专利名称：鼻咽癌分子标志物—brd7试剂盒的制作方法
专利说明鼻咽癌分子标志物-BRD7试剂盒 本发明涉及一种用于诊断鼻咽癌的分子标志物。鼻咽癌是我国南方高发的一种恶性肿瘤，湖南省是鼻咽癌高发省之一。目前鼻咽癌筛查所用的检测方法，多为EB病毒的血清学检查和EB病毒检测。由于EB病毒产生抗体需要一段相对较长的时间，且检测方法的敏感性和特异性并不理想，因此尚不能做到真正意义上的早期诊断。
随着肿瘤分子机制的深入研究，肿瘤分子标志物的检测将成为21世纪肿瘤(癌)筛检的方向。SNP是基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入/缺失等，据估计基因组中大约平均每1000bp就会有一个SNP。SNP可以划分两种形式一即基因编码区(Coding Region)的功能性变异，二遍布于整个基因组的非编码区(调控区、内含子和剪接连接区等)的单核苷酸变异。SNP作为第三代遗传标记不仅用于致病基因的搜寻和进化、种群多样性研究，更重要的是，SNP尤其是cSNP与人类各种遗传特征相关。本发明的目的是利用BRD7基因编码区C450T和A737G的多态性，提供一种鼻咽癌分子标志物-BRD7试剂盒。
研究表明BRD7基因是鼻咽癌良好的候选抑瘤基因。本发明采用PCR-SSCP技术和直接测序法对BRD7基因的编码区进行单核苷酸多态性(Coding-region Single Nucleotide Polymorphism，cSNP)分析，并对鼻咽癌家系的高危成员、散发性鼻咽癌病人和正常人进行BRD7基因等位基因分型。在BRD7基因的编码区发现了2个cSNP(C450T和A737G)，T450与G737多态性偶联发生在87.7％的鼻咽癌活检组织和配对外周血、所有的鼻咽癌家系的患者及易感成员中，仅存在于22％的正常人血标本中。T450和G737偶联的多态性改变是鼻咽癌发生和发展的重要的遗传易感风险之一(P＜0.01)，可以作为鼻咽癌的分子标志物，用于鼻咽癌高危人群的筛选和早期诊断。
运用BRD7基因编码区的C450T和A737G多态性制作诊断试剂盒。
1.RNA抽提与差异RT-PCR
按照TRIzolTM试剂盒(Gibco BRL公司)操作程序提取鼻咽癌活检组织RNA；后用DNase-I消化RNA中痕量DNA，PCR扩增GADPH检测无特异扩增条带以保证DNA消化完全。RNA取量约为2μg按RT试剂盒(Promega)操作步骤进行逆转录反应。采用下列参数进行差异PCR扩增BRD7基因的cDNA编码区94℃变性50s；55℃复性50s；72℃延伸1min；30个循环终止。
2.SSCP为了检测BRD7基因在鼻咽癌中有无突变，5μl PCR产物加等量的加样缓冲液，95℃，3min后冰浴5min，其5μl上样于9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，10mM电泳3～5h。取下凝胶按下列程序银染10％乙醇固定10min；1％HNO310min，双蒸水洗一次；0.2％AgNO320min，洗两次；3％的Na2CO3(0.05％甲醛)显色至条带清晰为止。
3.基因组DNA提取抽提50例鼻咽癌活检组织及配对血标本、50例正常人外周血淋巴细胞和2个家系永生化淋巴细胞基因组DNA。
4.特异性PCR和测序根据上述多态性结果，选择扩增多态性高发区的两端引物(5’-GAACAGACACCCCTTCAAG-3’和5’-TGTGAGGTGTCTGTTCCA-3’)。根据其位于在同一个外显子，直接对基因组DNA进行扩增。模板量取1μg，参数同上。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶分离后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、纯化后，用ABI公司的377型DNA自动测序仪直接测序分析。
5.统计学处理对BRD7等位基因型在鼻咽癌人群和正常人分布，采用SPSS软件进行统计学处理。
该试剂盒的制作可以通过如下步骤进行收集鼻咽癌病人的外周血淋巴细胞，抽提病人外周血淋巴细胞的DNA，就BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性的两侧设计引物约500bp，直接对基因组DNA进行PCR扩增，模版量取1ug，参数为94℃变性50s；55℃复性50s；72℃延伸1min；30个循环终止。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶分离后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、纯化后测序分析，检测鼻咽癌患者BRD7基因两个SNP的基因型。
利用BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性，制成价廉简便的鼻咽癌早期基因诊断试剂盒。该试剂盒的使用将提高鼻咽癌的早期诊断、改善鼻咽癌的预后，提高鼻咽癌的生存率，这将是一个成本低，但具有潜伏巨大的市场的诊断试剂盒，具有明显的社会效益和经济效益。
图1BRD7基因的等位基因纯合子AA；图2BRD7基因的等位基因纯合子AC；图3BRD7基因的等位基因纯合子CC；图4BRD7基因的等位基因纯合子CT；图5BRD7基因的等位基因纯合子TT；图6BRD7基因的等位基因纯合子AA；图7BRD7基因的等位基因纯合子AG；图8BRD7基因的等位基因纯合子GG。
权利要求
1.鼻咽癌分子标志物-BRD7试剂盒，其特征在于本发明通过收集鼻咽癌病人的外周血淋巴细胞，抽提病人外周血淋巴细胞的DNA，就BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性的两侧设计引物约500bp，直接对基因组DNA进行PCR扩增，模版量取1ug，参数为94℃变性50s；55℃复性50s；72℃延伸1min；30个循环终止，PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶分离后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、纯化后测序分析，检测鼻咽癌患者BRD7基因两个SNP的基因型。
全文摘要
鼻咽癌分子标志物—BRD7试剂盒。本发明通过PCR技术和直接测序法对BRD7基因的编码区进行单核苷酸多态性(Coding－region Single Nucleotide Polymorphism，cSNP)分析，并计算基因型在对鼻咽癌患者和正常人群中的分布。利用BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性，制成价廉简便的鼻咽癌早期基因诊断试剂盒。该试剂盒的使用将提高鼻咽癌的早期诊断、改善鼻咽癌的预后，提高鼻咽癌的生存率，这将是一个成本低，但具有潜伏巨大的市场的诊断试剂盒，具有明显的社会效益和经济效益。
文档编号G01N33/574GK1482256SQ0213960
公开日2004年3月17日 申请日期2002年9月13日 优先权日2002年9月13日
发明者李桂源, 余鹰, 熊炜, 曾朝阳, 李小玲, 朱诗国, 张必成, 周鸣 申请人:中南大学