专利名称：一种蛋白质芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质芯片及其制备方法和应用，尤其涉及用无细胞离体一步到位的蛋白质体外合成法制备蛋白质芯片以及其在临床诊断、医学研究、新药开发和检验、蛋白质组研究等领域相关应用。
背景技术：
在人类基因组DNA序列被测定和其它大量物种的基因组被逐步迅速测定的背景下，目前迫在眉睫的任务是发展一套高效、快捷和实用的方法或技术来研究基因组所编码的蛋白质的功能，以获得对细胞内各生物过程和途径的全面完整的理解。微列阵技术作为目前一种高效、全面和快捷的方法已在研究基因表达、基因突变和基因转录调控等领域发挥出其特有的快速获取大量、平行数据的作用。由于蛋白质在实现基因功能上比mRNA更进一步，所以目前研发蛋白质微列阵技术来研究大量蛋白质，甚至整个蛋白质组的功能已成为大规模和后基因组生物学的前沿。蛋白质芯片技术借用大量已成熟的DNA芯片技术，已发展出了包括低密度的金属表面的SELDI芯片、高密度的三维凝胶片芯片、高密度圆柱状芯片等形式。如文献1(Zhu H.et al.Science.2001，2932101-5)报告了如何在高密度平滑玻璃表面制备蛋白质组芯片及其应用的工作。如何将蛋白质高效固定于固体表面是制作蛋白质芯片的另一重要的问题。目前存在的固体表面包括用二价镍、环氧基或醛基活化的PDMS或玻璃表面，其他还有硝酸纤维、金属或Poly-L-lysine覆盖等表面。
然而，蛋白质芯片领域中最大的障碍是资金的高投入、研发的长周期及其技术的高度复杂性。目前的采用的方法包括基因克隆、活体细胞蛋白质表达、大规模高效率蛋白质提纯和蛋白质芯片的制备和应用这四部分。目前这四部分都是分步单独进行，每一步的实施均要求专门的设备和人力，每一步的产品也得分门别类地记录和保存。其中真核生物的基因克隆一项需消耗大量的人力、物力、空间和时间；蛋白质的表达和大规模提纯不但消耗大量的人力、物力，还必须掌握专门技术，目前世界上只有屈指可数的几个实验室可以做到，另外，蛋白质的保存期在-80摄氏度冰箱内也少于6个月；而蛋白质芯片的制作过程也因为蛋白质自身的不稳定性，必须在严格控制的条件下反复调试才能实现，更重要的是一旦制成蛋白质芯片，该芯片不但难于保存(＜7天)，而且无法运输，更不能形成产品。
因此，在蛋白质芯片领域中，如何以低成本克隆大量真核生物的基因、高效获取多种蛋白质以及蛋白质芯片的实用化和商品化仍是这个领域的瓶颈。目前已有的方法还无法适应研究像人类这样复杂的蛋白质组的研究工作。而且，蛋白质芯片在临床诊断、生物医学及基础研究中如何发挥更有效的作用还有待进一步的突破。
发明内容
本发明的目的在于克服蛋白质自身的不稳定性，必须在严格控制的条件下反复调试才能实现，更重要的是一旦制成蛋白质芯片，该芯片不但难于保存(＜7天)，而且无法运输，更不能形成产品的缺陷；以及克服传统制备方法必须先克隆基因表达片段，经细胞内表达、合成蛋白质纯化的繁杂步骤的缺陷；从而提供一种保存时间长的、实用化和商品化的蛋白质芯片及其应用。以及提供一种制作过程简单，无需利用活体细胞表达蛋白和繁琐的纯化步骤的蛋白质芯片制备方法。
本发明提供的蛋白质芯片包括一基片，基片上有亲和层，以及亲和层上有生物大分子层，其中生物大分子层为编码基因片段，或编码基因片段的产物膜层。
所用的基片是常规的生物芯片基片材料；可以是玻璃、石英或表面镀膜的固体复合材料；该表面镀膜的固体复合材料最好是镀金属膜(如金、银、铜、锌)的陶瓷、塑料、石墨或聚合硅烷(如二甲基硅烷)。本发明的蛋白质芯片，其基片层结构可以是平滑形(基片表面为一连续的平面)，如图1A所示；也可以是微孔形(基片表面设有分隔设置的且不会互相渗漏的腔体，该腔体可以是由基片材料本身形成分隔装置得到的，如图1B，腔体也可在基片上粘贴一层格栅状胶材得到)，根据需要腔体的直径或长度可以为几纳米到几百微米；基片层结构也可以是岛状突起形(基片表面为一个个柱状的凸起物)，如图1C所示。当微孔形芯片的腔体为0.1nm～3nm时，称之为毛细微孔形芯片，如图1D所示；微孔形、岛状突起形和毛细微孔形芯片尤其适用于不同样品的同时检测，用者可根据其需要采用适当的芯片。
基片层表面须经化学修饰而激活，以达到固定亲合层的目的。在用玻璃或石英材料作基片时，可由简单的酸碱处理而获得表面激活的羟基，以用于共价结合硅烷化合物的亲合层；在用陶瓷、塑料、石墨或聚二甲基硅烷等材料作基片时，可采用金、银、铜、锌等金属镀膜实现表面激活，以达到共价连接巯基烷类化合物单分子膜的目的。
所述的蛋白质芯片，其基片上的亲和层是一种与蛋白质能高度特异亲合的单分子膜，该单分子膜为有机长链，其上共价结合有亲和分子(见图3中标号4所示)，亲和分子可以是生物素、抗生物素蛋白(Avidin)、抗体变异区、谷胱甘肽、聚丙烯酰胺胶、琼脂糖凝胶或螯合剂，这些螯合剂螯合金属离子Ni2+、Fe3+、Cu2+、Ga2+或Ca2+等，如EDTA，EGTA，NTA(tetradentatenitrolotriacetic acid)，IDA(iminodiacetic acid)或TCE(tris(carboxymethyl)ethylenediamine)，三亚氨乙酰乙酸(tridentate iminodiacetic acid)等。这些解离常数(Kd)在10-7以上的分子可与合成的蛋白质上的亲合标记非常选择性地牢固结合，从而实现高度特异地固定蛋白质的目的，避免了非特异性结合造成的高背景。而且，由于不同编码基因产物上的亲合标记总在同一位置出现，蛋白质能以完全一致的空间取向通过特异亲合标记固定于芯片表面，从而最大限度地保持了生物大分子的自然构相。
本发明的蛋白质芯片，其亲和层上的生物大分子层为编码基因片段，或编码基因片段的产物。编码基因片段在实施例中选用RNA或DNA，选用的RNA可以是mRNA、tRNA以及人工合成的RNA等，选用的DNA可以是cDNA、PCR扩增产物、人工合成的DNA以及基因组中的核苷酸片段等。也可以采用逆向PCR(RT-PCR)技术直接从活体组织内提取的mRNA中扩增目标基因表达片段。该编码基因不拘泥于用来合成蛋白质，还可设计模板用于合成人工随机短肽(Random peptide)，抗体随机变异区(如Phage display技术所描述的)，或含有其它蛋白结合变异区(如Affibody技术所描述的)的人工随机短肽或蛋白质。
本发明进一步提供了一种所述蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤(2)基片表面的处理和活化清洁固体基片，并将基片表面进行活化使其共价连接亲和层的单分子膜。基片层表面须经化学修饰而激活，以达到固定亲合层的目的，在用玻璃或石英材料作基片时，可由简单的酸碱处理而获得表面激活的羟基，以用于共价结合亲合层；在用陶瓷、塑料、石墨或聚二甲基硅烷等材料作基片时，可采用金、银、铜、锌等金属镀膜实现表面激活，以达到共价连接巯基烷类化合物单分子膜的目的。
(3)生物大分子层的制备将基因扩增产物加到上述步骤(1)得到的结合有亲和层的基片上，制得生物大分子层为编码基因片段的蛋白质芯片。
由该方法制得的蛋白质芯片是一种前体蛋白质芯片，在使用的时候必须通过如下步骤利用无细胞体外转录-翻译系统把从DNA到mRNA、mRNA到蛋白质、溶液中游离蛋白质到表面固定蛋白质这一系列反应和变化在同一反应体系内一步完成，即一步到位完成。该使用方法具体包括步骤(3)即基因扩增产物的翻译过程(参见图3)1)体积比(20～200)∶(1～10)∶1将体外转录翻译反应液，100mM乙酸镁和1mM蛋氨酸混合；2)将本发明制得的生物大分子层为编码基因片段的蛋白质芯片浸没于上述步骤1)制成的混合液中，30℃温育1到3小时，实现从编码基因片段到蛋白质的生化反应，并同时完成从游离蛋白质到表面固定蛋白质的转化。
3)用缓冲液清洗步骤2)得到的蛋白质芯片，制得的蛋白质芯片即可使用或冷藏待用。
所述的使用步骤进一步优选在步骤2)中将蛋白质芯片浸没于步骤1)制成的混合液之后，还包括用震荡或超声波清洗仪除去芯片表面的气泡。
该发明还可在2cm×5cm的固体表面内形成1000到100000个蛋白质点，即高密度蛋白质芯片或高密度蛋白质微列阵。
本发明进一步涉及所述的蛋白质芯片在临床诊断、医学研究、新药开发和检验、蛋白质组研究等领域的用途。例如，该蛋白质芯片可用于勾勒小到细胞器、细胞、大到各种体液、组织、器官、系统，甚至整个生物的蛋白质组成轮廓，从而发现疾病特异的生物标记，以用于对各种恶性疾病的早期临床诊断；又如，该蛋白质芯片可用于发现组织或疾病特异表达的蛋白质，从而促进基础医学的研究；又如，该蛋白质芯片可用于新药开发和检验，通过对蛋白质与药物小分子间相互作用的研究，可以发现哪些药物小分子具有能与某种疾病或癌症相关蛋白作用而达到抑制病变的目的，从而发现新药；又如，该蛋白质芯片可用于蛋白质组的基础研究，蛋白质芯片可作为实验平台来研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-脂肪、蛋白质-抗体、蛋白质-短肽、蛋白质-多聚糖之间的相互作用，蛋白质芯片还可作为实验平台来研究真核生物蛋白质的转录后修饰和寻找各种酶的下游底物，从而为勾勒生物体内的各种生物途径的网络图提供丰富的实验依据。
本发明拓展了蛋白质芯片与下游实验的结合配套，如在表面金属覆盖的蛋白质芯片上可以用表面等离子体共振(SPR)的检测手段研究蛋白质与其它分子间的结合和解离常数，从而解决了以往无法大规模同步测定多种蛋白质与其它分子间的结合或解离常数的难题。还可在表面金属覆盖的微孔蛋白质芯片上可以结合质谱的检测手段确定何种分子与蛋白质芯片上的蛋白质结合，从而大大缩短了检测周期，提高了检测效率。
本发明的蛋白质芯片和现有的蛋白质芯片相比，具有如下优点(1)本发明提供的蛋白质芯片是一种前体蛋白质芯片，在保持了现有的蛋白质芯片的高密度、高效率的特点，其蛋白质点阵密度可达1000-100000个蛋白质、抗体或人工短肽点每10平方厘米。本发明只需将编码目标蛋白质或短肽的编码序列制成前体芯片，然后实现原位蛋白质转录、合成，完全省略了传统方法的克隆基因活体细胞表达合成蛋白质和用芯片制备仪来制备蛋白质芯片的四大步骤的全新的一步到位制备方法。该方法有效地解决了蛋白质不易保存和随时间降解的问题。使用者可根据需要随时由前体蛋白质芯片转化为新鲜的蛋白质芯片，最大程度地避免了蛋白质不稳定的问题，该前体芯片可于室温下保存(～5年)和运输，大大促进了蛋白质芯片的实用化和商品化。
(2)本发明提供的由基片层、特异亲合层和编码基因片段层构成的蛋白质芯片，节省了大量消耗在克隆真核生物基因外显子的人力、物力、费用和时间，而且节省了保存这些克隆的大量空间，也省略了用活体细胞表达蛋白质和繁复的蛋白质提纯步骤，有效避免了由于保存多套克隆带来的交叉污染的可能，并解决了由于细胞株的生长差异而造成的蛋白质产量不均一的情况，进而消除了由此导致的固定在芯片表面上的蛋白质量的巨大差异，从而大大降低了因固定在芯片表面蛋白质数量和质量上的差异而造成的实验误差。
(3)本发明的蛋白质芯片采用了具高度特异性的亲合层，可使编码基因产物以完全一致的空间取向通过特异亲合标记固定于芯片表面，从而最大限度地保持了生物分子的自然构相。固定于表面的模板可用于合成蛋白质、短肽、抗体变异区等生物分子，本发明极大地提高了蛋白质芯片在实际应用上的灵活性。
(4)本发明进一步拓展了蛋白质芯片与各种下游实验的结合配套，如在表面金属覆盖的蛋白质芯片上可以用表面等离子体共振(SPR)的检测手段研究蛋白质与其它分子间的结合和解离常数，从而解决了以往无法大规模同步测定蛋白质与其它分子间的结合和解离常数的难题；该蛋白质芯片可以结合质谱的检测手段研究何种分子与蛋白质芯片上的蛋白质结合，从而大大缩短了检测周期，提高了检测效率。
(5)本发明还拓展了蛋白质芯片在药物筛选、药效测定、药物目标蛋白的确定、药物副作用的测定等领域中的应用，为实现实时临床监测、新药发现和普及蛋白质组的基础研究打下了坚实的基础。
图1A为平滑基片蛋白质芯片的构造截面1B为微孔基片蛋白质芯片的构造截面1C为岛状突起基片蛋白质芯片的构造截面1D为毛细微孔基片蛋白质芯片的构造截面图其中，1为基片2为亲合层3为生物大分子层I表示放大图2为实施例1中基片表面的处理其中1为基片 2为金属镀膜3为亲合层S1为镀膜步骤S2为结合亲和层步骤图3为一步到位法制备蛋白质芯片其中1为基片2为金属镀膜 3为亲合层4为亲和分子5为蛋白质6为亲和标记具体实施方式
实施例1在高密度岛状突起玻璃基片上制备蛋白质芯片步骤一基片表面的处理和活化(参见图2所示)
1)用纯水将高密度岛状突起石墨基片冲洗三次，再用100％乙醇将载玻片冲洗三次。
2)于真空蒸发台内将待镀的石墨基片置于样品台上，把待镀金属置于蒸发舟内，在金的熔点下于10-2Pa将金镀于石墨基片的表面。
3)镀好的石墨基片置于含有10-巯基癸烷-NTA(Ca2+)的溶液中，在室温反应三小时以上，得到连接有亲和层的基片。
4)再用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗上述3)得到的基片三次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的连接有亲和层的基片于干燥无灰尘条件下保存。
步骤二制备岛状突起前体蛋白质芯片(参见图3所示)1)储存于-80℃冰箱内扩增基因产物于室温融化，并于3000rpm离心5分钟。
2)将步骤一中制备的连接有亲和层的岛状突起基片排列在芯片合成仪的工作平台上，将盛有基因产物的384孔板(见实施例4)置于机器内部的原料平台上。
3)在芯片合成仪的控制计算机上输入制备一步到位前体蛋白质芯片各种参数，并启动程序。
4)取下芯片合成仪完成印制前体蛋白质芯片，于干燥无灰尘条件下保存芯片。
步骤三从岛状突起前体蛋白质芯片制备岛状突起蛋白质芯片1)80∶2∶1的比例将体外转录翻译系统、100mM乙酸镁和1mM蛋氨酸混合。
2)用芯片合成仪将上一步制成的混合物点在步骤二制备的前体芯片上的岛状突起上(大约0.3纳升)；或者，将该前体芯片表面置于步骤三1)制成的混合物中，然后用震荡或超声波清洗仪除去气泡。
3)将第二步加好混合物的前体芯片置于保湿的密闭容器内，于30℃在摇床上培养1到3小时，从而制得岛状突起蛋白质芯片。
4)最后用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗岛状突起蛋白质芯片共三到五次。制得的岛状突起蛋白质芯片可立即使用，也可储存于4℃冰箱中待用如步骤三所述，在具有亲合性的单分子膜的芯片表面可一步完成从前体蛋白质芯片到蛋白质芯片的三步反应，即从DNA模板到mRNA的基因转录反应，从mRNA模板到蛋白质的基因翻译反应，从合成的处于游离状态的蛋白质通过其上连接的亲和标记特异结合亲和层上的亲和小分子而固定到芯片表面的过程。整个反应可在30℃保湿的条件下温育几小时，最后经洗涤完成蛋白质芯片的制备。
实施例2在高密度微孔基片上制备蛋白质芯片步骤一芯片表面的处理和活化1)用水将高密度微孔玻璃基片(腔体是直径为7微米的圆孔)冲洗三次，再用100％乙醇将载玻片冲洗三次。
2)将玻璃基片置于0.2M的NaOH溶液中浸泡过夜，然后用高纯水清洗3遍，再用无水乙醇冲洗一遍。
3)将清洗后的玻璃基片置于含有(CH3O)3-Si-(CH2)20-生物素的溶液中，在室温反应三小时以上，得到连接有亲和层的基片。
4)再用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗上述3)得到的基片三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的连接有亲和层的基片于干燥无灰尘条件下保存。
步骤二制备高密度微孔前体蛋白质芯片与实施例1中步骤二完全相同。
步骤三从高密度微孔前体蛋白质芯片制备高密度微孔蛋白质芯片1)20∶8∶1的比例将体外转录翻译系统、100mM乙酸镁和1mM蛋氨酸混合。
2)用芯片合成仪将第一步制成的混合物分装于实施例5中的高密度微孔前体芯片上的微孔内(大约每孔0.3纳升)；或者，将高密度微孔前体芯片表面置于第一步制成的混合物中，然后用震荡或超声波清洗仪除去微孔中的气泡。
3)将第二步加好混合物的前体芯片置于保湿的密闭容器内，于30摄氏度在摇床上培养1到3小时，从而高密度微孔突起蛋白质芯片。
4)最后用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗岛状突起蛋白质芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白质芯片可立即使用，也可储存于4℃冰箱中待用。
实施例3在平滑基片上制备蛋白质芯片步骤一芯片表面的处理和活化1)用水将平滑形石英基片冲洗三次，再用100％乙醇将载玻片冲洗三次。
2)石英基片置于0.2M的HCl溶液中浸泡过夜，然后用高纯水清洗3遍，再用无水乙醇冲洗一遍。
3)将清洗后的石英基片置于含有(CH3O)-Si-(CH2)22-谷胱甘肽的溶液中，在室温反应三小时以上，得到连接有亲和层的基片。
4)再用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗上述3)的基片共三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的连接有亲和层的基片于干燥无灰尘条件下保存。
步骤二制备高密度平滑前体蛋白质芯片与实施例1中步骤二完全相同。
步骤三从高密度平滑前体蛋白质芯片制备高密度平滑蛋白质芯片1)80∶5∶1的比例将体外转录翻译系统、100mM乙酸镁和1mM蛋氨酸混合。
2)将高密度平滑前体芯片表面置于第一步制成的混合物中，覆盖玻片，然后用震荡或超声波清洗仪除去气泡。
3)将第二步加好混合物的前体芯片置于保湿的密闭容器内，于30摄氏度在摇床上培养1到3小时，从而高密度微孔突起蛋白质芯片。
4)最后用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗岛状突起蛋白质芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白质芯片可立即使用，也可储存于4℃冰箱中待用。
实施例4在毛细微孔基片上制备蛋白质芯片步骤一芯片表面的处理和活化1)用水将毛细微孔形的二甲基硅烷基片(腔体是直径为2纳米的圆孔)冲洗三次，再用100％乙醇将载玻片冲洗三次。
2)在真空蒸发台内将待镀的二甲基硅烷基片置于样品台上，把待镀金属铜置于蒸发舟内，在铜的熔点下于10-2Pa将铜镀于石墨基片的表面。
3)镀好铜的二甲基硅烷基片置于含有HS-(CH2)22-抗生物素蛋白的溶液中，在室温反应三小时以上，得到连接有亲和层的基片。
4)再用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上基片三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的连接有亲和层的基片于干燥无灰尘条件下保存。
步骤二制备高密度平滑前体蛋白质芯片与实施例1中步骤二完全相同。
步骤三从高密度平滑前体蛋白质芯片制备高密度平滑蛋白质芯片1)100∶10∶1的比例将体外转录翻译系统、100mM乙酸镁和1mM蛋氨酸混合。
2)高密度平滑前体芯片表面置于第一步制成的混合物中，覆盖玻片，然后用震荡或超声波清洗仪除去气泡。
3)将第二步加好混合物的前体芯片置于保湿的密闭容器内，于30摄氏度在摇床上培养1到3小时，从而高密度微孔突起蛋白质芯片。
4)最后用磷酸盐缓冲液(PBS)在摇床上清洗岛状突起蛋白质芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白质芯片可立即使用，也可储存于4℃冰箱中待用。
实施例5基因模板的制备1)取10克活体组织用液氮研碎，迅速加入20毫升RNA抽提液，于冰上保温30分钟。
2)按Promega公司的mRNA抽提试剂盒的说明操作，可得到大约5微克mRNA。
3)将上述所得mRNA稀释至2纳克/微升，再取1微升作为RT-PCR反应模板，加入预先混好的45微升RT-PCR反应混合物中，再加入4ul基因特异引物，置于PCR反应仪中进行反应。
4)取5微升体积反应产物用作凝胶检测，剩余DNA可用标准的PEG沉淀法或硫酸铵沉淀法除去未反应的引物，并根据凝胶检测结果将扩增的DNA产物以0.1微克/微升重新溶于3xSSC缓冲液中。
5)将PCR产物分装于384孔板中，并储存于-80℃冰箱内待用。
实施例6蛋白质芯片用于药物靶蛋白的发现1)将新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)将带有生物素标记的人工合成的化合物纳巴霉素(Rapamycin)用磷酸盐缓冲液稀释，取120微升化合物稀释液加于蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)取200微升稀释好的由Cy-3荧光标记的链霉抗生物素(Streptavidin)溶液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
6)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
7)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
8)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。
9)用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与药物小分子结合的蛋白质可在扫描图上显示荧光亮点。这些蛋白质的名称可于数据库中查得，例如，发现了与啤酒酵母中蛋白质Frp1具有高度同源性的人类的未知功能的蛋白质。
实施例7蛋白质芯片用于新药发现1)新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)将带有生物素标记的人工合成的化合物文库用磷酸盐缓冲液稀释，取120微升化合物稀释液加于蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
3)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
4)取200微升稀释好的由Cy-3荧光标记的Streptavidin溶液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
5)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
6)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
7)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以确定哪些蛋白质可与药物分子结合。
8)从新选用步骤7中的可与药物分子结合的蛋白质制备微孔蛋白质芯片，重复上述实验步骤，然后将反应后的芯片置于高效质谱仪中逐一鉴定与蛋白质结合的药物分子的结构，达到新药发现的目的。
实施例8蛋白质芯片用于确认药物的副作用1)新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)将带有荧光标记的药物小分子用磷酸盐缓冲液稀释，取120微升稀释液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
6)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。
7)用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与药物小分子结合的蛋白质可在扫描图上显示荧光亮点。这些蛋白质的身份可于数据库中查得。
8)通过分析数据，立刻可以确认除了预期与该药物结合的蛋白质外，还有其它哪些蛋白质可以与该药物结合，这些附加蛋白质即构成该药物的副作用谱。通过分析这些附加蛋白质的功能，可更加深入地了解该药物的副作用的机理。
实施例9蛋白质芯片用于识别新的生物标记
1)新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)分别用Cy-3荧光标记和Cy-5荧光标记分别标记从癌组织和正常组织提取的蛋白质，在除去多余的荧光标记后，混合并用磷酸盐缓冲液稀释蛋白质混合物，取120微升混合物稀释液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。
6)用激光芯片扫描仪在两个频率下扫描蛋白质芯片以获取数据，能与癌组织中的蛋白质结合的芯片上的蛋白质可在扫描图上显示绿色荧光亮点；能与正常组织中的蛋白质结合的芯片上的蛋白质可在扫描图上显示红色荧光亮点。这些蛋白质的身份可于数据库中查得。
7)通过比较芯片上各个蛋白质点所显示的红绿色的比率，可确定能特异识别癌组织中超常表达的蛋白质或其它生物大分子的蛋白，这些蛋白质即可作为早期癌症临床诊断的生物标记。
实施例10蛋白质芯片用于传染病的临床诊断(以肝炎检测为例)1)新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。该蛋白质芯片上载有可以识别甲、乙、丙、丁、戊肝炎抗原的12种抗体。每个蛋白质芯片分为30个区，可同时测试20个病人和阴性、阳性对照。
2)取20个病人和一个健康人的血样各0.5ml，于3000转离心5分钟，取出血清500vl，并用磷酸盐缓冲液稀。取120微升混合物稀释液分别加到蛋白质芯片表面的各个区域内，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。将芯片没入磷酸盐缓冲液稀释好的带有Cy3荧光标记的抗人IgG的山羊抗体的缓冲液中，室温温育一小时。
6)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
7)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。
8)用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，通过鉴定病人血清在蛋白质芯片上呈现的阳性类别，可确定病人感染的肝炎病毒的类型，从而达到诊断的目的。
实施例11蛋白质芯片用于确认过敏病人血清中与过敏相关的抗体1)鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。该蛋白质芯片上载有30种已知的过敏原(allergen)。每个蛋白质芯片分为30个区，可同时测试20个病人和阴性、阳性对照。
2)取20个病人和一个健康人的血样各0.5ml，于3000转离心5分钟，取出血清500vl，并用磷酸盐缓冲液稀。取120微升混合物稀释液分别加到蛋白质芯片表面的各个区域内，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。将芯片没入磷酸盐缓冲液稀释好的带有Cy3荧光标记的抗人IgE的山羊抗体的缓冲液中，室温温育一小时。
6)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
7)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。
8)用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，通过鉴定病人血清在蛋白质芯片上呈现的阳性类别，可确定导致病人产生过敏的类型，从而达到诊断的目的。
实施例12蛋白质芯片用于确认酶的底物(以磷酸激酶为例)1)制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。该蛋白质芯片上载有1000种人类的蛋白质。
2)取纯化的人的磷酸激酶(CD2)蛋白用磷酸盐缓冲液稀至1纳克/微升。取120微升混合物稀释液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于30度下温育半小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。将芯片没入磷酸盐缓冲液稀释好的带有Cy3荧光标记的抗磷酸化酪氨酸的山羊抗体的缓冲液中，室温温育一小时。
6)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
7)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。
8)用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，芯片上那些呈阳性的蛋白质即该磷酸激酶(CD2)的底物。
实施例13蛋白质芯片用于筛选特异性抗体(以白介素-1为例)1)选择噬菌体呈现载体克隆人工重组片段，以获得108的噬菌体呈现载体文库。将文库分成均一的104份，然后用PCR扩增DNA模板，最后用点样仪制备前体蛋白质芯片。
2)采用实施例2阐述的方法制备蛋白质芯片。
3)新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
4)用生物素标记试剂盒标记白介素-1，在除去未反应的生物素之后，用磷酸盐缓冲液稀释标记好的蛋白。
5)取120微升标记好的蛋白加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
6)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
7)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
8)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与标记蛋白结合的人工抗体群可在扫描图上显示荧光亮点。
9)重复步骤1至步骤8，可进一步确定特异的抗白介素-1人工抗体。
实施例14蛋白质芯片用于研究蛋白质-蛋白质间的相互作用10)新鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
11)用生物素标记试剂盒标记待研究的蛋白质，在除去未反应的生物素之后，用磷酸盐缓冲液稀释标记好的蛋白。
12)取120微升标记好的蛋白加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
13)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
14)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
15)取200微升稀释好的由Cy-3荧光标记的Streptavidin溶液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
16)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
17)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
18)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与标记蛋白结合的蛋白质可在扫描图上显示荧光亮点。这些蛋白质的名称可于数据库中查得。
实施例15蛋白质芯片用于研究蛋白质-DNA间的相互作用1)鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)用生物素标记试剂盒标记待研究的DNA分子，在除去未反应的生物素之后，用磷酸盐缓冲液稀释标记好的DNA。
3)取120微升标记好的DNA加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
4)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
5)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
6)取200微升稀释好的由Cy-3荧光标记的Streptavidin溶液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
7)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
8)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
9)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与标记DNA结合的蛋白质可在扫描图上显示荧光亮点。这些蛋白质的名称可于数据库中查得。
实施例16蛋白质芯片用于研究蛋白质-生物大分子间的相互作用的结合和解离常数1)鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)蛋白质芯片置于SPR仪中，取120微升萤光标记好的生物大分子加到蛋白质芯片表面，同时用SPR仪观测生物大分子与芯片上固定的蛋白质之间的结合曲线。
3)待反应完成后，用含去污剂的清洗缓冲液洗脱结合在芯片上蛋白质的生物大分子，同时用SPR仪观测生物大分子与芯片上固定的蛋白质之间的解离曲线。
4)通过数据分析，可大规模、高效测定各个生物大分子与芯片上固定的蛋白质之间的结合和解离常数。
实施例17蛋白质芯片用于研究蛋白质-脂类分子间的相互作用1)鲜制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)取120微升荧光标记好的脂类分子加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
3)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
4)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
5)蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与标记多糖结合的蛋白质可在扫描图上显示荧光亮点。这些蛋白质的名称可于数据库中查得。
实施例18蛋白质芯片用于研究蛋白质-多糖间的相互作用1)制备的蛋白质芯片用大体积清洗缓冲液在摇床上清洗共三到五次，待用。
2)生物素标记试剂盒标记待研究的多糖，在除去未反应的生物素之后，用磷酸盐缓冲液稀释标记好的蛋白。
3)取120微升标记好的多糖加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
4)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
5)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
6)取200微升稀释好的由Cy-3荧光标记的Streptavidin溶液加到蛋白质芯片表面，然后用盖玻片覆盖，尽量避免气泡。
7)蛋白质芯片置于保湿的环境中于室温下温育一小时。
8)将整个盖玻片覆盖的蛋白质芯片没于大体积清洗缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。将整个蛋白质芯片没于大体积超纯水中，在摇床上清洗三次，每次15分钟。
蛋白质芯片用离心机在3000转的速度下离心5分钟干燥。用激光芯片扫描仪扫描蛋白质芯片以获取数据，能与标记多糖结合的蛋白质可在扫描图上显示荧光亮点。这些蛋白质的名称可于数据库中查得。
权利要求
1.一种蛋白质芯片，包括基片，基片上的亲和层，以及亲和层上的生物大分子层，其特征在于所述的生物大分子层为编码基因片段，或编码基因片段的产物膜层。
2.按权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于所述的基片包括玻璃、石英或表面镀膜的固体复合材料。
3.按权利要求2所述的蛋白质芯片，其特征在于所述的表面镀膜的固体复合材料包括镀金属膜的陶瓷、塑料、石墨或聚合硅烷。
4.按权利要求1或2或3所述的蛋白质芯片，其特征在于所述的基片是平滑形、具有毛细微孔形或岛状突起形。
5.按权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于所述的亲和层是结合生物素、抗生物素蛋白、抗体变异区、聚丙烯酰胺胶、琼脂糖凝胶或螯合剂作为亲和分子的单分子膜层。
6.一种权利要求1所述蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤(1)基片表面的处理和活化清洁固体基片，并将基片表面进行活化使其共价连接亲和层的单分子膜；(2)生物大分子层的制备将基因扩增产物加到上述步骤(1)得到的结合有亲和层的基片上，制得生物大分子层为编码基因片段的蛋白质芯片。
7.按权利要求6所述的蛋白质芯片的制备方法，其特征在于还包括步骤(3)基因扩增产物的翻译过程1)按体积比(20～200)∶(1～10)∶1将体外转录翻译反应液，100mM乙酸镁和1mM蛋氨酸混合；2)将权利要求10制得的蛋白质芯片浸没于上述步骤1)制成的混合液中，30℃温育1到3小时，实现从编码基因片段到蛋白质的生化反应，并同时完成从游离蛋白质到表面固定蛋白质的转化；3)用缓冲液清洗步骤2)得到的蛋白质芯片，制得的蛋白质芯片即可使用或冷藏待用。
8.按权利要求6所述的蛋白质芯片，其特征在于编码基因片段的产物膜层为人工随机片段、短肽、蛋白质或抗体。
9.按权利要求6所述的蛋白质芯片，其特征在于编码基因片段是RNA或DNA。
10.按权利要求6所述的蛋白质芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中将基片进行活化包括将玻璃或石英基片表面用酸或碱处理或镀膜。
11.按权利要求7所述的蛋白质制备方法，其特征在于所述的步骤2)中将蛋白质芯片浸没于步骤1)制成的混合液之后还包括用震荡或超声波清洗仪除去芯片表面的气泡。
12.一种权利要求1所述的蛋白质芯片在筛选药物靶蛋白、筛选新药、蛋白质组研究、分析药物副作用和临床诊断中的应用。
13.按权利要求12所述的蛋白质芯片在临床诊断中的应用包括为传染病的临床诊断、人心血管病、癌症早期诊断或过敏病人血清中与过敏相关的抗体的确认。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质芯片及其制备方法和应用。该发明包括以全新的概念制成可商品化的、高密度的、由基片层、特异亲合层和生物大分子层构成蛋白质芯片，其蛋白质点阵密度每10平方厘米内可达1000－100000个蛋白质、抗体或人工短肽点。该发明还涉及用芯片制备仪形成高密度可进行原位基因转录和翻译的基因转录片段的前体蛋白质芯片，然后用无细胞蛋白质表达系统在前体蛋白质芯片上一步制备高密度蛋白质芯片的方法。该发明解决了现有蛋白质芯片技术中费用高昂、周期长、步骤繁冗以及不易保存和运输的难题，极大促进了蛋白质芯片技术的实用化和商品化。该发明在临床诊断、医学研究、新药开发和检验、蛋白质组研究等领域内具有广泛的用途。
文档编号G01N33/50GK1512176SQ0215976
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者陈正豪, 朱衡 申请人:陈正豪