专利名称：头花蓼及其提取物和制品生物活性测定方法
技术领域：
本发明涉及中药领域中的中药生物活性定性定量测定方法，具体而言，本发明涉及一种用生物检定法测定头花蓼及其提取物生物和制品活性的方法。
生物检定法是利用药物对生物体的作用以测定其效价或生物活性的方法，它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计、通过供试品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量关系，来测得供试品的效价。在一定范围内，药物的剂量和药理作用间存在着量效关系，即剂量增大，药理作用会随着增强。将剂量和反应经过适当转换之后，量效关系可以转化成以反应或其函数为纵坐标、剂量或其函数为横坐标的直线关系。
头花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham.ex D.Don)，又名四季红，蓼科蓼属植物，多年生草本，为苗族常用药材。在中国的贵州、云南、广西、四川、西藏、湖北、湖南、江西均有分布，主要生长在山坡、山谷及富含煤层的砂页岩地带。头花蓼主要具有清热解毒，利尿通淋等功效。始载于1963年《广西中药志》第二册，主要用于风湿痛。1977年《中药大辞典》上册收载，民间将其用于治疗痢疾、肾炎、膀胱炎、尿路结石等。《贵州省中药材质量标准》1988年版及《贵州苗族医药研究与开发》均有收载，以其为原料的热淋清颗粒剂于2002年进入中国基本用药目录。头花蓼具有抗炎和抗菌等多种活性，其含有的有效成分也非常复杂，已经发现头花蓼中含有黄酮类和没食子酸等有效成分，但是，由于含有的成分复杂或者是协同作用因素，头花蓼及其提取物的活性与其中的黄酮类或没食子酸类有效成分没有明确的量效关系，因而，通过测定头花蓼及其提取物中的某个有效成分含量的结果很难反映被测定物的生物活性，因此，人们客观上需要一种直接、快速地测定头花蓼及其提取物的生物活性的方法，本发明正是为解决该问题而提出的。
因此，本发明的目的是提供一种测定头花蓼及其提取物生物活性的方法。
本发明中所述的头花蓼及其提取物和制品，包括头花蓼原药和用水、75％乙醇和95％乙醇和二氧化碳超临界条件分别对头花蓼全草、地上部分、叶、种子、茎和根部分别进行了提取得到的提取物及其制品，本发明的目的是提供一种方法对头花蓼及其提取物和制品进行生物活性测定，以便对它们的效价进行评价。
本发明涉及的头花蓼及其提取物和制品可以通过下列方法得到的实施例1制备头花蓼地上部分水提取物(编号w-2-1)取头花蓼地上部分220kg，洗净，加入7倍量水，加热煮沸1.5小时，过滤，药渣中加入6倍量水，煮沸1.0小时，过滤。合并滤液，浓缩至相对密度为1.2(20℃)得到浸膏，喷雾干燥得到浸膏粉23kg，收率是10.45％。
采用分光光度计法测定w-2-1中的总黄酮含量，将本发明的方法制备得到的w-2-1提取物和辅料均匀混和，制粒，干燥，即得到新方法制备的热淋清颗粒。
实施例2制备头花蓼全草水提取物(喷雾干燥)(编号w-1-2)根据与实施例1相同的方法，用头花蓼全草代替头花蓼地上部分进行提取。
取w-1-2浸膏粉按实施例1相同的方法，制得样品(w-1-12)。
实施例3制备头花蓼全草水提取物(减压干燥)(编号w-1-3)根据与实施例2相同的方法，将干燥方法改为减压干燥。
实施例4制备头花蓼根95％乙醇提取物(编号w-1-4)取头花蓼根10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7.5倍量的95％乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入7.5倍量95％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物0.215kg。
实施例5制备头花蓼茎95％乙醇提取物(编号w-1-5)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼茎进行提取。
实施例6制备头花蓼叶95％乙醇提取物(编号w-1-6)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼叶进行提取。
实施例7制备头花蓼种子95％乙醇提取物(编号w-1-7)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼种子进行提取。
实施例8制备头花蓼鲜品95％乙醇提粉(编号w-1-8)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼鲜品进行提取。
实施例9制备头花蓼鲜品水提粉(编号w-1-9)根据与实施例3相同的方法，用头花蓼鲜品进行提取。
实施例10制备头花蓼全草75％乙醇提取物(编号W-1-10)取头花蓼全草10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7-8倍量75％乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入5倍量75％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物0.694kg。
实施例11制备头花蓼全草水煎醇沉溶液粉(W-1-14a)和头花蓼全草水煎醇沉沉淀粉(W-1-14b)取头花蓼全草10.60kg，洗净，加入350kg水，加热煮沸1.5小时，转移上清液，残渣中加入150kg水，煮沸1.0小时。合并煎煮液，过滤浓缩至相对密度为1.04(24℃)得浸膏16.1kg。加入95％乙醇调至含醇量为60％，静至24小时，分取溶液。向沉淀加入95％乙醇调至含醇量为60％，静至24小时，分取溶液，合并两次溶液，挥去乙醇，80℃减压干燥得头花蓼全草水煎醇沉溶液粉(W-1-14a)0.755kg；沉淀于80℃减压干燥得头花蓼全草水煎醇沉沉淀粉(W-1-14b)0.465kg。
实施例12制备头花蓼原药粉二氧化碳超临界萃取提取物(编号W-1-15a)取头花蓼原药粉10kg，洗净，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开CO2气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏0.135kg。
实施例13制备头花蓼药渣二氧化碳超临界萃取提取物(编号W-1-15b)取头花蓼药渣10kg，洗净，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开CO2气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏0.119kg。
实施例14制备头花蓼地上部分70％乙醇提取物(编号W-2-2)取头花蓼地上部分30kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入8-9倍量70％乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入4-5倍量70％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。药渣再加入4-5倍量70％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并三次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物3.75kg。
具体而言，本发明利用小鼠耳肿胀法测定头花蓼提取物的生物活性，具体实验方法是试验一利用小鼠耳肿胀法，设计4个剂量，分别为10、20、40、80mg/kg，单次静脉注射给药(iv)，同时设立阳性药组和模型组。
步骤如下样品配制精确称量10、20、40、80mg的编号为W-1-2头花蓼提取物粉末，置10ml刻度离心管中，加入少许生理盐水，超声振荡至少3分钟，优选5-10分钟，最优选10分钟，使W-1-2粉末均匀分散在生理盐水中，随后准确添加生理盐水至10ml刻度，备用；给药每小鼠按体重尾单次静脉注射0.2-1.0ml/20g，优选0.2ml/20g上述药液，单次静脉注射5分钟后，优选10分钟后，每只小鼠右耳内侧均匀涂抹1％(w/w)巴豆油致炎剂(溶媒为V乙醇∶水∶乙醚＝25∶5∶70)；测定4小时后准时处死小鼠，取二耳，用直径8mm打孔器冲下左右二耳片，分别称重，二耳重量差值为肿胀度(mg)，再按下公式计算肿胀抑制率％。
试验结果剂量与肿胀抑制率(％)关系见下表1和表2。
表1 静注W-1-2剂量与肿胀制率(％)量效关系剂量(mg/kg)肿胀抑制率(％)统计处理结果10 14.9 P＞0.0520 20.3 P＜0.0140 29.8 P＜0.0180 31.0 P＜0.01由此可见，10mg/kg剂量抗炎作用不明显(P＞0.05)，20mg/kg起开始有效，虽然当剂量增加至80mg/kg，其肿胀抑制率(％)有明显提高，但无明显线性关系(见附
图1)。经计算γ＝0.885，P＞0.05，表明头花蓼浸膏粉静脉给药的抗炎作用的剂量与药效之间有一定量效关系，但无线性关系，况且剂量增至80mg/kg，小鼠经静注给药后已出现轻度不良反应(活动减少，伏卧不动，呼吸急促等)。
表2 静注W-1-2剂量与肿胀制率(％)量效关系原料剂量 给药途径 次数肿胀抑制率(％)致炎剂W-1-2 10g/kgiv1 19.4(P＜0.01) 巴豆油W-1-2 40g/kgiv1 29.8(P＜0.01) 巴豆油W-1-2 20g/kgiv1 20.3(P＜0.05) 巴豆油W-1-2 40g/kgiv1 30.6(P＜0.05) 巴豆油可见，虽然只进行二次试验，但二次试验结果一致性得到肯定，结果提示头花蓼浸膏粉中的抗炎活性成份由于采用静注方式而全部进入体内起到抗炎作用。剂量由原先口服的克级单位降至毫克级单位，大大降低用药量。并且用药时间也大大缩短，从而每批试验时间也明显缩短，即在一天时间内可完成一次试验，对样品的抗炎疗效很快得出评判。
试验二用小鼠耳部巴豆油炎症模型，根据小鼠耳肿胀生物活性测定法，测定不同药用部位和不同提取工艺得到的提取物的抗炎活性。实验采用小鼠静脉注射给药，给药剂量为40mg/kg，在同等剂量下，比较各提取物样品的抗炎活性大小。以此来对不同药用部位，不同提取工艺样品的疗效作出评判。
样品配制方法用5％丙二醇作溶媒，将样品称量后，先加入0.5ml丙二醇超声处理，待样品粉末分散均匀后，再用生理盐水稀释至刻度(10ml)。
其他试验条件和处理与试验一相同。
实验结果共进行三批实验，每批实验均在同时相同的实验条件(室温、湿度)下进行。
实验结果见表3
表3不同头花蓼样品抗炎活性的比较内含总黄 内含没食剂量 第一次实验(n＝10) 第二次实验(n＝10) 第三次实验(n＝11)编号名称 酮量 子酸量(mg/kg) (mg) (mg)肿胀度(mg) 肿胀率(％)肿胀度(mg)肿胀率(％) 肿胀度(mg) 肿胀率(％)W-1-2全草水提(喷雾) 40 0.728 0.86413.1±5.0*(30.7) 77.8±36.8*10.8±2.5*(33.7) 72.2±22.5**11.5±3.4*(33.1) 64.0±20.2**全草水提(减压) 40 0.584 1.09813.1±4.7*(30.7) 82.6±30.9 11.5±2.5**{29.4} 75.1±20.3**11.3±2.8**(34.3) 64.0±17.0**W-1-3W-1-4 根95％醇提 40 0.901 0.59213.6±4.7*(28.0) 86.1±29.9 12.2±3.2**{25.1} 80.6±19.3**14.4±3.1*(16.3) 84.7±24.5*W-1-5 茎95％醇提 40 0.776 0.48014.1±3.5*(25.4) 86.4±26.0 13.9±2.3*(14.7) 96.2±16.7*14.5±4.5(15.7) 80.5±24.7*W-1-6 叶95％醇提 40 2.517 0.30513.0±2.6*(31.2) 82.1±22.7*84±3.1**(48.5)57.9±20.4**9.8±2.8**(43.0) 59.4±17.0**阳性对照 氢化可的松 20 - - 6.7±2.9**(64.6) 45.2±20.7**4.9±2.8**(69.9) 36.4±16.4**4.7±1.6**(72.7) 29.7±12.1*阳性对照 芦丁 20 20 -11.4±2.7**(30.1) 74.7±17.1**11.4±2.9**(33.3) 65.4±21.3**阳性对照 没食子酸 20 - 20 15.9±3.4(2.4) 107.0±19.5 15.3±2.2(11.0) 96.6±18.9模型组5％丙二醇18.9±5.3 117.2±43.116.3±2.5 117.8±24.0 17.2±2.8 104.4±16.6W-1-2 全草水提 40 0.728 0.86412.6±3.4**81.1±26.5**7.3±2.5**41.7±15.4**7.8±3.4**47.3±22.2**W-1-8 鲜品醇提 40 1.510 1.31313.0±2.4*(31.2) 86.2±26.3 13.5±3.0*(17.2) 85.1±32.2*13.2±3.1*(23.3) 77.3±23.8**W-1-9 鲜品水提 40 0.770 1.2767.4±2.6**(60.8) 45.8±18.0**9.5±3.7**(41.7) 57.8±29.4**8.8±2.8**(48.8) 55.2±22.8**W-1-15b CO2药渣 4012.1±3**77.2±19.2**7.6±1.6**40.7±9.7**4.1±1.9**25.8±12.6**W-1-15a CO2药材 4017.9±2.9 108.8±29.410.4±3.2 57.1±21.9 7.1±3.9**43.8±22.7**阳性对照 氢化可的松 205.0±2.4**34.8±18.0 2.4±1.3**13.8±7.8**2.2±1.4**13.4±8.6模型组5％丙二醇 - 20.4±2.8 124.8±21.113.4±3.3 73.7±20.9 12.5±4.1 82.5±28.9**备注1.氢化可的松、芦丁、没食子酸用生理盐水配制，其余样品用5％丙二醇配制。2.除根醇提粉样品在丙二醇中分散较难而超声4小时外，其余样品均超声10分钟处理。3.“*”“**”分别表示与模型组比较P＜0.05、P＜0.01。
试验表明，本发明使用小鼠耳部巴豆油炎症模型，根据小鼠耳肿胀生物活性测定法，定性定量地测定出头花蓼及其不同药用部位和不同提取工艺得到的提取物和制品的抗炎活性。实验采用小鼠静脉注射给药，可以比较出头花蓼及其各提取物样品的抗炎活性大小。以此可以用于对头花蓼不同药用部位，不同提取工艺样品的疗效作出评判。
权利要求
1.一种测定头花蓼及其提取物和制品生物活性的方法，包括如下步骤样品配制精确称量10、20、40、80mg头花蓼或其提取物和其制品粉末，置10ml刻度离心管中，加入少许生理盐水，超声振荡至少3分钟，使头花蓼提取物粉末均匀分散在生理盐水中，随后准确添加生理盐水至10ml刻度，备用；给药每小鼠按体重尾单次静脉注射0.2-1.0ml/20g上述药液，单次静脉注射5分钟后，每只小鼠右耳内侧均匀涂抹巴豆油致炎剂；测定4小时后准时处死小鼠，取二耳，用打孔器冲下左右二耳片，分别称重，二耳重量差值为肿胀度，再按下公式计算肿胀抑制率％。
2.根据权利要求1的方法，其中在样品配制步骤中超声振荡5-10分钟。
3.根据权利要求1-2之一的方法，其中的给药步骤中，每小鼠按体重尾单次静脉注射0.2ml/20g样品配制药液，单次静脉注射10分钟后，每只小鼠右耳内侧均匀涂抹巴豆油致炎剂。
4.根据权利要求3的方法，其中巴豆油致炎剂的浓度是1％(w/w)。
5.根据权利要求4的方法，其中巴豆油致炎剂的溶媒为乙醇∶水∶乙醚＝25∶5∶70的混合物。
全文摘要
本发明涉及一种测定头花蓼及其提取物和制品生物活性的方法，包括如下步骤a.样品配制精确称量头花蓼或其提取物和其制品粉末，置10ml刻度离心管中，加入少许生理盐水，超声振荡，使头花蓼提取物粉末均匀分散，随后准确添加生理盐水至10ml刻度，备用；b.给药每小鼠注射上述药液，5分钟后，每只小鼠涂抹巴豆油致炎剂；c.测定4小时后准时处死小鼠，用打孔器冲下左右二耳片，分别称重，二耳重量差值为肿胀度，再按公式计算肿胀抑制率。
文档编号G01N33/15GK1534285SQ0312150
公开日2004年10月6日 申请日期2003年4月2日 优先权日2003年4月2日
发明者梁斌, 王子厚, 李孟林, 张丽艳, 庄镇华, 荣祖元, 张淑华, 叶晓鸣, 梁 斌 申请人:贵州威门药业股份有限公司