专利名称：可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1 的elisa定量检测方法
一、所属领域本发明涉及生物技术领域，特别是有关可溶性免疫细胞膜分子的一种定量检测方法。
白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1，又称9.1C3)分子是通过用人NK细胞免疫小鼠后获得的能阻断杀伤细胞功能的单克隆抗体(包括mAb 9.1C3)而发现的。1997年基因克隆成功并命名为白细胞相关免疫球蛋白样受体1(Leukocyte associated immunoglbulinlike receptor-1，LAIR-1)，胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)。LAIR-1分布广泛，表达于NK细胞、B细胞、T细胞、单核细胞、树突状细胞和胸腺细胞等。体外研究表明，LAIR-1被其相应的单克隆抗体交联后，传递强烈的抑制性信号，可抑制包括NK细胞、B细胞、T细胞和树突状细胞前体等多种免疫细胞的功能。因此，建立检测可溶型LAIR-1(sLAIR-1)的酶联免疫吸附实验(ELISA)方法，在基础研究和临床免疫学方面都有重要的应用价值。
通过资料检索，国内外尚无任何有关检测可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1(sLAIR-1)的夹心ELISA方法的报道。
发明内容
本发明的目的提供一种特异、灵敏、稳定的sLAIR-1的定量检测方法。
本发明的技术方案是用两株针对LAIR-1/9.1C3分子胞膜外区不同表位的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，建立双mAb夹心ELISA方法，并设计提供优化的检测条件，以定量检测sLAIR-1的水平。
本发明的特点是以mAb 9.1C3为包被抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的mAb FMU8为夹心抗体。
本发明的优点是具有良好的特异性、敏感性和稳定性，操作时间较短，成本低。
具体实施例方式
以下结合具体的实施例对本发明作进一步的描述。1.首先制备多株可识别LAIR-1分子胞膜外区不同表位的mAbs，通过交叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配包被mAb为9.1C3，夹心抗体为HRP标记的mAb FMU8，即HRP-FMU8。2.然后对本发明的工作条件进行优化(1)包被mAb的工作浓度为5-10mg/L；(2)标准品为LAIR-1/Fc融合蛋白，标准品稀释液为0.1％BSA-PBS，标准品最高工作浓度为500μg/L，倍比稀释10个梯度作标准曲线；(3)HRP-FMU3的稀释液为3％PEG-0.1％BSA-PBS，最佳工作浓度为1.43mg/L(按mAb FMU8的量计算)。2.本发明的具体实施步骤用50m mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液包被mAb 9.1C3，加入96孔酶标板(Nunc.公司)，100μl/孔，保湿，4℃放置24h。用洗涤液(0.1％Tween20-PBS，下同)洗板3次，加入工作浓度标准品LAIR-1/Fc融合蛋白或待测标本，100μl/孔，37℃孵育60min。洗板3次，加入工作浓度的HRP-FMU8，100μl/孔，37℃孵育60min。洗板9次，以ABTS底物显色，100μl/孔，37℃放置约5-30min。ELISA读数仪405nm波长测定光吸收(A)值，以标准品的A值和相应的浓度作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比较，求线性回归，计算待测标本的sLAIR-1水平。结果显示，采用优化的检测步骤后，灵敏度高，稳定性好，检测范围在1.5-500μg/L之间。以下是发明人按本发明的技术方案所完成的实施例1.肾综合征出血热患者62例，正常人24例。结果，正常人血清中sLAIR-1的平均水平为的6.2±3.3mg/L，肾综合征出血热患者血清中sLAIR-1的平均水平为47.2±35.9mg/L，为正常人水平的6.9倍(P＜0.0001)。2.小肠移植排斥患者1例，肝脏移植排斥患者1例，肾移植排斥患者4例，血清中sLAIR-1的平均水平为35.6±41.0mg/L，为正常人的5.6倍(P＜0.05)。
权利要求
1.可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1的定量检测方法，其特征在于用两株针对LAIR-1/9.1C3分子胞膜外区不同表位的单克隆抗体(mAb)建立双mAb夹心ELISA方法，并设计提供优化的检测条件，以定量检测标本中的sLAIR-1的水平。
2.根据权利要求1所述的可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1的定量检测方法，其特征在于所述的两株用于夹心ELISAmAb是包被mAb为9.1C3，夹心mAb为HRP-标记的mAb FMU8，即HRP-FMU8。
3.根据权利要求1所述的可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1的定量检测方法，其特征在于所述优化的检测条件是(1)包被mAb的工作浓度为5-10mg/L；(2)标准品为LAIR-1/Fc融合蛋白，标准品稀释液为0.1％BSA-PBS，标准品最高工作浓度为500μg/L，倍比稀释10个梯度作标准曲线；(3)HRP-FMU8的稀释液为3％PEG-0.1％BSA-PBS，最佳工作浓度为1.43mg/L(按mAb FMU8的量计算)。
4.根据权利要求1所述的可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1的定量检测方法，其特征在于所述简化的实施步骤为(1)50m mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液包被mAb 9.1C3，加入96孔酶标板，100μl/孔，保湿，4℃放置24h；(2)用洗涤液洗板3次，加入工作浓度标准品LAIR-1/Fc融合蛋白或待测标本，100μl/孔，37℃孵育60min；(3)洗板3次，加入工作浓度的HRP-FMU8，100μl/孔，37℃孵育60min；(4)洗板9次，以ABTS底物显色；(5)ELISA读数仪405nm波长测定光吸收(A)值；(6)以标准品的A值和相应的浓度作标准曲线，求线性回归，计算待测标本的可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1水平。
全文摘要
可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1(sLAIR－1)的定量检测方法，涉及生物技术领域。其特征是，用两株针对LAIR－1分子胞膜外区不同表位的单克隆抗体(mAb FMU8和mAb 9.1C3)，建立双mAb夹心ELISA方法，其中包被mAb为9.1C3，夹心mAb为HRP标记的mAb FMU8，即HRP－FMU8。并设计提供优化的检测条件，以定量检测标本中sLAIR－1水平。本发明首次在国内外提供了一种特异、灵敏、稳定的检测可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1(sLAIR－1)的方法。
文档编号G01N33/577GK1439877SQ0311441
公开日2003年9月3日 申请日期2003年1月9日 优先权日2003年1月9日
发明者金伯泉, 欧阳为明, 薛江楠 申请人:中国人民解放军第四军医大学