，分子的特殊化学结构以范德华力使血清蛋白溶解度降低。氯丙嗪分子中有电负性较强的氯和氮原子，其上有未成对的n电子，苯环上有大π键的电子云，这些易与分子量最大的γ球蛋白结合形成稳定的复合物。本测定的pH值为5.8～6.0，小于γ而大于其它球蛋白的等电点，在此条件下，γ球蛋白带正电荷且别的球蛋白带负电荷，这就是γ球蛋白能与氯丙嗪相互作用而别的球蛋白不作用的主要依据。因此在一定条件下其生成物的浓度与血清蛋白的质和量相关，测定该复合物的浓度即检测肝实质损害的程度(盐酸氯丙嗪结构式附
图1)。
试剂1.100mg/L盐酸氯丙嗪溶液(pH5.8～6.0)，避光存放，4℃冰箱保存半年。
2.48.1mmol/L BaCl2溶液，BaCl22H2O 1.175克溶于蒸馏水中稀释至100ml。
3.0.1mol/L H2SO4(经标准NaOH标定)4.2mol/LNH4Ac方法1.准确吸取血清50μl与100mg/L盐酸氯丙嗪液3ml，用棕色可调定量加液器置试验管中，混合摇匀，置室温10分钟后，用721型分光光度计，波长650nm，10mm光径比色器，以蒸馏水为空白调零，读取各管吸光度，查标准曲线即得。
2.标准曲线按Maclagan氏麝香草酚试验方法制备系列硫酸钡标准比浊管(BaSO4液1.295mmol/L相当于20个单位)，用分光光度计测得其吸光度制备标准曲线。TTT法的坐标曲线可直线化，易准确获得。
3.计算方法测得吸光度查标准曲线即得单位数，本法规定CPZ试验1麦氏单位相当于γ球蛋白为1.5108765g/L等于Maclagan氏1单位，正常值1～6.0麦氏单位。(单位数×1.5108765g/L＝γ球蛋白g/L)
4.计算推算公式γ球g/L＝测得单位×1.51g/L①标准曲线的实验值0.001295mol/L BaSO4液相当于20个麦氏单位(1单位相当于0.00006475mol/L)②(BaSO4分子量233.34)BaSO4mol/L=0.0481×3×10-2×5.1×10-3(5.4+0.6)×10-3=0.0012987mol/L]]> 则1单位相当于γ-球g/L＝BaSO4mol/L×分子量×100＝0.00006475×233.34×100＝1.5108765g/LD.最佳实验条件的选择100mg/L盐酸氯丙嗪液的制备(1)盐酸氯丙嗪溶液(100mg/L)，精确吸取盐酸氯丙嗪注射液(50mg/2ml)4ml，溶于新鲜或冷却煮沸过的蒸馏水中准确稀释至1000ml。
(2)盐酸氯丙嗪液pH5.8～6.0与球蛋白的PI相近，从实验中pH位于平台区，pH＞7反应迟钝，pH＜5.8反应过敏。用2mol/L CH3COONH4(称取醋酸铵77.8克溶于蒸馏水稀释至500ml)调节pH，无pH计指示时，可用商品甲基红作指示剂(pH范围4.4～6.0无锡长安中心仪器厂)。在1升氯丙嗪液中加入0.7ml此液，若pH＞6用2mol/L的醋酸(100ul)调节置棕色瓶内放4～6℃冰箱保存，室温中避光(防氧化)出现淡红色应弃去，温度10～30℃为宜。
(3)本文讨论了氯丙嗪的浓度对试验结果的影响，配制适当浓度的氯丙嗪使pH接近于球蛋白的等电点，提高了测定的灵敏度，测定时加入适量的醋酸铵作缓冲剂，确保体系的pH值稳定，提高了测定的可靠性。少量的电解质对生成物的形成有影响，本试验除醋酸铵外，不得加入任何电解质。
(4)本法选用终浓度100mg/L的氯丙嗪液，测定终时间为10min。用实验统计分析法证明浓度的选择分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L的盐酸氯丙嗪液作测定，以100mg/L和选择的测定时间10分钟相同，即测定值同均值与95％正常范围接近，准确度和精密度都高，测定值集中，由此看出选择的测定时间和浓度的合理性。
(5)血清应新鲜或放冰箱，CPZ试剂是一种有机沉淀剂，选择性高吸附的杂质少，控制选择剂的浓度是消除干扰的重要方法。因此溶血、黄疸基本无影响，乳糜血清作样品空白，血清50μl+0.9％NaCl 3ml混匀，从样品中减去所测结果。
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明后面结合图示及实施例对方案作更详细的说明图1为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的盐酸氯丙嗪结构式；图2为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ物对照血清电泳图谱和扫描曲线；图3为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ法电泳图谱和扫描曲线；图4为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ物血清免疫球蛋白单扩散结果；图5为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ法的标准曲线；图6为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ法选择反应终时间示意图；图7为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ法的概率单位；图8为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ法反应时间曲线图；图9为氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功能试验技术的CPZ法的OCV图；实施例1一、本发明分离血清γ球蛋白及对肝功能试验表达价值的实验研究实验(1)CPZ物血清蛋白醋纤膜电泳及相应的扫描分析制备球蛋白液取肝病血清(以A/G倒置为宜)200μl与100mg/L盐酸氯丙嗪液3ml置试管中，混匀置室温10min，2000转/min离心15min，弃去上清液，对沉淀物重复以上步骤洗涤5次，弃上清液加0.85％NaCl 5μl溶解，作电泳和扫描分析。改变CPZ物浓度，用200mg/L作试验，过多的沉淀剂使沉淀溶解度反而增加不沉淀。
采用CPZ物与肝病血清生成物经充分洗涤，解聚进行电泳和扫描分析；证实所得沉淀的球蛋白鉴定为γ球蛋白，而不含其它杂蛋白，其电泳图谱及扫描见附图2、图3；(2)CPZ试验血清免疫球蛋白(Ig)单扩法的分析检测人血清Ig约占机体蛋白总量的20～25％。γ区域含量最高的是Ig，检测CPZ法人血清中的IgG、IgA、IgM抗体作鉴定生成物为γ球蛋白重要的指标。
(1′)制备CPZ法沉淀物取空腹血清TP 75.9g/L，G 30.9g/L，peak(05)pel 21.7％与CPZ物生成物经充分洗涤后，集多份沉淀物溶解进行测定。
(2′)材料彩色免疫单扩板(重庆医学检验试剂研究所)。
(3′)单扩法A.取沉淀液10μL分别注入IgG、IgA，20μL注入IgM板各孔内。
B.将已加样的彩板水平放于湿盒内，37℃孵箱中，测IgG、IgA扩散24小时，IgM扩散48小时。读取沉淀环直径mm，查同批号的回规表，测得IgG 1.06g/L，IgA 0.15g/L，IgM 1.12g/L。免疫单扩散结果见附图4的上排1′、2′、3′三孔对照IgA.IgM.IgG.扩散图。下排对应三孔为CPZ法IgA.IgM.IgG扩散图，如图所示，IgM较对照圈大，显示γ区域内IgM改变明显。
(3)非肝病A/G倒置CPZ在正常范围内，※(作γ％正常，在1.5:I I:10.5:1时)分别用血清50μl与试剂3ml作用，测定值在正常范围内，说明随球蛋白质而改变。取正常或肝病血清测定，(当血清为0.05，0.1，0.15，0.2ml)CPZ值随血清量的增加而升高。
※(g/LT 44、G 28.9、γ10.1)二、确定CPZ法终浓度和终时间与正常参考值范围的研究；建立本试验方法的研究将有效试剂盐酸氯丙嗪液稀释不同的比例，与同样份数的血清标本作测定进行效果分析，确定试验的终浓度为100mg/L盐酸氯丙嗪液，其pH与球蛋白PI相近，提高了灵敏度。根据所选试剂浓度与不同时间作同样份数的血清标本测定效果分析，确定本试验终时间为10min，建立本测定方法，用本法作健康人群调查，确定正常参考值范围(1.407～5.817)，通常1～6个单位(X＝3.612，S＝1.125)。
(一)材料和方法1.盐酸氯丙嗪注射液50mg/2mL，商品试剂，西南制药三厂出品，批号8604032.生化常规实验器材，721型分光光度计，可调定量加液器等3.方法待检血清0.05ml加入100mg/L盐酸氯丙嗪液3ml置试管中，混匀置室温10min后，以蒸馏水调零，用721型分光光度计，波长650nm，读取各管吸光度查标准曲线即得(曲线按Maclagan氏法制备，附图5)。
(二)试验与结果1.反应时间与氯丙嗪液浓度的选择用17份血清与100mg/L氯丙嗪液在5、10、20、30(min)试验，分别表示不同时间与吸光度区间关系，如附图6所示说明比浊时间对结果有干扰。图上1′.表示95％正常范围(真值)，X值；2′.表示5min均值与真值差距大，准确度精密度都低，测定值集中；3′.表示10min均值与真值接近，准确度和精密度高，测定值集中；4′.表示20min均值与真值差距较大，准确度低，精密度高，测定值集中；5′.表示30min同上，精密度更高，测定值部分密集。
同理氯丙嗪浓度的选择以50mg/L、100mg/L、200mg/L的氯丙嗪液作测定，故本法选用试验终浓度100mg/L氯丙嗪液，终时间10min。
2.方法线性分析正常参考值，用本法测定100名(男76，女24)正常成年人CPZ(麦氏单位)作统计分析。
①100名正常成年人氯丙嗪(麦氏单位)正常范围估计本试验数据分布表表1 本地100名正常成年人CPZ(麦氏单位)分布
②正态分布检验(附图7)图上交点连线近似直线，可以认为资料分布服从正态分布。
③计算的数和标准差易算得X＝3.612(麦氏单位)s＝1.125(麦氏单位)④估计正常值范围双侧95％正常值范围，α＝0.05，μ0＝1.960，则95％的正常范围是(X-1.960s，X+1.960s)＝(1.407，5.817)(麦氏单位)，即本地正常成人CPZ 95％正常范围为1.407～5.817(麦氏单位)。
正常参考值用本法测定100(男76，女24)正常成年人，CPZ(麦氏单位)经统计分析其参考值范围1.407～5.817(单位)(X＝3.612，s＝1.125)，通常1～6单位。
测定线性范围，0～20U/L用等渗盐水将高含量的(γ)血清标本，作系列稀释后用本法测定其线性范围，结果所示，当(γ)高于20麦氏单位时已不存在线性关系，若遇此情况，可用等渗盐水将血清稀释后再测。
3.受试者工作曲线(Receiver Operating Curve)在分析324例病例中(门诊168，住院156)，用醋纤膜电泳与CPZ法在5个正异分界点的6.5(麦氏单位)，检测血清γ球蛋白结果如下 (1)敏感性的测定在上表中按照标准诊断法确定的病例数为a+c＝82，用诊断性试验确定的病例为a＝80，故CPZ法在确诊病例中的阳性比例为a/a+c，即敏感性＝a/a+c＝80/82＝97.6％。
(2)特异性的测定在上表中，CPZ法能正确排除疾病的比例为d/b+d，即特异性＝d/b+d＝229/13+229＝94.6％。
(3)阳性预检值a/a+b＝80/80+13＝86％。
(4)CPZ法检测血清蛋白(γ)的ROC曲线结果比较如表2
正异分界点敏感性％特异性％阳性预检值％6g8.2 98.696.86.2 90.697.490.66.3 92.496.691.46.5 97.694.6867.1 98.794 84.9从上表中CPZ法的ROC曲线在6个单位分界点的敏感性88.2％，特异性与阳性预检值高(＞95％)。其余各分界点敏感性＞90％，特异性＞94％。以6.5单位分界点的敏感性97.6％及特异性94.6％均高，阳性预检值＞85％。因此CPZ法的ROC曲线参考值范围1～6.5(单位)，与正常参考值范围1～6单位相近。
实施例2一、CPZ法的可靠性分析研究113例血清蛋白电泳与CPZ法对照分析从南充地方医院住院84例(外科15、儿科1，其余为传染与内科)，门诊29例，肝病与其它作蛋白电泳人员中两种试验结果比较，以蛋白电泳三种联合检测法的测定值与CPZ法测定推算值之间相关分析得CPZ相当γ 蛋白电泳γX Y∑X＝1431.4 ∑Y＝1437.7∑X2＝20214.11 ∑Y2＝20549.3∑XY＝19439.41Σ(X-X‾)2=ΣX2-(ΣX)2n=20214.11-(1431.4)2113=2082.19885]]>Σ(Y-Y‾)2=ΣY2-(ΣY)2n=20549.3-(1437.5)2113=2257.43018]]>Σ(X-X‾)(Y-Y‾)=ΣXY-(ΣX)(ΣY)n=19439.41-2057923.78113=1227.696]]>Y=Σ(X-X‾)(Y-Y‾)Σ(X-X‾)2·(Y-Y‾)2=1227.6962082.19885×2257.43018=0.5663]]>用七检验法，说明相当γ和蛋白电泳γ呈直线关系。①建立假设和确定α水准
H0两变量无直线相关关系，即p＝0H1p≠0α＝0.05②计算t值tr=r1-r2n-2=0.56631-(0.5663)2111=7.2390]]>③确定P值本问题自由度γ＝n-2＝111，查t值表，得t0.001，100＝3.390t0.001，200＝3.340，而令tr＝7.2390，则tr＞t0.001，100＞t0.001，200故P＜0.001④推断结论按α＝0.05水准，拒绝H0，接受H1。又由γ＝0.5663＞0，可以认为相当γ和蛋白电泳γ之间呈正的直线关系。
以上经非参数统计分析证明两种测定(血清γ)方法相符合，但测定值不尽相同，实验证明CPZ法特异性较蛋白电泳高(P＜0.001)。因带电的蛋白质胶体颗粒在电场中，向与蛋白质电荷相反的一极移动， 决定各种蛋白质相对游动速度的因素较多，主要是净电荷量(即PI)，距等电点愈远，荷电量愈大，与蛋白质质点的大小也有关。在pH8.6离子强度0.1的条件下，白蛋白分子量(6.9万)与PI(4.88)最小，带电荷多，泳动速度最快，纸上电泳通过的距离最长，沿途有丢失—拖尾现象。而γ分子量(15.8～30万)与PI最大，γ通过的距离最短，分子间的相互作用，γ可拾得丢失的白蛋白而比实际的含量略高。蛋白电泳在离子强度较高时，α1与白蛋白分离较好，而其它常分离不清。从20例TTT(非β)和CPZ(γ)异常，而电泳γ值差异较大，说明有可能非β类脂蛋白与γ的分离相互有干扰。
二、CPZ法干扰因素的分析研究(一)用可信区间判断指标确定恒定误差是否可接受恒定误差(CE)由干扰实验检测，用9份血清与同样份数不同程度的(轻、中、重)溶血标本，分别与100mg/L，盐酸氯丙嗪液作试验，本干扰实验结果的数据如下表
表3 CPZ测定(γ-球)干扰实验的结果数据
(1)计算平均干扰d，标准差Sd及标准误Sdd＝0.045344Sd＝0.037188Sd＝0.011849(2)计算恒定误差的90％可信限(双侧)的上限(CEu)和下限(CEi)值。
本例自由度n′＝n-1＝8，查t值表，得′0.10(8)＝1.860CEu＝|d|+′0.10(n′).Sd＝0.045344+1.860×0.011849＝0.06738314CE(i)＝|d|-′0.10(n′).Sd＝0.045344-0.02203914＝0.02329486(3)将上CE和Ea值作比较据文献资料的性能指标，(白)球蛋白(XC)3.5g/dL，Barnett(0.5)，cotlove(0.3)CEu＜Ea，即0.06738＜0.3＜0.5CEi＜Ea，即0.02329＜0.3＜0.5因此，从方法比较实验检测得到的误差在可接受的低水平，即血红蛋白基本无影响。
(二)CPZ法与血红蛋白、血浆游离血红蛋白对光吸收的分析研究CPZ物对波长650nm附近的红色光有最大吸收，而对其它的光吸收很少，可以滤去血红蛋白对540nm，血浆游离血红蛋白524nm(绿色光)强烈的吸光性，使测定结果更稳定。
(三)本法氯丙嗪纯品来源困难，使该法推广应用受到限制，研试中采用易得的国产盐酸氯丙嗪注射液作试剂。在试剂配制中必须选择与球蛋白PI相近的pH值，使测定取得了满意的结果。同样氯丙嗪色原测定血浆游离血红蛋白，采用盐酸氯丙嗪注射液(北京永康制药厂)，效果仍然满意，故盐酸氯丙嗪注射液不受生产单位和批号的影响。
(四)CPZ法反应时间影响的分析(附图8)从图上反应的时间曲线示例，CPZ法测定γ球蛋白应处于线性期内进行，因此必须避开曲线上的延滞期，测定反应10min内的2′，5′，8′这三个点均在延滞期内，使测定结果偏低。10～30分钟，在直线期内进行测定，线性分散度较窄，对测定结果影响较小，10min曲线说明反应处于线性期，曲线分散度窄，灵敏度高，故反应终时间为10min。
实施例3(一)CPZ法与标准诊断法的对比评价在南充地方医院324例病人中(门诊168、住院156)，用全自动生化分析仪测定血清总蛋白(双缩脲法)，白蛋白(溴甲酚绿法)，醋纤膜电泳与CPZ法检测血清γ球蛋白的结果如下 1.敏感性的测定在上表中，按照标准诊断法确定的病例数为a+b＝102，用诊断性试验确定的病例为a＝90，故CPZ法在确诊病例中的阳性比例为a/(a+c)，即敏感性＝a/a+c＝90/102＝88.2％2.特异性的测定在上表中，CPZ法能正确排除疾病的比例为d/b+d，即特异性＝d/b+d＝219/3+219＝98.6％
3.准确性的测定经CPZ法检测后，真阳性(a＝90)与真阴性(d＝219)占总例数的比例即准确性＝(a+d)/(a+b+c+d)＝(90+219)/(90+3+12+219)＝309/324＝95.4％4.其它指标(1)阳性预检值＝a/a+b＝90/90+3＝96.8％(2)阴性预检值＝d/(c+d)＝219/12+219＝94.8％5.讨论(1)CPZ法阳性预检值较高(96.8％)，对检测血清γ球蛋白改变的肝功能试验意义大。
(2)CPZ法检测血清γ球蛋白的准确性(95.4％)与敏感性(88.2％)均高，故是临床理想的方法，本法简便、快速，利于人群中对肝病的普查工作，值得应用推广。
(二)CPZ法的方法学评价实验(一)重复性实验CPZ法测定血清γ球蛋白的OCV，所得结果如下8.9、8.8、9.1、8.9、8.6、8.9、9.1、8.8、8.9、9.1、8.9、8.9、8.6、8.9、8.8、8.9、8.9、8.8、8.9、8.9(麦氏单位)1.计算X＝8.88 SD＝0.132CV=SDX‾=1.49%]]>即CPZ法检测血清γ球蛋白的OCV为1.49％。
2.测出血清的OCV结果如下X＝8.88，SD＝0.132 2SD＝0.264 3SD＝0.396X±2SD8.88+0.264＝9.14 8.88-0.264＝8.615X±3SD8.88+0.396＝9.276 8.88-0.396＝8.4833.OCV图的绘制(附图9)OCV控制结果在X周围的分布是满意的。
单位西南石油学院医院日期1995.6.15～6.25试验项目血清γ球蛋白方法CPZ法仪器型号721血清来源病人标本X8.88SD0.1322CV1.49％4.方法的精密度(1)批内精密度分别从两份(γ)不同的血清中各取10份平行样品进行测定，结果见下表。(样品1为低含量，样品2为高含量)表4 CPZ法批内精密度试验
(2)批间精密度，取混合血清一份，分10次测定，每次平行测定2次，求其均值，结果X＝6.3，SD＝0.267，CV＝4.2％。
(二)干扰实验1.制备样品无黄胆混合血清。
A.0.9ml血清+0.1ml蒸馏水(基础样品)。
B.0.9ml血清+0.1ml 5mg/dl胆红素标准液(干扰实验样品)。
C.0.9ml血清+0.1ml 20mg/dl胆红素标准液(干扰实验样品)。
2.本干扰实验结果如下表。
表5 CPZ法测定血清(γ-球)干扰实验结果
干扰实验用CPZ法测定，所有样品均作双份平行测定取平均值，结果说明1mg/dl胆红素约使(γ-球)测定结果增加约0.025单位，正常人参考值总胆红色素0.1-1mg/dl，可使血清(γ)测定带入约0.025单位或更低的误差，在临床上无意义，即黄胆基本无影响。
(三)据上资料血清γ球蛋白测定方法比较实验结果，说明CPZ法的精密度、准确性符合临床实验要求，重复性与特异性好，干扰因素少。
权利要求
1.一种氯丙嗪分离测定血清蛋白(γ)的肝功试验技术，其特征是将盐酸氯丙嗪注射液加入蒸馏水中，再向其中加入适量醋酸铵缓冲剂，使该试剂的pH为5.8～6.0，此液简称CPZ试剂；以CPZ试剂分离血清γ球蛋白；以CPZ试剂测定血清蛋白(γ)含量的肝功试验技术，检测肝实质功能损害程度的CPZ法。
2.根据权利要求1所述试验技术，分离血清γ球蛋白的方法包括以下步骤a.制备CPZ法沉淀物；b.定量血清，向其中加入CPZ试剂，置室温10min；c.离心，弃去上清液，用CPZ试剂充分洗涤，解聚；d.作醋纤膜电泳和免疫单扩法分析；e.以0.85％NaCl为解聚剂。
3.根据权利要求1所述试验技术，测定血清蛋白(γ)含量的方法包括以下步骤a.定量血清，向其中加入CPZ试剂，置室温10min；b.测吸光度，用721型分光光度计，波长650nm，测得吸光度查标准曲线即得单位数；c.标准曲线按Maclagan氏TIT法制备；d.计算方法，单位数X常数(1.5108765g/L)＝γg/L。
4.根据权利要求1所述试验技术，其特征是加入的蒸馏水为新鲜或冷却煮沸过；制备的CPZ试剂，盐酸氯丙嗪的浓度为100mg/L。
5.根据权利要求1所述试验技术，其特征是加入的缓冲剂除醋酸铵外，不得加入任何电解质。
6.根据权利要求2-3所述方法，分离测定血清蛋白(γ)含量，检测肝实质功能损害程度，在肝病的诊断、预防、治疗病毒肝炎，疗效观察，恶性瘤早期预测中的应用。
全文摘要
本发明以新颖的氯丙嗪为试剂，涉及该试剂的制备方法，用该试剂简易、快速、微量分离测定血清蛋白(γ)含量，检测肝实质功能损害程度的CPZ法。其技术特征是将盐酸氯丙嗪注射液加入蒸馏水中，向其中加入适量醋酸铵缓冲剂，使该试剂的pH为5.8～6.0，此液简称CPZ试剂；取定量血清，向其中加入CPZ试剂，置室温10min，用721型分光光度计，测得吸光度查标准曲线，即得单位数乘常数测得血清(γ)含量；用醋纤膜电泳及免疫单扩法证实肝实质损害物是以IgM、IgG为主的Ig的改变，即血清γ增高。此法在肝病的诊断、预防、治疗病毒肝炎，疗效观察，恶性瘤早期预测中应用。
文档编号G01N33/52GK1469127SQ0213417
公开日2004年1月21日 申请日期2002年11月26日 优先权日2002年11月26日
发明者郝士瑛, 罗先海 申请人:西南石油学院