专利名称：重组蛋白a基因及其表达产物的制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种重组蛋白A基因、含有重组蛋白A基因的载体以及该载体转化的菌株和重组蛋白A基因表达产物的制备与应用。
背景技术：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了A抗原，并证明它是一种蛋白质，且与糖有区别，Grov(1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A(Protein A)。由于SPA的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种有用的工具。
编码SPA的基因于1983年被克隆并在E.coli中表达(Duggleby，C.J and Jones，SAcloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichiacoli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene forStaphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。对SPA结构和功能的研究发现，SPA分子包含A、B、C、D、E五个同源结构域，每个结构域都有能与IgG自主结合的能力。SPA基因有1600bp，SPA基因序列及其编码的氨基酸序列见序列表SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。
由于葡萄球菌蛋白A具有与大多数哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，因此被广泛应用于单克隆抗体或多克隆抗体的分离纯化和检测，但使用葡萄球菌蛋白A进行分离纯化的抗体的纯度有待提高。SPA的主要来源是从金黄色葡萄球菌蛋白中提取而来，SPA占菌体总蛋白的1.7％。由于金黄色葡萄球菌是一种致病菌，同时，其菌体蛋白的分离纯化存在一定困难，因此，通过基因工程方法获得重组蛋白A成为一种重要的备选方法，为大规模生产蛋白A提供了新的、安全的途径。
发明内容
本发明提供了1.重组蛋白A基因；2.构建含有该基因的载体，特别是表达载体；3.提供由该基因转化的微生物菌株；4.提供由这些转化菌株高效表达、生产重组蛋白A的方法；5.表达产物的应用。
发明的重组蛋白A基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，各重组蛋白A基因单体间以Acc I酶切位点相连，其中第一个重组蛋白A基因单体前端加入GAATTCATATGGTG，包括起始密码子ATG和与表达载体pBV220(Zhang ZQ，Yao LH，HouYD.Construction and application of a high level expression vector containing P RP L promoter.BingduXuebao，1990；6111-116)相连的EcoR I酶切位点，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入GTAGACTAAGGATCC，其中包括中止密码子TAA和与表达载体pBV220相连的BamH I酶切位点。该基因的基本特征如下a.序列特征类型核酸链数双链b.分子类型DNAc.来源人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成d.该基因的结构由3个重组蛋白A基因单体串连而成。该基因由551个核苷酸构成，编码178个氨基酸。该基因序列及其编码的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.1、SEQID No.2。
本发明还构建了含有上述重组蛋白A基因的载体，这些载体的构建方法是按照常规方法，将通过人工合成的重组蛋白A基因单体酶切后接入相应载体的相应酶切位点之间，再以Acc I内切酶酶切，连接成包含多个串连重组蛋白A基因单体的重组蛋白A基因表达载体。
上述含重组蛋白A基因的大肠杆菌表达载体优先由本发明合成的重组蛋白A基因与大肠杆菌表达载体pBV220构建成的重组表达载体，命名为pBVA20，其构建过程如图1所示。
本发明还提供了利用上述含大肠杆菌重组表达载体的大肠杆菌重组株生产重组蛋白A的方法，该方法是将菌种进行培养发酵并经热诱导使其高效表达重组蛋白A，再收集菌体，经分离纯化得到重组蛋白A产品。
本发明上述能表达重组蛋白A的大肠杆菌菌株优先为由含有重组蛋白A基因的表达载体pBVA20转化大肠杆菌DH5α得到的菌株，命名为Escherichia coli DH5α/pBVA20，简称DH5α/pBVA20。
利用大肠杆菌重组菌株DH5α/pBVA20生产重组蛋白A的具体方法为1.种子液的制备将菌种接种于三角瓶，接种量1-2％V/V，于30℃培养过夜；当O.D600达到3-3.5时即可接种发酵；上述所用种子培养基为LB培养基加100-200mg/l氨苄青霉素；2.发酵在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶20-1∶5接种于发酵培养基上，30℃发酵至O.D600达到0.4-0.8时，升温至42C诱导，诱导3～5小时后4℃8000转/分离心10分钟收菌；3.重组蛋白A的分离纯化1)粗提将上述收集菌体用NaCl+磷酸盐缓冲液(7.0-8.0)悬浮，超声破碎，4℃8000转/分离心10分钟，收集上清，得粗提液。
经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法提取表达于大肠杆菌胞周质的重组蛋白A效果很好，粗提后大部分重组蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微；2)纯化将粗提液进行Sephacryl S200分子筛(法玛西亚公司生产)纯化，以PBS(Ph 7.4)为缓冲液将粗提液上Sephacryl S200分子筛，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组蛋白A，其纯度可达90％以上。
本发明生产的重组蛋白A表达于大肠杆菌胞周质中，有利于表达产物的分离纯化。利用本发明表达生产重组蛋白A，具有表达量效率高，表达量大(占细菌可溶性蛋白总量的60-80％)，表达时间短(仅3-5小时)，易于纯化等优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组蛋白A与野生型蛋白A结合活性相近，而与抗体间的结合力稍弱。
本发明采用温控型大肠杆菌表达系统生产重组蛋白A，还具有生产周期短(1天)，消耗低，能有效地降低成本，有利于基因工程重组蛋白A的产业化应用。
将本发明的重组蛋白A基因的表达产物重组蛋白A用于与各种不同的层析介质载体如琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、带羟基的高分子聚合物、硅胶等偶联成为亲和层析介质用于抗体的分离纯化。
本发明生产的重组蛋白A与野生型的金黄色葡萄球菌蛋白A相比，其与抗体结合的亲和力稍弱，使抗体结合后的洗脱条件更温和，有利于保持抗体的活性，使抗体分离纯化效果良好，抗体纯度可一步大于95％。
上述亲和层析介质可以由以下步骤制备1.用环氧氯丙烷、氢氧化钠与相应介质在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-4小时，反应完后清洗至中性后抽干；2.再与本发明的重组蛋白A在4-25℃温度下反应16-20小时反应完后清洗再抽干；清洗后得到上述亲和层析介质。
以上步骤所得亲和层析介质稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。上述亲和层析介质也可以用溴化氰活化方法以及其他方法制备。
图1是重组表达载体pBVA20构建的示意图，其中，PR、PL为噬菌体启动子，T1、T2为的转录终止序列。
图2是重组蛋白A表达产物的SDS-PAGE电泳图。其中，M是标准分子量对照，泳道1是42℃诱导含pBV220空载体的DH5α/pBV220菌体，泳道2是42℃诱导表达的DH5α/pBVA20菌体，泳道3是42℃诱导表达的DH5α/pBVA20菌体培养上清。
图3是重组蛋白A表达产物分步纯化的SDS-PAGE电泳图。其中，M是标准分子量对照，泳道1是诱导表达的DH5α(pBVA20)菌体，泳道2、泳道3是菌体粗提后初步纯化的重组蛋白A，泳道4是菌体粗提后经分子筛Sephacryl S200纯化后的重组蛋白A。
图4是重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF分离腹水中的IgG2a的分离纯化色谱图；图5是重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF分离腹水中的IgG2a的SDS-PAGE电泳结果图，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；图6是重组蛋白A葡聚糖凝胶分离腹水中的IgG2a的分离纯化色谱图；图7是重组蛋白A葡聚糖凝胶分离腹水中的IgG2a的SDS-PAGE电泳结果图，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；图8是重组蛋白A纤维素凝胶分离腹水中的IgG2a的分离纯化色谱图；图9是重组蛋白A纤维素凝胶分离腹水中的IgG2a的SDS-PAGE电泳结果图，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；图10是重组蛋白A聚乙烯醇凝胶分离腹水中的IgG2a的分离纯化色谱图；图11是重组蛋白A聚乙烯醇凝胶分离腹水中的IgG2a的SDS-PAGE电泳结果图，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a具体实施方式
以下通过实施例结合附图对本发明作进一步详细说明，这并不限制本发明的范围。
实施例1 重组蛋白A基因单体的合成通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白A基因单体的两条链，退火获得重组蛋白A基因单体序列。其序列包括长度为174bp，两端是Acc I酶切位点，用于多个重组蛋白A基因单体构建的重复序列区。另外，还包括起始密码子ATG，第二密码子GTG，终止密码子TAA，及克隆用EcoR I及BamH I限制性内切酶接头共29bp。上述过程见说明书附1。
实施例2 含一个重组蛋白A基因单体的pBV220载体的构建用限制型内切酶EcoR I和BamH I将上述重组蛋白A基因单体切下，与经EcoR I及BamHI酶切的载体pBV220连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明重组蛋白A基因单体已克隆至pBV220中。上述过程见说明书附图之图1。
实施例3 含有重组蛋白A基因的pBVA20载体的构建将上述含一个重组蛋白A基因单体的pBV220载体及重组蛋白A基因单体以AccI酶切，回收相应片段后连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有重组蛋白A基因的pBVA20载体。上述过程见说明书附图之图1。
实施例4 能高效表达重组蛋白A的大肠杆菌菌株DH5α/pBVA20的构建用CaCl2法将pBVA20转化E.coli DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pBVA20的重组转化子DH5α/pBVA20。上述过程见说明书附图之图1。
实施例5 利用大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20生产重组蛋白A1)菌种的培养发酵挑取大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20，接种于LB培养基中，接种量1-2％V/V，于30℃培养过夜；次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶20-1∶5接种于发酵培养基上，30℃发酵至O.D600达到0.4-0.8时，升温至42℃诱导，诱导3～5小时后离心收菌；取少量细胞加2×上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准做SDS-PAGE凝胶电泳，结果如说明书附2，经诱导的E.coli DH5α/pBVA20菌体及上清在20kD的位置出现一条新的蛋白带(见图2泳道1及泳道3)，DH5α/pBV220(DH5α/pBV220为转化了pBV220空载体的DH5α菌，见图2泳道1)不出现此带，证明重组蛋白A已在E.coli DH5α/pBVA20中诱导表达。
2)表达的重组蛋白A的纯化将上述收集菌体用NaCl+磷酸盐缓冲液(pH7.0-8.0)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法提取表达于大肠杆菌胞周质的重组蛋白A效果很好，粗提后大部分重组蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微；将粗提液进行Sephacryl S200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组蛋白A，其纯度可达90％以上。
实施例6 重组蛋白A用于抗体检测，Elisa检测表达的重组蛋白A与抗体结合的实验1)包被96孔板，每孔包被重组蛋白A样品100μl，37℃，1小时。
2)封闭每孔以100μl 1％的BSA封闭，37℃，1小时。
3)加一抗每孔加入约100μg人抗体，37℃，1小时。
4)加二抗每孔加入约100μl 11000辣根标记抗体，37℃，1小时。
5)显色。
经Elisa检测表明本发明提取的重组蛋白A与人抗体有强结合活性，与野生型蛋白A结合活性相近，每孔包被5ng重组蛋白A即可获得明显检测信号。结果显示重组蛋白A可用于抗体的检测。
实施例7 重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF的制备1.用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖(6％的交联琼脂糖凝胶)在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-4小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；2.再与本发明的重组蛋白A在4-25℃温度下反应16-20小时反应完后清洗再抽干；重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF具有以下特性1.特点基团脱落少，结合特异性强2.基质6％的交联琼脂糖凝胶3.配基重组蛋白A4.配基密度≈6mg重组蛋白A/ml5.吸附载量2-5mg鼠IgG2a/ml6.亲和介质的颗粒大小50-160μm7.最大流速200cm/h8.pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-119.使用温度常温10.保存温度+4～8℃11.保存液体20％乙醇如果待分离纯化的抗体与亲和层析介质间的吸附力比较弱，则可适当提高吸附缓冲液的pH值和盐浓度，即可获得较好的分离效果。
实施例8 重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF从小鼠腹水中分离纯化IgG2a1、重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液A平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；3、将2ml小鼠腹水用缓冲液A稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；4、用缓冲液A再洗5-10个床体积，流速为1ml/min；5、用缓冲液B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰6、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存7、将分离纯化的IgG2a与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析。
备注柱子每使用几次后应该用以缓冲液C流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。
缓冲液组成缓冲液A20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.2M NaH2PO419ml，0.2M Na2HPO4 81ml，NaCl9g加水至1000ml。
缓冲液B20mM柠檬酸缓冲液，pH4.0。配制柠檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH调至pH 4.0，加水至1000ml。
缓冲液C0.5M醋酸缓冲液，pH3.0。配制0.5M醋酸溶液用固体NaOH调至pH 3.0。
缓冲液D1M Tris-HCl缓冲液，pH9.0。配制Tris盐121.14g，加水至950ml，浓盐酸调pH至9.0，加水至1000ml。
结果分离纯化色谱图见图4；SDS-PAGE电泳分析结果见图5，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链。试验结果表明了本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和层析介质一步就可以得到纯度大于95％的IgG2a。
实施例9 重组蛋白A葡聚糖凝胶的制备1.用环氧氯丙烷、氢氧化钠与葡聚糖在水介质中进行反应，在30-55℃的温度下反应2-4小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；2.再与本发明的重组蛋白A在4-25℃温度下反应16-20小时反应完后清洗再抽干；3 蒸馏水清洗后得到重组蛋白A葡聚糖凝胶，它具有与重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF相同的特性。
实施例10 重组蛋白A葡聚糖凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2a与实施例8中重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF相同的步骤、应用相同的缓冲液，用重组蛋白A葡聚糖凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2a；结果分离纯化色谱图见图6；SDS-PAGE电泳分析结果见图7，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A葡聚糖凝胶亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链。试验结果表明了本发明的重组蛋白A葡聚糖凝胶亲和层析介质一步就可以得到纯度大于95％的IgG2a。
实施例11 重组蛋白A与纤维素偶联的亲和层析介质重组蛋白A纤维素凝胶的制备1.用环氧氯丙烷、氢氧化钠与纤维素在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-4小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；2.再与本发明的重组蛋白A在4-25℃温度下反应16-20小时反应完后清洗再抽干；3.蒸馏水清洗后得到重组蛋白A纤维素凝胶，它具有与重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF相同的特性。
实施例12 重组蛋白A与纤维素偶联的亲和层析介质重组蛋白A纤维素凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2a与实施例8中重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF相同的步骤、相同的实验条件、应用相同的缓冲液，用重组蛋白A纤维素凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2a；结果分离纯化色谱图见图8；SDS-PAGE电泳分析结果见图9，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A纤维素凝胶亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链。试验结果表明了本发明的重组蛋白A纤维素凝胶亲和层析介质一步就可以得到纯度大于95％的IgG2a。
实施例13 重组蛋白A与带羟基的高分子聚合物等载体偶联的亲和层析介质的制备1.用环氧氯丙烷、氢氧化钠与带羟基的高分子聚合物聚乙烯醇在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-4小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；2.再与本发明的重组蛋白A在4-25℃温度下反应16-20小时反应完后清洗再抽干；3.蒸馏水清洗后得到重组蛋白A聚乙烯醇凝胶，它具有与重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF相同的特性。
实施例14 重组蛋白A与带羟基的高分子聚合物偶联的亲和层析介从小鼠腹水中分离纯化IgG2a与实施例8中重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF相同的步骤、相同的实验条件、应用相同的缓冲液，用重组蛋白A聚乙烯醇凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2a；结果分离纯化色谱图见图10；SDS-PAGE电泳分析结果见图11，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A纤维素凝胶亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链。试验结果表明了本发明的重组蛋白A纤维素凝胶亲和层析介质一步就可以得到纯度大于95％的IgG2a。对说明书中的名词的解释1.葡萄球菌蛋白A简称SPA或蛋白A(ProteinA)。
2.pBVA20为含有本发明专利所述的目的蛋白A的pBV220。
3.pBV220一种温控型大肠杆菌表达载体。
4.E.coliDH5α大肠杆菌菌株DH5α。
5.DH5α/pBV220为转化了pBV220的Escherichia coli DH5α菌；DH5α为Escherichia coli DH5α的简称。
6.BSA牛血清白蛋白。
7.重组蛋白A基因单体即构成重组蛋白A基因的基因基本单位，有相对独立的结构。
序列表(1)一般信息发明名称重组蛋白A基因及其表达产物的制备与应用序列数目4(2)SEQ ID No1的信息(I)序列特征(A)类型核酸(B)长度551个碱基(C)链数双链(II)分子类型DNA(III)序列描述GAATTCATAT GGTGGTAGAC AACAAATTCA ACAAAGAACA ACAAAACGCG TTCTATGAGATCTTACATTT ACCTAACTTA AACGAAGAAC AACGAAACGC CTTCATCCAA AGTTTAAAAGATGACCCAAG CCAAAGCGCT AACCTTTTAG CAGAAGCTAA AAAGCTAAAT GATGCTCAGGCGCCGAAAGT AGACAACAAA TTCAACAAAG AACAACAAAA CGCGTTCTAT GAGATCTTACATTTACCTAA CTTAAACGAA GAACAACGAA ACGCCTTCAT CCAAAGTTTA AAAGATGACCCAAGCCAAAG CGCTAACCTT TTAGCAGAAG CTAAAAAGCT AAATGATGCT CAGGCGCCGAAAGTAGACAA CAAATTCAAC AAAGAACAAC AAAACGCGTT CTATGAGATC TTACATTTACCTAACTTAAA CGAAGAACAA CGAAACGCCT TCATCCAAAG TTTAAAAGAT GACCCAAGCCAAAGCGCTAA CCTTTTAGCA GAAGCTAAAA AGCTAAATGA TGCTCAGGCG CCGAAAGTAGACTAAGGATC C
(3)SEQ ID No2的信息(I)序列特征(A)类型氨基酸(B)长度178个氨基酸(II)分子类型蛋白质(III)序列描述Met Val Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr GluIle Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile GlnSer Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala LysLys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys GluGln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu GluGln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser AlaAsn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys ValAsp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu HisLeu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu LysAsp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu AsnAsp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp(4)SEQ ID No3的信息(I)序列特征(A)类型核酸(B)长度1600个碱基(C)链数双链(II)分子类型DNA
(III)序列描述tgattttgcg gttttaagcc ttttacttcc tgaataaatc tttcagcaaa atatttattttataagttgt aaaacttaca tttaaattta attataaata tagattttag tattgcaatacataattcgt tatattatga tgactttaca aatacataca gggggtatta atttgaaaaagaaaaacatt tattcaattc gtaaactagg tgtaggtatt gcatctgtaa ctttaggtacattacttata tctggtggcg taacacctgc tgcaaatgct gcgcaacacg atgaagctcaacaaaatgct ttttatcaag tgttaaatat gcctaactta aacgctgatc aacgtaatggttttatccaa agccttaaag atgatccaag ccaaagtgct aacgttttag gtgaagctcaaaaacttaat gactctcaag ctccaaaagc tgatgcgcaa caaaataact tcaacaaagatcaacaaagc gccttctatg aaatcttgaa catgcctaac ttaaacgaag cgcaacgtaacggcttcatt caaagtctta aagacgaccc aagccaaagc actaatgttt taggtgaagctaaaaaatta aacgaatctc aagcaccgaa agctgataac aatttcaaca aagaacaacaaaatgctttc tatgaaatct tgaatatgcc taacttaaac gaagaacaac gcaatggtttcatccaaagc ttaaaagatg acccaagcca aagtgctaac ctattgtcag aagctaaaaagttaaatgaa tctcaagcac cgaaagcgga taacaaattc aacaaagaac aacaaaatgctttctatgaa atcttacatt tacctaactt aaacgaagaa caacgtaacg gcttcatccaaagccttaaa gacgatcctt cagtgagcaa agaaatttta gcagaagcta aaaagctaaacgatgctcaa gcaccaaaag aggaagacaa caaaaaacct ggtaaagaag acggcaacaaacctggcaaa gaagacggca acaagcctgg taaagaagac aacaaaaaac ctggtaaagaagacggcaac aagcctggta aagaagacaa caacaaacct ggcaaagaag acggcaacaagcctggtaaa gaagacaaca acaagcctgg taaagaagac ggcaacaagc ctggtaaagaagacggcaac aaacctggta aagaagacgg caacggagta catgtcgtta aacctggtgatacagtaaat gacattgcaa aagcaaacgg cactactgct gacaaaattg ctgcagataacaaattagct gataaaaaca tgatcaaacc tggtcaagaa cttgttgttg ataagaagca
accagcaaac catgcagatg ctaacaaagc tcaagcatta ccagaaactg gtgaagaaaatccattcatc ggtacaactg tatttggtgg attatcatta gccttaggtg cagcgttattagctggacgt cgtcgcgaac tataaaaaca aacaatacac aacgatagat atcattttatccaaaccaat tttaacttat atacgttgat taacacattc(5)SEQ ID No4的信息(I)序列特征(A)类型氨基酸(B)长度450个氨基酸(II)分子类型蛋白质(III)序列描述MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
权利要求
1.一种重组蛋白A基因，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的碱基序列。
2.一种重组蛋白A，由序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列组成。
3.一种重组载体，它含有权利要求1所述的重组蛋白A基因。
4.含有权利要求1所述的重组蛋白A基因的重组载体pBVA20。
5.含有权利要求3所述的重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有权利要求1所述的重组蛋白A基因。
6.一种制备重组蛋白A基因的表达产物的方法，其特征是，制备所述的重组蛋白A基因的表达产物的过程是先构建含有重组蛋白A基因的表达载体；再将含有重组蛋白A基因的表达载体转入大肠杆菌DH5α中形成大肠杆菌重组株；经菌株培养，诱导使其高效表达重组蛋白A，再经分离纯化得到重组蛋白A。
7.一种亲和层析介质，其特征为，它由重组蛋白A和层析介质载体组成。
8.根据权利要求1所述的重组蛋白A基因，其特征是，所述的重组蛋白A基因编码的重组蛋白A用于抗体检测、分离、纯化。
9.根据权利要求2所述的重组蛋白A，其与抗体结合的亲和力稍弱，使抗体结合后的洗脱条件更温和，有利于保持抗体的活性，从而达到良好的抗体分离纯化效果。
10.根据权利要求7所述的亲和层析介质，其特征为，所述的层析介质载体可以是琼脂糖凝胶或葡聚糖或纤维素或硅胶或带羟基的高分子聚合物。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域。本发明是将设计的化学合成重组蛋白A(rPA)结构单元基因集团串连重复插入热诱导型大肠杆菌载体，构建了含有该基因的大肠杆菌表达载体pBVA20及其转化的大肠杆菌DH5α(pBVA20)重组株和利用此菌株生产重组蛋白A的方法。此菌株所产生的可溶性重组蛋白A浓集于细菌胞间质中，达到细菌可溶性蛋白总量的60－80％，以后只经一步分子筛柱层析即可将rPA纯化到90％以上纯度，该菌株具有表达量高、成本低、表达产物易纯化等优点。本发明将为获得来源稳定，价格便宜的重组蛋白A并用其制备多种抗体分离装置提供一条切实可行的途径。
文档编号G01N33/577GK1524957SQ0314998
公开日2004年9月1日 申请日期2003年8月1日 优先权日2003年2月26日
发明者吴小兵, 杨宇, 韦新桂 申请人:本元正阳基因技术股份有限公司