专利名称：一种稳定的新型即用型底物－dab显色液的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫组织化学领域，主要产品为稳定的即用型底物-DAB显色液。此底物-DAB溶液包含缓冲液(首推咪唑缓冲液)，过氧化氢底物，显色的有机电子供体以及作为稳定剂的碳水化合物电子供体。底物-DAB溶液具有完全的过氧化物活性。
背景技术：
过氧化物活性的检测已被广泛应用于分析化学、生物化学和临床化学中。在多数检测中，过氧化物和显色的电子供体与样品中分析物反应，此分析物可能是催化剂(如法医样品或粪便、尿液、血浆、血清中的亚铁血红素、血色素等)或与催化剂相关的物质(酶标过氧化物酶)。如果样品中含有此分析物，则会发生过氧化反应，并在几秒到几小时内发生可见的显色反应。过氧化活性检测也适用于固定在滤膜、细胞或组织切片、电泳凝胶、杂交斑点上分析物的定位分析。
免疫学或核酸检测系统中常用的酶标记为辣根过氧化物酶(HRP)，在过氧化氢(H2O2)存在情况下，HRP催化苯酚、萘酚、胺、二胺或其它可以产生在光学和电子显微镜及比色法或肉眼下可见显色底物的化合物。HRP可以将2个过氧化氢分子分解成氧气和水，在这一反应中，首先HRP将一对电子供给过氧化氢分子，接着HRP从合适的有机供体中得到电子，反应完成时HRP-有机供体复合体可以在反应部位形成可溶性的或不可溶沉淀。
发明内容
(一)发明目的目前常规分析方法的不足之处是自动化的氧化反应，即检测到的过氧化物活性可能是过氧化物与有机电子供体在加入催化酶之前就直接反应造成的“背景”，使指示剂的有效时间限制在几小时内；这种氧化反应还可能是染色液和痕量氧化剂如过渡态金属造成的污染。因此本发明的目的就是提供稳定的底物—显色液复合物，以适于可见、热计量、分光光度、反射计分析；并且还提供了这些稳定底物—显色液复合物的使用方法。
(二)发明优势常规方法的显色液与底物分开存放，测试时要将底物—显色液预先混合。与之相比，本发明为稳定的底物—显色液复合物，既节省储存空间，又缩短检测时间，同时提高检测的灵敏度及可靠性；而且DAB为诱癌物质，本发明的产品避免了操作人员与DAB的直接接触，降低了危害性。
发明内容详述本发明包括缓冲体系(pH3-8)、显色电子供体以及作为稳定剂的碳水化合物形式电子供体以及一个聚合物。
碳水化合物电子供体可以从下列物质中挑选单糖、二糖、多糖，它们可以抑制显色电子供体的自动氧化活性。
底物缓冲液的pH在3-8之间，采用咪唑或者含咪唑的其它缓冲液混合物；尽管不同的过氧化物分析可在较宽的pH范围内进行，但大部分HRP分析的最佳pH值在4-6之间。在聚合物存在时，咪唑-HCl由于对显色电子供体的溶解能力强以及在pH5.0-7.8之间的强缓冲能力而成为理想的缓冲液；而且咪唑能提高DAB的氧化能力，它的终浓度在1-500mM尤其是50mM时效果最佳。
聚合物是一类由重复的简单分子形成的高分子量分子，大多聚合物分子在加成聚合化反应中形成碳碳间烯键。在底物溶液中加入聚合物可以提高显色电子供体的溶解性并降低其自发氧化反应。首推聚合物是聚乙烯乙二醇PEG或丙烯乙二醇PG，终浓度在1-1000mM.之间。
由于强溶解力及无毒性，本发明建议采用过氧化氢和脲过氧化氢作为过氧化物，终浓度在0.1-10mM之间，它们的灵敏度高于烷基过氧化氢。
具体实施例方式
(一)底物-DAB复合物配方工作浓度50mM咪唑，pH6.0，含有7.5mM PEG(分子量3350)，2.94mM H2O2和2.77mMDAB-4HCl以及10mM木糖。
一般配制储备液(20×，100mL的pH7.5、0.5M Tris-HCl溶液)6.8g咪唑，终浓度1M2.51g PEG(分子量3350)，终浓度7.5mM2g DAB-4HCl，终浓度55.4mM150mg木糖，终浓度10mMH2O2(20×)储备液0.45％H2O2溶液(二)免疫组化检测免疫组化检测时，完成样品的HRP试剂孵育并冲洗样品后，即可用本发明产品进行显色1.H2O2与底物—DAB复合物等比例混匀。该溶液避光保存，30分钟内有效。
2.第一步制备的溶液覆盖样品，孵育4-10分钟，显微镜下观察染色结果，为棕黄色。
(三)结果免疫组化分析结果显示，基于底物—DAB复合物的显色法比传统的DAB显色法简捷、快速、具有更高的检测灵敏度及可靠性。
权利要求
1.本发明涉及到免疫组化分析的显色反应，可以用于免疫组织化学分析以及Western杂交分析。此底物-DAB溶液包含缓冲液(首推咪唑缓冲液，pH3-8)，过氧化氢底物，显色的有机电子供体，作为稳定剂的碳水化合物电子供体以及一个聚合物。其特色为碳水化合物电子供体及聚合物的加入，降低了显色电子供体的自动氧化活性，提高显色电子供体的溶解性。
全文摘要
本发明属于免疫组织化学领域，鉴于目前显色溶液不稳定且易污染、对人体有伤害，本发明采用新型底物－DAB显色液。此显色液包含缓冲液(首推咪唑缓冲液)，过氧化氢底物，显色的有机电子供体，作为稳定剂的碳水化合物电子供体以及一个聚合物。其中聚合物用于提高显色电子供体的溶解性并降低其自发氧化反应。本发明可以用于免疫组化分析或核酸杂交分析。基于底物－DAB复合物的显色法与传统的DAB显色法相比，具有稳定简捷、高灵敏度及可靠性。
文档编号G01N33/535GK1595150SQ0315089
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月10日 优先权日2003年9月10日
发明者肖国伟 申请人:上海长岛生物技术有限公司