专利名称：基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法
技术领域：
本发明涉及一种超薄切片厚度的测量方法，特别涉及的是利用原子力显微镜来扫描切片边缘并用软件处理图像，然后测量切片厚度的方法，属于生物工程技术领域。
对电子显微镜照片的正确解释，必须精确地了解切片的厚度。自从超薄切片技术发明以来，已有不少方法来测量切片的厚度。当切片漂浮在刀槽内的液面上时，可以从切片上反射光的干涉色来估计它的厚度，即用切片的干涉色作为切片厚度的近似指标。Peachy(J.Biophys.Biochem.Cytol.1958，4233)最早给出了连续的干涉色的颜色和对应切片厚度的关系。但由于用白炽灯观察到的干涉色和用日光灯观察的稍有不同，并且判断颜色的主观性因素也必须予以考虑，因此需要强调，按照干涉色估计切片厚度是不够准确的，特别是需要定量时。
Silverman等(J.Cell Biol.1969，40768)介绍了一种利用定量电镜(quantitativeelectron microscopy)来测量切片厚度的方法。他们使用一种松散的阴离子交换树脂，磷钨酸染色后作为切片厚度测量的标准。这种方法的优势就是保证了厚度的测量与材料的自身结构密切相关。
Gillis和Wibo(J.Cell Biol.1971，49947)发明了另一种干涉法来测切片厚度，宣称精确度可以达到1nm。在暴露于电子射线前，这种方法显示出了比较高的精确性和可靠性。
Edie和Karlsson(J.Microscopie 1972，1313)提供了一种在电镜观察时计算切片厚度的方法。切片厚度由电子束穿过包埋介质之后的衰减程度决定。
上述提到的多种方法都是基于电子显微镜或者为电镜观察做准备的。近年来，随着原子力显微镜(AFM)在生物领域的应用越来越多，其中也有一些是将超薄切片作为研究对象的，利用AFM来研究组织或细胞超薄切片的精细结构，在这种情况下，切片的厚度也是一个很关键的条件，它直接影响切片表面凹凸起伏的程度。但是，从切片上反射光的干涉色来估计切片的厚度是不够准确的，若利用定量电镜的方法又不适合AFM制样的要求。因此，基于AFM的切片厚度测量是一项全新研究，很有必要也十分关键，但目前尚未见有关基于AFM的超薄切片厚度的测量方法的报导。
为实现这样的目的，本发明的技术方案为，制备包埋块和进行超薄切片选定所需要的片子后，用洁净的铂金环捞取并轻轻浸在清洁云母表面的水滴中，移走铂金环或将铂金环倒扣，使切片飘浮在水面上，再将云母片缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面，利用原子力显微镜采用接触模式扫描包含切片边缘和云母的区域，实时平面调整参数设为“补偿”，控制温度和湿度，对获得的图像进行平整化处理时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
本发明的方法具体包括如下步骤采用现有成熟的超薄切片技术，先制备包埋块和进行超薄切片选择所需要的片子，用洁净的铂金环捞取。
滴15μl超纯水在清洁的云母表面，将铂金环轻轻浸在水滴中，从侧面移走铂金环，使切片飘浮在水面上，或将铂金环倒扣在水面上，切片也会漂浮在水面上。
将云母片置于烘片机上缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面。烘片机温度控制在40-65℃之间。
利用AFM扫描包含切片边缘和云母的区域，扫描模式为空气中的接触模式，实时平面调整(realtime planefit)参数必须设为“补偿”(offset)，温度控制在25±1℃，湿度控制在40％以下。
对获得的图像进行平整化处理，平整化时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
本发明在现有超薄切片技术的基础上进行改进，增加了将切片转移到云母表面的步骤，并独创了利用水的张力使薄切片平整地贴附在云母表面的技术。在AFM成像操作过程中，调整参数使其适合扫描台阶式的包含云母和切片边缘的区域，并在平整化处理中采用了特殊办法，即将包含切片的区域排除在外，大大提高了高度测量的可行性和准确性。本发明的方法步骤简单，根据AFM的特点设计，测量厚度和表面扫描可以同时进行，不会破坏样品的精细结构，适用于各种厚度的超薄切片，所得数据准确，误差小。
图1、图2为本发明实施例中制备的样品在AFM(Nanoscope IIIa from DigitalInstrument，Santa Babara，CA)空气中接触模式下观察的图像。图像中亮的部分为切片，暗的部分为云母。所用DI公司提供的离线处理软件(版本号4.42r4)仅对图像作平整化处理。
图1样品为人舌鳞状细胞癌组织切片，切片干涉色为蓝紫色。
图2样品为人舌鳞癌培养细胞Tca8113，切片干涉色为蓝色。
扫描范围30μm×30μm。
扫描范围30μm×30μm。
权利要求
1.一种基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法，其特征在于制备包埋块和进行超薄切片选定所需要的片子后，用洁净的铂金环捞取，滴15μl超纯水在清洁的云母表面，将铂金环轻轻浸在水滴中，从侧面移走铂金环或将铂金环倒扣，使切片飘浮在水面上，再将云母片置于烘片机上缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面，烘片机温度控制在40-65℃，利用原子力显微镜扫描包含切片边缘和云母的区域，扫描模式为空气中的接触模式，实时平面调整参数设为“补偿”，温度控制在25±1℃，湿度控制在40％以下，对获得的图像进行平整化处理时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
全文摘要
一种基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法，制备包埋块和进行超薄切片选定所需要的片子后，用洁净的铂金环捞取并轻轻浸在清洁云母表面的水滴中，移走铂金环或将铂金环倒扣，使切片飘浮在水面上，再将云母片缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面，利用原子力显微镜采用接触模式扫描包含切片边缘和云母的区域，实时平面调整参数设为“补偿”，控制温度和湿度，对获得的图像进行平整化处理时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。本发明的方法简单，表面扫描和厚度测量可以同时进行，不会破坏样品的超微结构，所得数据准确。
文档编号G01B21/08GK1445524SQ0311668
公开日2003年10月1日 申请日期2003年4月29日 优先权日2003年4月29日
发明者李鑫辉, 季彤, 李刚, 胡晓芳, 张晓东, 张陈平, 胡钧 申请人:上海交通大学