专利名称：过氧化物酶的荧光检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光化合物及采用该荧光化合物检测过氧化物酶的方法。本发明还涉及使用这些方法来检测与过氧化物酶或者与特定结合对的一员连接的分析物，该结合对对于过氧化物酶标记的特定的结合伙伴具有特定的亲合力。
背景技术：
诸如辣根过氧化物酶(HRP)之类的过氧化物酶在生物分子和其他感兴趣的分析物，例如药品、激素、类固醇、癌症标志物，的酶连接试验中经常被用作标志物或标记物。通过使用会产生可检测物的底物可实现这些酶的检测。例如邻苯二胺、ABTS或者N-四甲联苯胺(TMB)等的显色底物产生有色的反应产物，荧光底物产生发荧光的产物，而化学发光的底物产生作为可检测物的光。这些方法中的每一种均能提供安全、便利和灵敏的手段来对样品中的酶的数量或者酶标记分析物或用于分析物的被标记的特定结合伙伴的数量提供定量测量。
a.化学发光的过氧化物酶底物申请人在专利号为5491072、5523212和5593845的美国专利公开了化学发光的N-烷基二氢化吖啶羧酸酯、硫酯和磺酰亚胺，当它们与过氧化物和过氧化物酶反应时产生了用于过氧化物酶的检测和试验中的光。专利号为5545834的美国专利描述了螺环二氢化吖啶化合物(spiroacridan compounds)和过氧化氢的化学发光的反应。该反应通过添加辣根过氧物酶(HRP)而得以加强。
总称为荧光素的生物起源的各种化合物均被过氧化物酶氧化(概括于L.J Kricka和G.H.G.Thorpe，在Luminescence Immunoassay andMolecular Applications，K.Van Dyke and R.van Dyke，eds.，CRC Press，Boca Raton，1990，pp.77-98)。在某些实例中，当所述酶用作氧化酶时，不使用过氧化氢。
b.荧光过氧化物酶底物U.S.6,040,150公开了一种从荧光底物和过氧化物酶的反应中生成荧光报告化合物的改进方法。该方法包括将一种包括3-(4-羟苯基)-丙酸的酚类化合物用作底物。其他的酚类荧光底物在Zaitsu and Ohkura，Anal.Biochem.，109，109-113(1980)中有所公开，并包括2-(4-羟苯基)乙酸、高香草酸和酪胺(Y.Li，et al.，Anal.Chim.Acta，(340)，159-168，(1997))。其他公知的荧光过氧化物酶底物包括邻苯二胺和N，N′-二氰基甲基-邻苯二胺(Li，et al.，Microchem.J.，53(4)，428-436(1996))、对-氨基苯酚的酰胺和氨基甲酸酯衍生物(M.Kawaguchi，et al.，Bioluminescence and Chemeluminescence Perspectives for the 21stCentury，A.Roda et al.，Eds.，Wiley&Sons，Chichester，pp 508-511，(1999))、3，4-二氢-2(1H)-喹喔啉和相关衍生物(Li，et al.，Anal.Chim.Acta，340(1-3)，159-168(1997))，荧光素、若丹明和其他黄嘌呤染料的还原形式以及后者的氟化衍生物(专利号为6,162,931的美国专利和公开号为WO99/01768的PCT专利申请)。
c.吖啶鎓(acridinium)标记物的荧光检测在化学发光技术中，吖啶鎓酯和酰胺是公知的。这些化合物通常被用来标记要在试验中检测的底物。依据化学发光的检测包括标记物和强碱性的过氧化氢溶液的反应。吖啶鎓标记化合物的荧光试验也已经被描述，其中通过它们固有的荧光来测量这些相同的化学发光化合物(D.O.Shan and V.A.Salbilla，Proceedings of the 11th InternationalSymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence，J.F.Case et al.，Eds.，Wiley&Sons，Chichester，pp 235-238，(2001))。
图1示出了从包含化合物10和HRP的反应溶液中获得的一系列有序的荧光光谱。该光谱对应于吖啶鎓产物的荧光。为了便于比较，示出了甲基N-甲基吖啶鎓的独立制备样品的荧光光谱。
图2示出了从图1所述的反应中生成荧光产物的时间过程。通过在357nm处激发并在495nm处检测荧光发射来监视该产物。
图3示出了根据本发明的方法执行而使用荧光底物检测HRP的线性度。将存在于醋酸盐缓冲液中，包含0.05mM底物1或4、0.1mM 4-苯基苯酚、0.5mM过氧化脲、1mM EDTA、0.025％TWEEN 20的溶液(pH 5)，和存在于10mM tris中的0.05mM底物2、0.1mM 4-苯基苯酚、0.5mM过氧化脲、1mM EDTA、0.025％TWEEN 20的溶液(pH8)与指示量的HRP一起进行反应。在15-20分钟的反应周期后，所测量的荧光强度处于最大值。术语强度背景(Intensity-Background)是指对缺少HRP时的背景荧光(B)进行存在HPR时的修正后，以相对光单位表示的荧光强度。在这种方式下可检测到小于1amol(渺摩尔)的HRP。
图4示出了从包含化合物12和HRP的反应溶液中获得的一系列有序的荧光光谱。该光谱揭示了吖啶鎓酯中间体和N-甲基吖啶酮产物的形成。
图5示出了通过荧光和化学发光检测，采用包含底物13的试剂组合物进行HRP检测的线性度。10mM tris中包含0.05mM化合物13、0.1mM 4-苯基苯酚、0.5mM过氧化脲、1mM EDTA、0.025％TWEEN20的溶液(PH 8.0)，与指示量的HRP进行反应。在加入酶后10分钟检测化学发光强度，加入酶后30分钟检测515nm的荧光。
发明目的因此，本发明的一个目的是提供一种用于制造荧光化合物的方法，该方法包括使一种过氧化物酶的荧光底物与一种过氧化物酶进行反应。另一个目的是提供一种检测过氧化物酶的方法，该方法包括通过使一种荧光底物与过氧化物酶反应以制成一种荧光反应产物，然后检测所述荧光反应产物。另一个目的是提供一种在试验过程中检测分析物的方法，其中使用一种过氧化物酶对被标记的分析物或者被标记的分析物结合的化合物进行标记，然后所述过氧化物酶与一种荧光过氧化物酶底物反应以制成一种荧光反应产物。
优选实施方案的描述本发明涉及荧光化合物，当该荧光化合物与过氧化物酶和过氧化物反应时产生荧光。在实施本发明的方法中有用的化合物将落入依赖于使用模式的两个范畴之一。
本发明的一组化合物具有通式I 其中将R1选自对于过氧化物的攻击呈惰性的基团，并包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子；R2选自于烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基和取代芳烷基基团；R3到R10每一个都是包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子的基团。在本文所指的意义上，对过氧化物的攻击不具惰性的基团R1包括芳基酯(-COOAr)、烷基酯(-COOR)(其中该烷基基团R被吸电子基团例如卤素、氰基和硝基取代，因为这些取代基增加了-OR基团的离去基团能力)，烷基硫酯和芳基硫酯(-COSR，COSAr)、磺酰亚胺(-CO(NR)SO2R′)、-C(＝O)X(其中X是一种卤素)以及氰基基团。基团R1优先选自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、烷硫基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧酸、羧酸盐、羧酰胺、烷基羧基酯、羧基酰肼基团、酮基、-CHO、氨基、烷基氨基、芳基氨基，以及氢原子。优选地，基团R3到R10独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。
当一个基团被称为取代的时，是指所述基团的碳骨架上的一个或多个氢原子被不同的原子或基团代替。包含在这种用法中的公知基团包括卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、三烷基硅氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷硫基、芳硫基、巯基、硝基、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、膦酸酯、氰基、羧酸酯、羧基酯、羧酰胺、羧基醛。
在一种实施方式中，通式I的荧光化合物中，R3到R10的每个取代基都将含有氢原子。这组化合物具有如下所示的通式，其中的R1和R2的定义同上。
在另一种实施方式中，通式I的荧光化合物含有至少一个对水溶性有贡献的基团。优选基团包括羧酸酯、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、铵基和膦基团。水溶性基团在R1、R2或R3-R10的位置被取代。
在另一种实施方式中，通式I的荧光化合物可包括附加的环基，该环基是通过采用连接链在该二氢化吖啶环的两个相邻的位置而结合。该附加环基将包括4-7员环，优选地，为5-6员的环。该环可包括饱和原子或其它不饱和基团如双键或苯环型的环。为了便于说明，下面将对所示的示例性结构进行描述。该附加环可进一步包括上面所定义的取代基。
在另一种实施方式中，通式I的荧光化合物选自于下列化合物1-11
在另一种实施方式中，荧光底物具有通式II 其中R1是其中含有离去基团的基团，该离去基团可被充当亲核试剂的过氧化物取代，并且该离去基团选自芳基酯(-COOAr)、取代烷基酯(-COOR)(其中该烷基基团R可被吸电子基团例如卤素、氰基和硝基取代，这些取代基增加了-OR基团的离去基团能力)，硫酯(-COSR，COSAr)、磺酰亚胺(-CO(NR)SO2R′)、-C(＝O)X(其中X是一种卤素)以及氰基基团；R2选自烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基、取代芳烷基基团；R3到R10每一个都是包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子的基团，其中R3或R10中至少有一个非H基团，在与过氧物酶活性相容的条件下，该非H基团在空间上阻碍化学发光反应生成吖啶酮产物。优选地，基团R3到R10独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。优选地，R3或R10中至少有一个是卤素、烷基或者烷氧基基团。在通式II中，相邻的取代基对能够接合在一起成为环，结合方式与通式I中所定义的相同。在与过氧物酶的酶促反应条件下，通式II的化合物形成一种稳定的吖啶鎓产物，但在与过氧物酶活性相容的条件下，通式II的化合物在空间上受到阻碍，不进行随后的化学发光反应。属于这组的代表性化合物在专利号为5,670,644和5,723,295的美国专利中有详细描述，将这些专利全部并于此以作参考，代表性化合物包括芳基和烷基酯、硫酯以及磺酰胺。
另一组荧光化合物的通式III如下所示
其中R1是其中含有离去基团的基团，该离去基团可被充当亲核试剂的过氧化物取代，并且该离去基团选自芳基酯(-COOAr)、取代烷基酯(-COOR)(其中该烷基基团R被吸电子基团例如卤素、氰基和硝基取代，这些取代基增加了-OR基团的离去基团能力)，硫酯(-COSR，COSAr)、磺酰亚胺(-CO(NR)SO2R′)、-C(＝O)X(其中X是一种卤素)以及氰基基团；R2选自烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳基和取代芳烷基基团；R3到R10每一个都是包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子的基团，但条件是通式I的化合物不包括表示为化合物12的化合物N-甲基二氢化吖啶-9-羧酸2，3，6-三氟苯基酯。优选地，基团R3到R10独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。在通式III中的相邻取代基对能够接合在一起成为环，结合方式与通式I和II中所定义的相同。
在另一种实施方式中，本发明涉及一种用于产生荧光的方法，该方法包括让通式I、II或III的化合物与一种过氧物酶以及任选的一种过氧化物反应，以生成一种荧光产物。以适当波长的光对这样形成的荧光产物进行照射，致使该荧光产物发出荧光。适于激发荧光的光波长可以利用本领域技术人员所公知的方法根据经验确定，例如通过记录吸收光谱或荧光激发光谱。选择一个使激发最大化的波长或波长范围可能是有利的，但这样做并不是必须的。激发波长也可基于光源的特性进行选择，特别是使用了单色激光光源的时候。
本方法包括两种不同的反应方式。在一种方式中，通式I或II的荧光底物转化为发荧光的环氧化吖啶鎓反应产物。由于即使存在过量的过氧化物的情况下也不在发生反应，因此在酶促反应条件下该产物积累起来。
反应路线1 生荧光的底物 发荧光的产物当荧光底物为通式I或II的化合物时，进行这一反应方式，通式I或II的化合物不允许当9位上受到过氧化物的攻击时，而发生反应路线2中所示的快速和不可逆的化学发光反应。
反应路线2 促进荧光吖啶鎓反应产物随后发生不可逆的消耗而产生化学发光的9位上的取代基和吖啶酮产物包括通式III的化合物。示例性化合物在申请人提出的专利号为5,491,072、5,523,212和5,593,845的美国专利以及专利号为6,030,803的美国专利中列出，包括芳基酯(-COOAr)、烷基酯(-COOR)(其中烷基基团R被诸如卤素、氰基和硝基之类的基团取代，这些基团提高了-OR基的离去基团能力)、硫酯(-COSR，COSAr)、磺基酰亚胺(-CO(NR)SO2R′)和氰基。
当荧光底物是通式III的化合物并且其允许在9-位上受到过氧化物的攻击之后发生快速的、不可逆的化学发光反应时，进行第二种方式的反应。这类底物的反应形成了反应路线1中所示的环氧化的吖啶鎓化合物。含有良好的离去基团且缺乏空间位阻基团的9-位取代基的存在有利于按照反应路线2发生吖啶鎓化合物进一步的化学发光发应。在这种方式中，由于荧光吖啶鎓化合物并不永久地聚集，因而更适于观察。这种反应顺序的最终反应产物是吖啶酮，其自身就具有荧光性，在430-450nm下发射最大。在这种方式中反应的化学发光化合物可用作商用化学发光检测系统(ECL Plus Chemifluorescent System，Amersham Pharmacia Biotech)的基础。在该产品中所用的过氧化物酶底物是化学发光的二氢化吖啶N-甲基-二氢化吖啶-9-羧酸2，3，6-三氟苯基酯。
似乎还未承认在反应过程中伴随着吖啶酮产物一起形成了浓度可测定的荧光吖啶鎓酯中间体，并且两种物质的荧光光谱相互不同并相互覆盖。申请人发现了这一行为事实上是在按照如上所述的第二种方式的反应进行的许多化学发光的底物中观察到的。通过检测吖啶鎓化合物或吖啶酮产物的荧光，可测定作为荧光底物的那些底物，所述底物的9-位上具有取代基，使底物能随后进行中间体吖啶鎓化合物的化学发光转换。申请人进一步发现所形成的两种种类的相对量在反应过程中发生了改变，并根据所采用的酶的用量而变化。
这一荧光行为有两个方面从根本上不同于由第一种反应方式所产生的荧光。与吖啶酮最终产物相比，吖啶鎓化合物在较短的波长处被激发，而与吖啶酮产物相比，吖啶鎓化合物在通常为约500-520nm的较长波长处被发射。换种说法，吖啶鎓中间产物的Stokes转换(斯托克斯转换)约为150nm，而吖啶酮的Stockes转换则约为50nm。更重要的是，在能产生化学发光的二氢化吖啶荧光底物的基团发生反应期间，检测瞬间形成的吖啶鎓化合物的荧光表现出完全不同的时间进程。在检测反应的终产物的过程中，信号逐渐上升到最高水平并保持不变。对中间产物的检测提供了从开始时上升一段时间然后再衰减的可检测信号。
进行第一种反应的底物跨越了很宽的pH范围和过氧化物浓度。pH只受到酶的生效范围的限制。已知过氧化物酶在约为4-10的pH范围内作用。进行第二种反应的底物的作用方式受到pH和过氧化物浓度的影响。过氧化物的高浓度和7以上的pH值促进了消耗中间产物吖啶鎓化合物。
尽管过氧化物是过氧化物酶的主要底物，但过氧化物组分是本发明任选的组分。在本领域公知的或是背景技术部分所列举的过氧化物酶催化荧光反应中，过氧化物通常是必要反应组分。然而申请人发现了在酶浓度相对较高的条件下，将生荧光底物转化为发荧光的产物这一反应中不需要过氧化物。
本发明进一步的实施方式涉及由过氧化物酶对荧光底物的作用而产生发荧光的产物这一方法在检测过氧化物酶或过氧化物酶和生物分子的偶联物的方法中的应用。过氧化物酶或者过氧化物酶偶联物与荧光底物相反应，产生发荧光的产物，然后用光照射该发荧光的产物，从而引起荧光的发射。检测荧光，荧光的量或强度与过氧化物酶的量有关。
在又一种实施方式中，本发明涉及用分析物试验中所述的荧光检测过氧化物酶偶联物的方法在其中过氧化物酶与分析物相连接或与特异性结合到分析物的结合伙伴相连接的过程中的应用。过氧化物酶与分析物或与结合分析物的伙伴的连接方式包括直接的共价连接，以及包括半抗原/抗-半抗原结合对等的不直接连接方式。例如，偶联到抗生物素蛋白链菌素或抗生物素抗体的过氧化物酶的偶联物可与生物素标记的分析物进行特异性结合或俘获生物素标记的分析物。在这些试验方法中，所形成的荧光产物的量与如上所述的过氧化物酶的量有关，且过氧化物酶的量与分析物的量有关。例如，该方法分别用于检测通过免疫分析技术产生的半抗原、抗原和抗体，由Western印迹产生的蛋白质，由Southern和Northern印迹产生的DNA和RNA。该方法也用于检测DNA测序应用中的DNA。
在又一种实施方式中，本发明还涉及将这些方法用于检测过氧化物。在可通过实验检测的某些有限范围上的过氧化物酶浓度，固定量的过氧化物酶和固定浓度的荧光底物的反应的速率与可用于反应的过氧化物的量成比例。在特定的时间间隔期间，改过氧化物的量将引起荧光产物的量发生变化。可精确测量的过氧化物的浓度范围由分析过氧化物标准物的系列稀释液而容易地测定。
在又一种实施方式中，本发明还涉及将这些方法应用于检测如过氧化物酶或脱氢酶等产生过氧化物的酶。已知过氧化物酶这一类别中的各种酶产生了会氧化其底物的反应副产物过氧化氢。已知的过氧化物酶包括半乳糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、胺氧化酶、各种氨基酸氧化酶、聚苯酚氧化酶、黄嘌呤氧化酶、尿酸酶、醇脱氢酶、乳酸酯脱氢酶、苹果酸酯脱氢酶、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶、甘油脱氢酶以及葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶。在实践中，过氧化物酶与过氧化物酶的底物反应生成过氧化氢。在合适的反应时间后，积累的过氧化氢和过氧化物酶以及通式I的荧光底物反应生成可由上述的自身荧光检测到的荧光产物。氧化物酶和过氧化物酶的反应可同时进行或连续进行。
在本发明的另一种实施方式方便地提供了存在于与过氧化物酶反应的反应物组合物中的荧光化合物。该反应物组合物包括含有式I、II或III的化合物和过氧化物化合物的水溶液。该制剂还可进一步包括增强剂物质，可为酚类化合物以增强过氧化物酶的活性。其它任选的成分包括表面活性剂、防止过氧化物化合物在与过氧化物酶反应之前就活化的螯合剂，以及帮助加溶底物的有机溶剂。
用于本发明实践中的反应物和材料可封装为试剂盒，该试剂盒通过检测生成荧光产物的反应而用于检测试验过程中的任何分析物、水解酶或水解物偶联物。用于以任何方式实践本发明的试剂盒将包括一个或多个容器a)上述存在于缓冲溶液中的荧光化合物；b)如果被检测的分析物不是过氧化物酶或产生过氧化物酶的反应物，则含有过氧化物；c)如果被检测的分析物不是过氧化物酶，或过氧化物酶与分析物的偶联物，或过氧化物酶与反应物的偶联物(该反应物与分析物形成特异性结合对)，则含有过氧化物酶；d)任选地，增强剂化合物；e)任选地，表面活性剂；f)以及任选地，螯合剂。
试剂盒可单独包装，也可以各种组合包装，该组合包装在考虑到进行本发明下述反应的各种方式后将是显而易见的。
过氧化物成分是能与过氧化物酶进行反应的任何过氧化物或烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢、过氧化脲、以及过硼酸盐。
能进行荧光反应的过氧化物酶包括乳过氧化物酶、微过氧化物酶、髓过氧物酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)如钒溴代过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌过氧化物酶如木质素过氧化物酶和来自Arthromyces ramosus的过氧化物酶和白腐菌(white rot fungi)中产生的Mn依赖型物过氧化物酶，以及大豆过氧化物酶。不是酶，但具有类似于过氧化物酶活性的其它过氧化物酶模拟化合物，包括铁络合物如血红素、氯化血红素和其它相关的铁-卟啉络合物以及Mn-TPPS4(Y.-X.Ci，等.，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))是已知的，并明确地认为落在本文中所采用的过氧化物的含义范围内。过氧化物酶和生物分子的偶联物或络合物也可用于产生荧光的方法中，唯一的条件是该偶联物显示了过氧化物酶的活性。可与过氧化物酶的一个或多个分子偶联结合的生物分子包括DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片断、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、外源凝集素、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素，以及生物素。本发明的方法中也可采用包括了或并入了过氧化物酶如功能是连接生物分子的脂质体、胶束、囊泡和聚合物的络合物。
将某些增强剂化合物并入反应混合物中可促进酶的活性。这些增强剂中包括如授予Stout的专利号为4,521,511的美国专利中所述的公知用于提高其它过氧化物酶反应的酚类化合物和芳香胺。其它的酚类增强剂在M.Ii，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.BIOPHYS.Res.Comm.，193(2)，540-5(1993)中以及在专利号为5,171,668和5,206,149的美国专利中有所描述，将其列于此以作参考。列于此以作参考的专利号为5,512,451的美国专利中所公开的取代和未取代的芳基硼酸化合物及其酯类和酸酐衍生物也被认为落入本发明中所采用的增强剂的范围之内。优选的增强剂包括但不限于对-苯基苯酚、对-碘苯酚、对-溴苯酚、对-羟基肉桂酸、对-咪唑基苯酚、对乙酰氨基酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。也可采用上述的那些类别中一种以上的增强剂的混合物。
在本发明的荧光反应中采用非离子性表面活性剂作为添加剂是有利的。将非离子性表面活性剂并入采用过氧化物酶而产生荧光的反应中，使对过氧化物酶的分析灵敏性得到了提高。用于本发明实践中的非离子性表面活性剂示例性地包括了聚氧化乙烯化的烷基苯酚、聚氧化乙烯化的醇类、聚氧化乙烯化的醚类和聚氧化乙烯化的山梨糖醇酯。
包括季胺盐化合物如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)的阳离子表面活性剂对用于增加在本发明的某些化合物与过氧化物酶或过氧化物进行反应时发出的荧光水平是有利的。
可用于本发明实践中的螯合剂所包括的例子有多配位基的阳离子络合试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)及其盐，以及其它本领域公知的试剂。
有机溶剂是那些具有高度水溶性的溶剂，且典型地构成本制剂的小于5％b体积。合适的有机溶剂包括低级醇类如甲醇、乙醇、2-丙醇、乙二醇、丙二醇和2-甲氧基乙醇，低分子量的醚类如四氢呋喃(THF)、二噁烷、甘醇二甲醚和二甘醇二甲醚，丙酮，二氨基甲酰胺(DMF)，乙酰胺和二甲基亚砜(DMSO)。
本发明的反应在例如水性缓冲剂的溶液中进行，该水性缓冲剂可与固体支持物如涂覆有过氧化物酶的珠、管、膜或微孔板的表面相接触。合适的缓冲剂包括能将pH值保持在约4到约10的范围内的任何常用缓冲剂，例如乙酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐、tris(三羟甲基氨基甲烷)、甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇和二乙醇胺。可通过特定的所需用途的要求而确定在这方面实践本发明的优选方法。
可采用合适的已知装置如分光荧光计、X-射线胶片、高速感光胶片、CCD照相机、闪炼计数器、磷光屏，或通过视觉观察即可检测本发明方法所发出的光。每一种检测装置具有不同的光谱灵敏度。人眼对绿光最敏感，CCD照相机对红光显示最大敏感性，可获得X-射线胶片对UV，对蓝光或对绿光的最大响应。由应用和成本、方便性、是否要求生成永久性的记录等因素确定选择何种检测设备。
考虑实施例之后，本发明的这些优点和其它优点将变得显而易见。
实施例按照本发明的方法合成二氢化吖啶羧酸衍生物1-11并对其进行测试。
表1制备的二氢化吖啶底物化合物R1R2R3-R101 CO2C2H5CH3全为H2 CONHNH2CH3全为H3 4-CH3OC6H4CH3全为H4 H 4-FC6H4全为H5 H CH2C6H5全为H6 H C6H5R5＝OCH37 CH3CH3全为H8 COOH CH2C6H4全为H9 COOH CH3全为H10H CH3全为H11N-苯基二氢化吖啶基C6H5全为H
实施例1合成过氧化物酶底物化合物1如文献中所述，从商购的吖啶-9-羧酸出发，按照采用SOCl2转化为酰氯，用乙醇酯化，用三氟甲磺酸甲基酯(methyl triflate)进行N-甲基化，然后用锌/乙酸进行还原的顺序制备化合物1。或者，可从化合物9，即相应的羧酸出发通过标准的酯化条件而形成化合物1。
实施例2合成过氧化物酶底物化合物2将N-甲基二氢化吖啶-9-羧酸甲酯(0.728g，2.8mmol)溶解于25mL甲醇和2mL CH2Cl2的溶液中。加入肼(1.9mL，62mmol)后，反应混合物回流1天。收集沉淀，依次用甲醇和CH2Cl2进行洗涤，然后从CH2Cl2/己烷中进行重结晶。1H NMR(CDCl3)δ3.39(s，3H)，3.69(d，2H)，4.85(s，1H)，6.65(br s，1H)，6.96-7.35(m，8H)。
实施例3合成过氧化物酶底物化合物3将三氟甲磺酸N-甲基吖啶鎓酯(1.0g，2.9mmol)悬浮于30mLTHF中并在氩气层中冷却至0℃。通过注射器注射溶于THF的溴化4-甲氧基苯基镁的溶液(7mL浓度为0.5M)到混合物中，得到的混合物搅拌3小时。蒸发除去溶剂，以10-20％EtOAc/己烷在二氧化硅上对残留物进行色谱分析。得到的化合物3为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ3.41(s，3H)，3.73(3，3H)，5.13(s，1H)，6.74-7.23(m，12H)。
实施例4合成过氧化物酶底物化合物4将1.0g二氢化吖啶(5.5×10-3mol)，24.8mg乙酸钯(1.1×10-4mol)，17.8mg三-特丁基膦(8.8×10-5mol)，795mg特丁氧基钠(8.29×10-3mol)，以及1.06g 1-溴-4-氟苯(6.0×10-3mol)置于圆底烧瓶中，用氩气清洗该圆底烧瓶。向烧瓶中加入无水甲苯(10mL)，并在室温下搅拌黑色的溶液达16小时。
将9.0g二氢化吖啶(4.96×10-2mol)，446mg乙酸钯(1.98×10-3mol)，321mg of三-特丁基膦(1.58×10-9mol)，7.16g特丁氧基钠(7.4×10-2mol)，以及9.6g 1-溴-4-氟苯(0.054mol)置于圆底烧瓶中，用氩气清洗该圆底烧瓶。向烧瓶中加入90ml无水甲苯，事黑色溶液在室温下搅拌2小时。
将上述合并的反应混合物通过瓷漏斗(Buchner funnel)过滤后用二氯甲烷进行洗涤。在真空下浓缩滤液，在二氯甲烷中吸收残留物并再次过滤。薄层层析(TLC)分析表明仅有滤液中含有产物。向滤液中加入50g硅胶，使溶液浓缩至干燥，然后将溶液装载到处于溶于己烷的5％乙酸乙酯中的硅胶柱的顶部。用溶于己烷的5％乙酸乙酯洗脱柱，但产物在柱上就开始沉降，因此用纯的CH2Cl2洗脱柱。收集产物的两个级份，并浓缩至干燥。1H NMR显示两个级份中都含有纯的产物。合并两个级份，得到14g预期产物。1H NMR(CDCl3)δ4.22(s，2H)，6.16-6.19(d，2H)，6.84-6.88(t，2H)，6.93-6.98(t，2H)，7.13-7.16，(d，2H)，7.29-7.31(d，4H)。
实施例5合成过氧化物酶底物化合物5在3-L的烧瓶中装入200g吖啶酮(1.03mol)，49.3g 60％NaH/油分散体(1.23mol)和1L DMF。混合物升温后在氩气下搅拌过夜。向棕色的溶液中加入苄基溴(185g，1.08mol)。反应在保持搅拌的情况下升温。2小时后烧瓶中的物质基本固化。1小时后，加入1L乙醚，抽吸过滤混合物以除去固体，另用1L乙醚洗涤后，再用3L水仔细洗涤。通过蒸发合并的滤液至干燥生成黄色固体，从而分离出第二次的产物。用1L水洗涤该固体，在空气中干燥，然后用400mL丙酮洗涤。合并的产物为234g 80％的N-苄基吖啶酮。
用存在于4L二乙醚中的104.7g氢化锂铝(2.76mol)还原N-苄基吖啶酮(229g，0.8mol)。然后用氩气净化灰色的浆状物，反应自发加热到回流。混合物在室温下搅拌过夜。用100mL水，然后用100mL15％NaOH水溶液和315mL水猝灭混合物。使固体悬浮后用4LCH2Cl2进行彻底洗涤。滤液浓缩至干燥，得到204g二氢化吖啶白色固体(96％)。1H NMR(CDCl3)δ4.08(s，2H)，5.13(s，2H)，6.65-6.68(d，2H)，6，85-6.9(t，2H)，7.01-7.06(t，2H)，7.13-7.34(m，7H)。
实施例6合成过氧化物酶底物化合物6按照公开号为2001/0031869，
公开日为2001年10月18日的美国专利申请中所述的方法制备化合物6。所述化合物的制备与合成其中称为1p的化合物有关。
实施例7合成过氧化物酶底物化合物7在氩气下，将用三氟甲磺酸甲基酯对吖啶进行烷基化而制备的三氟甲磺酸N-甲基吖啶鎓酯(5.0g，14.5mmol)悬浮于100mL干THF中，用处于己烷中的5.8mL 3M的溴化甲基镁(17mmol)进行处理并搅拌过夜。将溶液浓缩至干燥。在采用5％EtOAc/己烷洗脱的硅胶柱上进行色谱纯化之后，分离出产物。得到2.82g(92.5％)9-甲基化的衍生物白色固体。1H NMR(CDCl3)δ1.31-1.33(d，3H)，3.39(s，3H)，3.94-4.02(q，1H)，6.89-6.97(m，4H)，7.17-7.23(m，4H)。
实施例8合成过氧化物酶底物化合物8在惰性气氛下，将溶于200mL干THF中的化合物5，N-苄基二氢化吖啶(10g，37mmol)的溶液冷却到-78℃，在超过15分钟的时间内滴加入溶于己烷中的25.0mL 2.5M正丁基锂的溶液(37.5mmol)。溶液在-78℃下搅拌1小时，然后升温到室温下保持45分钟以上。再次将反应混合物冷却到-78℃，然后加入计算值(ca.)200g压碎的干冰引起沉淀形成。使反应缓慢升温到室温，并在氩气下搅拌过夜。蒸发混合物，然后将固体悬浮于300mL水中，用12N HCl酸化至pH 3。固体收集后用水洗涤，溶解于CH2Cl2中，通过硫酸钠干燥并浓缩得到11g N-苄基-二氢化吖啶-9-羧酸。1H NMR(CDCl3)δ4.99(s，1H)，5.12(s，2H)，6.72-6.75(d，2H)，6.88-6.94(t，2H)，7.10-7.17(m，4H)，7.22-7.32(m，5H)。
实施例9合成过氧化物酶底物化合物9用THF中的n-BuLi进行处理，从而使49.6g(25.5mmol)化合物10发生羧化，然后按照实施例8中所述的方法加入压碎的干冰，生成了55.5g(91％)羧酸9。1H NMR(DMSO-d6)δ3.33(s，3H)，4.93(s，1H)，6.91-7.26(m，8H)。
实施例10合成过氧化物酶底物化合物10按照实施例5所述的方法在二乙醚中采用LiAlH4还原商购的N-甲基吖啶酮60.2g。收率为49.6g，88％。1H NMR(CDCl3)δ3.38(s，3H)，3.89(s，3H)，6.87-7.22(m，8H)。
实施例11合成过氧化物酶底物化合物11将吖啶(5.2g，29mmol)溶解于200mL CH2Cl2中并放置于氩气下。加入锌粉(2.09g，32mmol)和1.9mL乙酸(33mmol)，搅拌混合物达2天。过滤收集固体，并用CH2Cl2进行洗涤。在空气中干燥之后，将固体碾成细粉末，并与300mL 2N HCl一起搅拌30分钟。再次过滤固体，依次用水，2-丙醇和己烷洗涤固体。干燥之后，得到4.71g 9，9′-二二氢化吖啶基(90％)。
在圆底烧瓶中装入9，9’-二二氢化吖啶基(1.0g，27.7mmol)，62.2mg乙酸钯(0.27mmol)，45mg三-特丁基膦(0.22mmol)，0.80g特丁氧基钠(3当量)以及0.96g溴苯(6.1mmol)，并用氩气清洗烧瓶。向烧瓶中加入干甲苯(30mL)，黑色的溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物倾入100mL CH2CL2中，通过20g 氧化硅过滤，用另外的CH2Cl2进行洗涤。蒸发掉溶剂后留下了黄色固体，该黄色固体在10％EtOAc/己烷洗脱的二氧化硅上进行色谱层离，得到化合物11，其为浅黄色固体(1.25g，88％)。1H NMR(CDCl3)7 4.41(s，2H)，5.99-6.02(d，4H)，6.66-6.78(m，12H)，6.94-7.0(m，4H)，7.35-7.48(m，6H)。
实施例12制备反应物配方以下述的碱性配方或酸性配方制备含有化合物1-13中的增强型反应物配方。
碱性配方酸性配方10mM Tris缓冲液，pH 8 10mM乙酸钠缓冲液，pH 50.05mM底物 0.05mM底物0.5mM过氧化脲 0.5mM过氧化脲1mM EDTA1mM EDTA0.1mM对-苯基苯酚0.1mM对-苯基苯酚0.025％Tween-20 0.025％Tween-20实施例13荧光光谱在激发和发射狭缝设置在1.0nm通带处的Jobin Yvon/SPEXFluoroMax-3分光荧光计上获得荧光光谱。采用UV荧光计比色杯(容量为3.5mL，Perfector Scientific)。
实施例14底物评定通过与HRP反应，然后进行分光荧光分析，从而测定化合物1-13中的每一个产生荧光产物的情况。以下描述了采用化合物1的代表性方法。其它化合物采用基本相同的方法。
用移液管将采用酸性配方的3mL浓度为0.05mM的N-甲基二氢化吖啶9-羧酸乙基酯(化合物)的溶液移至比色杯中。记录激发(λem＝524nm)和发射(λex＝364nm)光谱。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并混合完全。经过15分钟时，记录524nm处荧光性的增加。再次记录激发(λem＝524nm)和发射(λex＝357nm)光谱。
表2二氢化吖啶底物的荧光性质化合物 pH 5 pH 81 524 5242 487 4883 484 4844 497 4965 494 4946 512 5117 490 4888 4939 4891049011 494 494实施例15荧光信号/背景测定用移液管将三毫升采用实施例12的酸性或碱性配方的每种底物的溶液移至比色杯中。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并完全混合。15分钟后记录每种底物最大值处的荧光性增加。通过比较t＝0分钟和t＝15分钟时的荧光强度，计算出信号-背景值。
表3HRP存在下二氢化吖啶底物的荧光强度(为S/B)化合物 pH 5pH 81 29.511.02 6.63 1.44 3.95 5.66 3.67 15.89 4.311 84.06.1
实施例16N-甲基二氢化吖啶(化合物10)和HRP的反应产物的荧光光谱用移液管将采用酸性配方的3mL 0.05mM的N-甲基二氢化吖啶的溶液移至比色杯中。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并完全地混合。在1.8小时内以4.5分钟的时间间隔获得发射光谱(在357nm处激发)。获得的一系列光谱示于图1中。为与N-甲基二氢化吖啶/HRP溶液的发射光谱作比较，图中也显示了采用酸性配方的浓度为0.05mM的三氟甲磺酸N-甲基吖啶鎓酯的发射光谱(在357nm处激发)。光谱的一致性表明化合物10被酶致转变为发荧光的吖啶鎓化合物。
实施例17从化合物10形成的荧光产物的动力学图2显示了实施例16的反应溶液在495nm处的荧光强度(在357nm处激发)，其为时间的函数。在2小时内荧光强度到达最大值，然后保持恒定。
实施例18采用化合物1对HPR的敏感性进行荧光检测在采用激发通带滤光器(380nm)和发射通带滤光器(465或530nm)的Labsystems Fluoroskan Ascent微量滴定板荧光计上得到荧光检测界限。采用黑色的MicroFLUOR B 12-孔色条(strips)(DynatechLaboratories)。连续在1型的水中稀释HRP，然后用移液管将10μl稀释的HRP移至每个孔中。制备采用酸性配方的浓度为0.05mM的N-甲基二氢化吖啶9-羧酸乙基酯的溶液，并采用移液管将100μL的上述溶液移至每个孔中。然后在带有380nm-530nm滤光器装置的Fluoroskan Ascent上读取色条。图3示出了采用这种底物获得的优秀敏感性。
实施例19采用化合物2对HPR的敏感性进行荧光检测连续在1型的水中稀释HRP，然后用移液管将10μl稀释的HRP移至每个孔中。制备碱性配方中浓度为0.05mM的N-甲基二氢化吖啶9-羧酸酰肼的溶液，并采用移液管将100μL的上述溶液移至每个孔中。然后在带有380nm-465nm滤光器装置的Fluoroskan Ascent上读取色条。图3示出了采用这种底物获得的优秀敏感性。
实施例20采用化合物4对HPR的敏感性进行荧光检测连续在1型的水中稀释HRP，然后用移液管将10μl稀释的HRP移至每个孔中。制备采用酸性配方的浓度为0.05mM的N-(4-氟苯基)二氢化吖啶的溶液，并采用移液管将100μL的上述溶液移至每个孔中。然后在带有380nm-465nm滤光器装置的Fluoroskan Ascent上读取色条。图3示出了采用这种底物获得的优秀敏感性。
实施例21从化合物12形成的荧光产物的动力学采用移液管将含有存在于0.01M tris缓冲液中的0.3mM 10-甲基二氢化吖啶-9-羧酸2′，3′，6′-三氟苯基酯(化合物12)，0.1mM 4-苯基苯酚，0.5mM过氧化脲，1mM EDTA，以及0.025％TWEEN 20的3mL反应物(pH 8.0)移至比色杯中。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并混合完全。在1.8小时内以4.5分钟的时间间隔获得发射光谱(在357nm处激发)。获得的一系列发射光谱示于图4中。光谱表明了反应的进展显示了吖啶鎓荧光的增长和N-甲基吖啶酮的荧光逐渐占主导。
实施例22采用二氢化吖啶底物13以化学发光检测HRP在Labsystems Luminoskan微量滴定板读数器上获得采用含有存在于0.01M tris缓冲液中的0.05mM 3-甲氧基-10-甲基二氢化吖啶-9-羧酸2′，3′，6′-三氟苯基酯(化合物13)，0.1mM 4-苯基苯酚，0.5mM过氧化脲，1mM EDTA，以及0.025％TWEEN 20的反应物组合物(pH 8.0)的化学发光HRP检测界限。含有100μL这一反应物的白色Microlite 1FB 12孔色条(Dynatech Laboratories)在每个孔中与10μL HRP稀释液反应。在10分钟时测定光强度。
实施例23采用二氢化吖啶底物13以荧光检测HRP采用实施例22的反应溶液以第二种方式产生荧光，从而实现对HPR的敏感性检测。进行化学发光检测之后，将色条转移到荧光计下，在530nm处检测荧光强度(以380nm激发)。图5显示了该方法能检测到小于1amol的HRP。敏感性相当于采用相同底物的化学发光检测。
实施例24采用化合物14对HRP进行荧光检测在室温下使含有存在于0.01M tris缓冲液中的0.05mM化合物14，0.6mM过氧化脲，0.1mM对-苯基苯酚，0.025％TWEEN 20，1mMEDTA的40μL检测反应物(pH 8.0)与1μL HRP(1.4×10-16mol)进行反应。采用分光光度法在5分钟后检测到有吖啶鎓酯终产物形成，该吖啶鎓酯终产物在超过1小时的时间内继续增长，荧光处于500nm处。
在采用底物1，6-二甲氧基-4，10-二甲基二氢化吖啶-9-羧酸2，3，6-三氟苯基酯(化合物15)的类似实验中，该化合物与HRP的反应导致形成荧光吖啶鎓终产物，该荧光吖啶鎓终产物可由分光光度法检测到，荧光位于500nm处。
权利要求
1.产生荧光的方法，包括a)提供过氧化物酶和具有下列通式的荧光底物 其中R1是选自对于过氧化物的攻击呈惰性的基团，并包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子；R2选自于烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基和取代芳烷基基团；R3到R10每一个都是包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子的基团；b)使过氧化物酶和荧光底物进行反应，以产生在反应中积累且不发生进一步反应的荧光产物；和c)用合适波长的光照射荧光产物，致使荧光产物发射荧光。
2.根据权利要求1的方法，条件是R1不包括芳基酯(-COOAr)，烷基酯(-COOR)其中烷基R被选自于卤素、氰基和硝基的吸电子基团所取代的，烷基硫酯(-COSR)，芳基硫酯(-COSAr)，磺酰亚胺(-CO(NR)SO2R′)，酰卤基-C(＝O)X其中X是卤素，或氰基基团。
3.根据权利要求1的方法，其中R1选自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、烷硫基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧酸、羧酸盐、羧酰胺、烷基羧基酯、羧基酰肼基团、酮基、-CHO、氨基、烷基氨基、芳基氨基，以及氢原子。
4.根据权利要求1的方法，其中基团R3到R10独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。
5.根据权利要求1的方法，其中基团R3到R10中的每一个都为氢。
6.根据权利要求1的方法，其中该通式I的化合物包括至少一个赋予水溶性的基团。
7.根据权利要求6的方法，其中赋予水溶性的基团选自羧酸酯、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、铵基和膦基团。
8.根据权利要求1的方法，其中该通式I的化合物选自具有以下结构的化合物1-11
9.根据权利要求1的方法，进一步包括提供用于与过氧化物酶进行反应的过氧化物。
10.根据权利要求1的方法，其中氧化物酶与氧化物酶底物的反应产生了过氧化物。
11.权利要求1的方法应用于过氧化物酶试验中，进一步包括下列步骤d)检测由荧光产物发射的荧光；和e)将所产生的荧光量与过氧化物酶的用量联系起来。
12.根据权利要求11的方法，其中该过氧化物酶与生物分子结合连接。
13.权利要求1的方法应用于分析物试验中，进一步包括下列步骤d)检测由荧光产物发射的荧光；e)将所产生的荧光量与过氧化物酶的用量联系起来；和f)将过氧化物酶的用量与分析物的量联系起来。
14.根据权利要求1的方法，其中所提供的该荧光底物是包括底物、过氧化物和增强剂的反应物组合物。
15.根据权利要求14的方法，其中该增强剂选自酚类、芳香胺、芳基硼酸和烷基硼酸酯。
16.根据权利要求14的方法，其中该增强剂选自对-苯基苯酚、对-碘苯酚、对-溴苯酚、对-羟基肉桂酸、对-咪唑基苯酚、对乙酰氨基酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。
17.产生荧光的方法，包括a)提供过氧化物酶和具有下列通式的荧光底物 其中R1是包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子的基团；R2选自于烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基和取代芳烷基基团；而R3到R10每一个都是包含选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素中的1到20个原子的基团，且对R1-R10的选择产生了具有具有下列通式的稳定荧光吖啶鎓产物 b)使过氧化物酶和荧光底物进行反应，以产生在反应中积累且不发生进一步反应的稳定荧光吖啶鎓；和c)用合适波长的光照射荧光产物，致使荧光产物发射荧光。
18.根据权利要求17的方法，其中R1是内部含有离去基团的基团，该离去基团可被充当亲核试剂的过氧化物取代，并且该离去基团选自芳基酯；其中烷基基团R被选自卤素、氰基和硝基的吸电子基团所取代的取代烷基酯；硫酯；磺酰亚胺；酰卤以及氰基基团；其中R3或R10中至少有一个非H基团，该非H基团在与过氧物酶活性相容的条件下在空间上阻碍化学发光反应生成吖啶酮产物。
19.根据权利要求18的方法，其中基团R3到R10独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。
20.根据权利要求18的方法，其中R3或R10中至少有一个是卤素、烷基或者烷氧基。
全文摘要
本发明公开了从具有与过氧化物酶有反应性的生荧光底物产生荧光的方法。也提供了使用这些方法检测过氧化物酶或者过氧化物酶标记的分析物。描述了用于与过氧化物酶反应的生荧光化合物，组合物和试剂盒。描述了产生荧光化合物的两种模式。
文档编号G01N33/533GK1659278SQ03813075
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月15日 优先权日2002年6月6日
发明者H·阿哈万－塔夫提, R·德席尔瓦, M·D·桑迪森, R·S·汉德利 申请人:鲁米根公司