多用途型接头化合物和配位体及它们的制造方法

专利名称：多用途型接头化合物和配位体及它们的制造方法
技术领域：
本发明涉及多用途型接头化合物以及把糖分子引入该多用途型接头化合物形成的配位体、配位体载体及它们的制造方法。所述多用途型接头化合物在芯片技术或色谱技术、生物探头等方面使用糖分子的时候，特别方便地且高效地适用于糖分子的导入。
背景技术：
存在于生物体内的各种糖与特定的蛋白质相互作用，在生物活动或生命维持的机理方面起着非常重要的作用。为此，研究糖和蛋白质之间的相互作用在研究糖的生物活性方面更为重要。
与糖进行相互作用的蛋白质，例如，通过以下手段可以得到检测。即根据表面等离子体振子共振法(以下，称作SPR)，使用表面固定糖的传感片，可以研究该糖和蛋白质之间的生物化学的结合。若把糖固定在亲和色谱的载体上，可以分离纯化特异地作用于糖的蛋白质。若进一步用糖作为基因工程学的生物探头，则可以检测出与糖相互作用的蛋白质。
迄今为止，本发明人发现，正如公开于“日本化学会第79次春季年会演讲文稿集II、社团法人日本化学会、2001年3月15日，p.1042”，在上述SPR的传感片或亲和色谱的载体等蛋白质分析用的支持物上，在某一步骤引入各种寡糖可固定的接头化合物以及在该接头化合物导入寡糖形成了配位体。
上述接头化合物包含芳香族氨基部位和生物素部位。其中，所述芳香族氨基部位用于导入寡糖。此外，所述生物素部位利用生物素-链霉亲和素(或亲和素)键，用于固定到蛋白质分析用的支持物表面上。因此，通过该接头化合物可以把寡糖固定在蛋白质分析用的支持物上。
然而，仅用1个寡糖分子其分子活性不高，所以当评价寡糖的生物活性时，通常，必需将3单元个以上的寡糖一起引入到所述蛋白质分析用的支持物上。因此，通过把糖引入到上述的接头化合物形成的配位体集中在上述支持物表面上，则必需集合3个单元以上的寡糖才能通过所述接头化合物把寡糖固定到上述支持物上。
另外，关于糖链的集合化及其接头的合成法，已经公开在日本国特许公开公报2002-08048号(2002年3月19日公开)。而关于糖链的固定方法及其接头以及糖链配位体的合成法已经公开在日本国特许公开公报2003-83969号(2003年3月19日公开)。而关于固定于芯片上的糖链和蛋白质之间的相互作用利用表面等离子体振子共振分析法已经公开在“H.Mach，D.B.Volkin，C.J.Burke，C.R.Middaugh，R.J.Linhardt，J.R.Fromm，D.Loganathan，Biochemisty，32，5480-5489(1993)”。而关于集合糖链的分子效果则公开在“Eric K.Wollker and Marry J.Cloninger，Org.Lett.，4，7-10(2000)”。而关于糖链的集合方法公开在“K.Matuura，H.Kitakouji，A.Tsuchida，N.Sawada，H.Ishida，M.Kiso and K.Kobayashi，J.Am.Chem.Soc.，122，7406-7407(2000)”和“S.Koshida，Y.Suda，Y.Fukui，J.Ormsby，M.Sobel，S.Kusumoto，Tetrahedron Lett.，40 5725-5728(1999)”。而关于多用途型接头分子的合成方法公开在“D.H.Tomalia，H.Barker and J.Roeck，Polymer.Jornal.，17，117-132(1985)”和“Christof Worner and Rolf Mulhaupt，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，1306-1311(1993)”。
然而，当使用上述现有的含有接头化合物的配位体时，可以2次元地集中把寡糖的糖链排列于传感片表面上，但控制该集合状态以及很好地再现排列是非常困难的，迄今为止还存在着这样的技术问题。
也就是说，使用固定在蛋白质分析用支持物表面上的寡糖，为精确地检测该寡糖的生物活性，统一寡糖糖链的集合状态，希望能够很好地检测再现寡糖和蛋白质之间的相互作用。然而，使用上述现有的配位体时，3个单元以上的寡糖糖链的集合状态依赖于配位体的集合状态，有时无法把3个单元以上的寡糖糖链的集合状态统一起来。若寡糖糖链的集合状态不同，检测的寡糖和蛋白质之间的相互作用也不同，很难较好地评价寡糖的生物活性。
本发明就是为了解决上述技术问题而提出的，其目的在于提供一种新的多用途型接头化合物、以及、把糖分子引入到该多用途型接头化合物而形成的新配位体、配位体载体及它们的制造方法，进一步用它们来测定糖分子和其他物质之间的相互作用的方法。其中，所述多用途型接头化合物很好地把糖排列在蛋白质分析用支持物上。

发明内容
本发明人为了解决上述技术问题进行悉心研究的结果发现，可导入作为4个单元以上糖分子的部位具有4个芳香族氨基，且，特异地与糖分子相互作用的蛋白质进行检测或分离时所使用的结合在蛋白质分析用支持物的部位作为可结合的部位具有生物素部位或亚氨基生物素部位(以下，称作生物素部位)的新的多用途型接头化合物，由此，可以2次元地很好地把4个单元以上的糖分子排列在上述支持物上，以至完成本发明。
即，为了解决上述的技术问题，本发明多用途型接头化合物(以下，记作接头化合物)，以下述为特征包括用通式(1)表示的结构，
(其中，Y具有O或NH表示的结构)，上述X包括由4个链形成的多个部位的结构，所述4个链在链末端不仅具有芳香族氨基，同时还在主链上含有碳-氮键的烃衍生链。
所说烃衍生链是指，由碳和氢组成的烃链，其中，部分的碳或氢可以被其他原子或取代基所取代的链。即，所说烃衍生链是指，在链末端具有芳香族氨基，烃链为主要链结构的碳-碳键(C-C)的一部分也可以被碳-氮键(C-N)、碳-氧键(C-O)或酰胺键(CO-NH)所取代。
根据上述结构，所述接头化合物在上述蛋白质分析用支持物上可固定的部位包括生物素部位。该生物素部位具有高亲和性为链霉亲和素或亲和素(以下，总称为亲和素)。为此，在固定有亲和素的支持物表面上形成生物素-亲和素键，可以把上述接头化合物简单地固定在支持物表面上。
此外，上述接头化合物，作为可简单地导入各种糖分子的部位，还具有芳香族氨基。所述芳香族氨基包含在各个烃衍生链中，所以在接头化合物中可以引入4个单元以上的糖分子。还有，被引入的糖分子被引入到一个接头化合物中可以把被引入的4个单元以上的糖分子按照一定间隔排列。由此，通过上述接头化合物可以得到再现性非常好的被引入到蛋白质分析用支持物上的糖分子的排列。
进一步通过使用上述接头化合物，把4个单元以上的糖分子集中在上述支持物表面上，可以使糖分子再现地很好地排列，由此，可以获得糖分子具有充分生物活性，因此，也可以检测糖分子和蛋白质之间的相互作用，可以再现地很好地评价糖分子的生物活性。
在用上述通式(1)表示的接头化合物中，优选上述X具有下述通式(2)表示的结构
(式中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自独立地为1-6的整数)。
上述接头化合物中的X具有上述4个烃衍生链，所以，介于该接头化合物可以在上述支持物上导入4个单元以上的糖分子。为此，通过使用上述接头化合物可以控制引入到上述支持物表面上的糖分子间的距离，获得再现性良好的糖分子排列。
因此，通过使用上述接头化合物可以获得再现性良好的糖分子的生物活性。由此，用SPR或亲和层析、生物探头等技术，它们利用糖分子的生物活性可以非常好地检测各种糖分子和蛋白质之间的特异性相互作用。
此外，为了解决上述技术问题，本发明的配位体是以上述任意一种接头化合物的芳香族氨基上引入糖分子而形成的配位体为特征。
具体地，上述配位体优选具有下述通式(3)表示的结构
(式中，Y具有O或NH表示的结构，R1，R2，R3，R4各自独立用H-或 表示的结构，R6，R7，R8，R9，R10是选自HO-或 或者 表示的结构)，(式中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自独立地为1-6的整数)。
上述配位体优选具有下述通式(4)表示的结构
(式中，Y具有O或NH表示的结构，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自独立地为1-6的整数)。
在上述蛋白质分析用的支持物表面上，通过使用任意一种上述配位体可以使4个单元(配位体具有用通式(4)表示的结构的情形)或者4个单元以上(配位体具有用通式(3)表示的结构的情形)的糖分子固定。此外，一个配位体具有4个单元以上的糖分子，所以不仅在上述支持物表面上可以2次元地集合4个单元以上的糖分子，同时还可以使之再现性良好地排列糖分子。由此，用SPR或亲和层析、生物探头等技术，它们利用上述配位体可以有效地检测各种糖分子和蛋白质之间的特异性相互作用。
此外，为了解决上述技术问题，本发明接头化合物制造方法的特征是，包括以下步骤使生物素类化合物，与具有在芳香族氨基末端被保护基保护的4个分支链的胺化合物进行缩合反应的步骤和，除去芳香族氨基末端的保护基的去保护步骤。
所述生物素类化合物是指，正如能够与胺化合物的仲氨基反应，在生物素结构或亚氨基生物素结构上引入取代基使之活化的化合物。
根据上述方法，可以获得本发明接头化合物，该化合物包括固定有亲和素的可同定在蛋白质分析用的支持物上的生物素部位和，能简便地引入糖分子的芳香族氨基。
此外，本发明配位体的制造方法是以使用上述任意一种接头化合物和糖分子进行还原氨基化反应为特征。
根据上述方法，因还原氨基化反应而在接头化合物上简便地导入糖分子可以得到本发明的配位体。
此外，本发明引入糖分子的方法是以将含有上述配位体的溶液和，表面上固定了链霉亲和素或亲和素的支持物接触为特征。
根据上述方法，上述配位体(配位体所含有的接头化合物)的生物素部位或亚氨基生物素部位和，上述支持物表面的链霉亲和素或亲和素结合，根据这种结合可以把上述配位体固定在支持物表面上。因此，使含有配位体溶液和支持物接触的简便方法可以使与接头化合物结合的糖分子排列在支持物表面之上。
此外，本发明配位体载体是以，把配位体，通过生物素部位或亚氨基生物素部位和，链霉亲和素或亲和素之间的键即生物素-亲和素键固定在表面上而形成的为特征。
根据上述的组成，通过生物素部位或亚氨基生物素部位和，链霉亲和素或亲和素之间的键即生物素-亲和素键可以把配位体强烈地固定在支持物表面上，则，可以2次元地提供再现性良好且把多个糖分子排列在支持物表面上的配位体载体。因此，若使用上述配位体载体，可以再现良好地观测到配位体中的糖分子和，与该糖分子相互作用的蛋白质等物质之间的相互作用，则可以定量地评价糖分子的生物活性。
此外，本发明表面等离子体振子共振的测定方法，其特征在于，导入末端结构不同的糖分子至少使用2个传感片，上述至少2个传感片包括，在第1糖分子固定在支持物上的第1传感片和，与上述第1糖分子末端结构不同的第2糖分子固定在支持物上的第2传感片，用第1传感片得到的检测结果和，用第2传感片得到的检测结果，测定这两者之差，并测定糖分子的相互作用。
此外，本发明表面等离子体振子共振的测定方法，其特征在于，用与上述结构相同的接头化合物将糖分子固定在上述传感片上。
根据上述方法，使用具有除糖分子外的其他结构相同的配位体的至少2个传感片，可以测定表面等离子体振子共振(SPR)，至少2个传感片相互作用之差可以作为因糖分子的不同而被观测到。因此，若利用上述测定方法，可以降低除糖分子外的其他部分与其他物质之间的非特异性相互作用，可以测定糖分子与其他物质之间的非特异性相互作用。
再有，本发明的其他目的、特征、以及优点通过以下所述充分理解。还有，本发明的利益参照


会更加清楚。

图1表示为导入本发明配位体而固定亲和素并制作表面等离子体振子共振(SPR)传感片的工艺剖面图。
图2表示本发明导入配位体的芯片的剖面图，(a)表示与蛋白质没有相互作用的情形，(b)表示与蛋白质有相互作用的情形。
图3表示采用本发明配位体SPR测定的“2-通道分析法”模式图。
图4表示在获得本发明配位体载体工艺中测得SPR的结果图。
图5表示本发明配位体(Mal-Bio)和比较例配位体(Ace-Mal)之间的相互作用测得SPR的结果图。
图6表示本发明配位体5.3Mal及8-Glc与伴刀豆球蛋白A之间的相互作用测得SPR的结果图。
图7表示制作本发明配位体载体亲和柱的工艺图。
图8表示亲和层析的步骤。
图9表示4-Mal和蛋白质之间的结合键SDS-PAGE结果图。
具体实施例方式
以下，详细地说明本发明，但本发明并不受这些说明的限制。
本发明多用途型接头化合物(以下，称作接头化合物)，是利用寡糖等的糖(以下，记为糖分子)生物活性如SPR测定或亲和层析、基因工程学的生物探头等，在检测或分离与糖分子特异地相互作用的蛋白质时，非常适合把糖分子导入蛋白质分析用的支持物上而使用的一种化合物。此外，上述接头化合物与蛋白质之间没有非特异的相互作用，所以，可以优选适用于如上所述的蛋白质检测或分离。
即，具体地说，本发明接头化合物如通式(1)所示，包括生物素部位或亚氨基生物素部位(以下，总称为生物素部位)作为可固定在上述蛋白质分析用支持物的部位，还包括芳香族氨基作为可导入糖分子的部位。
众所周知，生物素或亚氨基生物素(以下，总称为生物素)与碱性糖蛋白质的链霉亲和素或亲和素(以下，把它们总称为亲和素)具有特异的相互作用。为此，在亲和素被固定的支持物表面上，与具有生物素部位的上述接头化合物接触，形成生物素-亲和素键，可以很容易地把上述接头化合物固定在上述支持物表面上。
此外，上述接头化合物包括所述通式(1)以X表示的结构，在末端具有芳香族氨基同时在主链上还可以具有碳-氮键的4个烃衍生链形成的多分支部位。该多分支部位含有的芳香族氨基的氨基(-NH2基)与糖分子中因平衡而产生的醛基(-CHO基)或酮基(-CR′O基，其中R′为烃基)反应。然后，通过连接该反应形成的希夫碱进行还原，则糖分子被导入到芳香族氨基上。上述X具有4个芳香族氨基末端，如后面所述，4个单元以上的糖分子可以被导入到上述接头化合物中。
具体地说，如前面通式(2)所示，上述X具有2个分支结构，该结构是由2条烃衍生链在与芳香族氨基相对的末端结合了1个氮(N)而成。而且，该2个2分支结构的上述氮通过-CO-(CH2)m-(其中，m为1-6整数。)通过结合了1个氮(N)形成多分支结构。还有，在上述通式(2)中，m1，m2只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是彼此相同的整数。其中，从制造难易程度上考虑，优选m1，m2为彼此相同的整数，特别优选为2。此外，n1，n2只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是彼此相同的整数。其中，从制造难易程度上考虑，优选n1，n2为彼此相同的整数，特别优选为2。此外，p1～p4只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是部分或全部都相同的整数。其中，从制造上述多分支部位的化合物时难易程度上考虑，优选p1～p4为彼此相同的整数，特别优选为2。
如此地，上述X包括以碳或氮等原子，将多个上述烃衍生链结合形成分支结构的多分支部位的结构。还有，优选上述X中包括的多个烃衍生链都是相同的链，但在末端若含有芳香族氨基也可以彼此不同。
如上所述，包括通式(1)所表示的结构的接头化合物具有生物素部位和芳香族氨基末端。由此，介于上述接头化合物，可以把糖分子坚固地且简单地结合在上述蛋白质分析用支持物上。
此外，上述接头化合物具有多分支部位，在该多分支部位的末端具有芳香族氨基。为此，通过使用把糖分子导入到上述接头化合物而形成的配位体(见后述)，可以有效地把4个单元以上的糖分子集合在上述支持物表面上。还可以在1个接头化合物中导入4个单元以上的糖分子，当把上述配位体结合在支持物表面时，可以再现地良好地排列多个糖分子。
进一步，上述接头化合物可以几乎忽略它与蛋白质之间的非特异的相互作用的影响。为此，通过使用本发明的接头化合物可以再现地良好地评价糖分子的生物活性。
根据以下所示的方法制造上述接头化合物。即，上述接头化合物，通过生物素类化合物和，芳香族氨基末端被保护基保护的具有4条分支链的胺化合物，使这2种化合物进行缩合反应，然后，去保护基去掉上述芳香族氨基末端的保护基来进行制造。
作为上述生物素类化合物，可以例举以下述通式(5)所表示的结构 (式中，Y具有O或NH表示的结构，R5具有 基(Pfp)或 基(Su)表示的结构)。上述生物素类化合物是五氟苯基(Pfp)或琥珀酰亚胺基(Su)的酯化合物。为此，上述生物素类化合物被这些取代基所活化，可以与胺化合物的仲氨基(-NH基)反应。
此外，只要上述胺化合物包含被仲氨基和保护基保护并具有芳香族氨基末端的分支链即可，不受任何限制，也可以具有相当于上述接头化合物的多个分支部位(通式(1)的X)。
因此，上述分支链除了具有由保护基保护的芳香族氨基末端来代替上述烃衍生链所含有的芳香族氨基之外，也可以具有上述烃衍生链所含有的结构。也就是说，上述分支链也可以用碳及氢所组成的烃链，一部分碳或氢被其他原子或取代基取代。更具体地说，上述分支链也可以具有由保护基保护的芳香族氨基末端同时也可以由烃链的主链结构即碳-碳键(C-C)的一部分被碳-氮键(C-N)取代。
此外，所说保护基是芳香族氨基中的氨基根据上述缩合反应而被导入不参加反应的取代基。这种保护基只要是在去掉仲氨基的保护基时不受影响即可。上述保护基可以例举出，例如，t-丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基，称为Boc基)、苄基、丙烯基氨基甲酸酯基(-COOCH2CH＝CH2，称为Alloc基)。
作为上述胺化合物，例如，可以举例为用下述通式(6)表示的化合物结构 再有，关于该胺化合物的合成方法将在以后的实施例中详细阐述。
通过上述生物素类化合物和胺化合物之间的缩合反应，生物素类化合物的Pfp或Su等的取代基和，胺化合物的仲氨基缩合，形成亚氨基键。然后，把芳香族氨基末端的保护基去保护，去掉保护基，成为芳香族氨基，由此可以得到上述接头化合物。
接着，阐述在上述接头化合物的芳香族氨基上导入糖分子形成配位体。本发明的配位体是，通过接头化合物的氨基与糖分子中的平衡产生的醛基或酮基反应，连接因该反应形成的希夫碱进行还原从而将糖分子导入到芳香族氨基上。
本发明配位体中所含有的糖分子，只要是还原糖即可。作为糖分子，可以举例为，例如，葡糖糖、半乳糖、甘露糖等的单糖类、结合糖的数量为双糖-10个糖的麦芽糖、乳糖、下面提到的硫酸化寡糖等的寡糖类、单糖类或寡糖类组合而成的糖数量为11以上的肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素等多糖类。
此外，作为上述寡糖类，可以举例硫酸化寡糖或寡糖，所述硫酸化寡糖，包括用具有周知的抗血液凝固活性硫酸化多糖肝素中的下述通式(7)表示的特定的部分二糖结构(GlcNS6S-IdoA2S)，所述寡糖具有用下述通式(8)表示的构造，通式(8)是把该硫酸化寡糖的还原末端结合葡萄糖而成的， 再有，上述寡糖类或多糖类即可以是同一单糖分子组成的单一寡糖或单一多糖，也可以是多种单糖分子或其衍生物组成的复合糖或，多种单糖分子或其衍生物、含有寡糖类的复合多糖类。此外，上述糖分子均可以从自然界中分离纯化而获得的各种天然糖，还可以是人工合成的糖。
具体地说，本发明的配位体包括所述通式(3)表示的结构。该通式(3)表示的配位体结构是，用所述通式(1)表示，X具有用所述通式(2)表示的结构的接头化合物中导入葡萄糖或麦芽糖或乳糖作为糖分子而形成的。通式(2)表示的X具有含4条烃衍生链的结构。在该每个烃衍生链的芳香族氨基上可以引入1个单元或2个单元的糖分子。由此，用通式(3)表示的配位体结构则在上述接头化合物结合有4个单元以上8个单元以下的糖分子。另外，在上述通式(3)中，m1，m2与上述通式(2)中的m1，m2一样，只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是彼此相同的整数。此外，n1，n2与上述通式(2)中的n1，n2一样，n1，n2只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是彼此相同的整数。此外，p1～p4与上述通式(2)中的p1～p4一样，p1～p4只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此不同的整数，也可以是部分或全部都相同的整数。
作为引入到上述接头化合物烃衍生链的芳香族氨基的糖分子可以举例为，选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖中的1种以上的糖分子。因此，用通式(3)表示的配位体结构对应于通式(3)表示的R7-R10结构，在上述接头化合物中导入4个单元以上8个单元以下的糖分子，该糖分子选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖所组成的组群。
另外，在上述接头化合物的芳香族氨基上引入的糖分子，即可以彼此不同，也可以部分地或全部地相同，但从容易导入糖分子方面来考虑，还是优选全部相同的。例如，在通式(3)中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4均为2，当4个单元的糖分子被导入到接头化合物时，糖分子为葡萄糖时，优选下述通式(16)表示的配位体，同样地，当4个单元的糖分子被导入时，若糖分子为麦芽糖时，优选下述通式(17)表示的配位体，若糖分子为乳糖时，优选下述通式(18)表示的配位体，在通式(16)-(18)中，Y具有O或NH表示的结构
此外，本发明其他的配位体具有所述通式(4)表示的结构。该通式(4)表示的配位体结构用通式(1)表示，在X具有所述通式(2)表示的接头化合物上导入用所述通式(8)表示的糖分子。通式(2)表示的X有4个烃衍生链结构，具有所述通式(4)表示的配位体结构则在上述接头化合物上结合4个单元的糖分子。另外，在上述通式(4)中，m1，m2与上述通式(2)中的m1，m2一样，只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是彼此互相相同的整数。此外，n1，n2与上述通式(2)中的n1，n2一样，n1，n2只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是彼此相同的整数。此外，p1～p4与上述通式(2)中的p1～p4一样，p1～p4只要为1-6整数，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整数，也可以是部分或全部都相同的整数。
上述配位体均包含接头化合物和糖分子，所以，在接头化合物内的生物素部位可以通过具有亲和素的蛋白质分析用支持物和，生物素-亲和素键结合。进而，介于该生物素-亲和素键可以在上述支持物表面上提供集合并固定4个单元的糖分子形成的配位体载体。因此，通过使用上述配位体，例如，2次元地将多个糖分子再现地良好地排列在蛋白质分析用支持物表面上得到配位体载体，通过使用该配位体载体可以再现地良好地评价糖分子的生物活性。因此，本发明的配位体非常适用于将各种糖分子简便地导入到SPR或亲和层析、生物探头等技术中。
这样介于该生物素-亲和素键将本发明配位体固定于支持物表面上形成的配位体载体也包含在本发明中。该配位体载体未必限定蛋白质分析的用途上，为了研究它与糖分子之间的相互作用也可以用于蛋白质以外的分析用途。
在含有该配位体的配位体溶液中，上述配位体可以提供配位体载体，通过把固定亲和素的蛋白质分析用支持物浸渍一定时间，或者把配位体溶液注入到上述支持物，可以引入到上述支持物表面，在上述支持物表面上集合4个单元以上的糖分子并固定形成配位体载体。
例如，当得到将上述配位体导入SPR传感片形成的配位体载体时，首先，制作固定有亲和素的传感片。即，如图1(a)所示，使用表面涂布金(Au)的玻璃基板1。接着，如图1(b)所示，利用金-硫键(Au-S)把具有下述通式(9)表示的结构4-硫代丁酸固定在玻璃基板1上。
HOOCCH2CH2CH2SH…(9)另外，也可以用涂布包含羧基的聚合物基板来代替固定该4-硫代丁酸玻璃基板1。
其次，如图1(c)所示，在碳化二亚胺试剂的存在下，使固定在玻璃基板1的4-硫代丁酸与N-羟基琥珀酸亚胺反应。然后，使N-羟基琥珀酸亚胺部位和含有亲和素2的末端氨基缩合，如图1(d)所示，把亲和素2固定在玻璃基板1上。进而，得到把亲和素2固定在玻璃基板1上的传感片。
再其次，把该传感片与本发明的含有配位体的配位体溶液接触。具体地，就是把上述传感片浸渍于配位体溶液或者传感片表面冲洗配位体溶液。进而，通过作为特异性相互作用而众所周知的生物素-亲和素键，如图2(a)所示，可以在上述传感片上得到固定配位体3的配位体载体4。
另外，作为用于配位体溶液的溶剂没有特别的限定，但可以举例为，例如PBS(磷酸缓冲液)等缓冲液。浸渍于配位体溶液时的浸渍时间可以为0.5-1.5个小时左右。此外，注入配位体溶液时的注入量可以为0.006mg-0.06mg。
如上所述，使用固定有配位体3形成的配位体载体4，使该配位体载体与蛋白质5接触(图2(b))，按照常规方法，使用表面等离子体振子共振装置测定共振角度，可以观测到该配位体载体4和蛋白质5之间的键活动。再有，作为测定SPR所使用的传感片，例如可以使用玻璃、塑料等，特别优选使用玻璃。此外，配位体载体和蛋白质接触例如，可以把蛋白质溶解于电泳缓冲液的溶液流入到该配位体载体的表面上，或者，在溶解蛋白质的电泳缓冲液的溶液中，通过浸渍上述配位体载体而实施。作为该电泳缓冲液例如可以举例为PBS等缓冲液。
此外，例如，作为亲和层析中所使用的亲和柱，当得到上述引入配位体的配位体载体时，首先，制作固定亲和素的层析柱。该制作方法可以按照常规方法(例如，参照文献，即アマシヤムフアルマシアバイオテク株式会社编，“最初的配位体偶联剂手册”(2002年)等)制作。例如，适合固定带氨基的化合物的载体填充到柱中(例如，N-羟基琥珀酸亚胺固定的凝胶载体充填柱)，通过冲洗含亲和素溶液，可以在上述载体上固定亲和素。把含有本发明配位体的配位体溶液注入到固定有该亲和素的载体(以下，为亲和素附加物)。由此，通过生物素-亲和素键(作为特异地相互作用而众所周知)，可以得到把配位体固定在亲和素附加物上而形成的配位体载体。
此外，作为在上述含有亲和素溶液中所使用的溶剂，例如可以举例为，含氯化钠的醋酸钠水溶液等。此外，作为上述配位体溶液所使用的溶剂，可以举例为，PBS等缓冲液。
如上所述，因为本发明配位体具有生物素部位，所以正如上述一样，例如，在蛋白质分析用支持物表面上通过一个步骤容易地将糖分子导入固定从而可以获得本发明的配位体载体。
如上所述，利用含有配位体载体固定化配位体的亲和柱，为实施亲和层析，如下所述。即，在填充有亲和素固定化的载体(亲和素附加物)亲和柱上，注入蛋白质溶液，按照常规方法，进行亲和层析，可以分离与配位体载体结合的蛋白质和未结合的蛋白质。另外，作为上述蛋白质溶液中所使用的溶剂，例如可以举例为，PBS等缓冲液。此外，未与配位体载体结合的蛋白质从亲和柱上析出时所使用的析出液，例如，也可以举例为，PBS等缓冲液。
另外，如上所述，在SPR法使用的传感片，或者，在亲和层析中所使用的填充亲和柱的亲和素附加物等的支持物上导入糖分子的方法也包含在本发明中。
如上所述，因为本发明配位体载体具有配位体，可以2次元地将多个糖分子再现地良好地排列在支持物表面上。故，可以再现地良好地评价糖分子的生物活性，就糖分子结构的阐明或，糖分子的生物活性可以定量地进行评价。
此外，SPR测定方法也包含在本发明中，也就是说，利用糖分子固定在支持物表面的传感片，来检测糖分子的特异性相互作用。它使用导入末端结构不同的糖分子而形成的至少2个传感片，来观测糖分子和蛋白质等物质之间的相互作用。而所述糖分子的末端，是指，未固定在传感片的那侧。此外，观测与糖分子相互作用的物质未必限定为蛋白质。
利用上述方法，为测定SPR而使用糖分子种类不同的2个传感片，例如，可根据如下所述方法实施。制备第1糖分子固定在支持物表面上形成的第1传感片和，与上述第1糖分子末端结构不同的第2糖分子固定在支持物表面上形成的第2传感片。如上所述，这同样能够得到制作固定在传感片上的配位体载体(传感片)。这些传感片可以用于被固定不同的糖分子配位体。例如，在对比的糖分子中可以举例为，乳糖-葡萄糖、麦芽糖-葡萄糖、麴酸生物活素类-葡萄糖等。固定在传感片上的不同糖分子的配位体例如，举例为上述通式(16)-(18)所示的配位体。另外，配位体也可以使用不限于本发明，其他配位体也可以。
而且，例如，用与第1糖分子具有特异性作用的蛋白质等，设一定的测定条件，作用于上述2个传感片，观测两者的共振角度。通过检测该2两者共振角度之差，可以测定糖分子与蛋白质等之间的特异性作用。
在上述中，并不限定2个不同种类的传感片同时测定，也可以2种以上的传感片进行测定，也可以不在同时测定。此外，也可以使用至少1个传感片上没有被糖分子引入的传感片。例如，也可以使用仅固定接头化合物的传感片。
如上所述，本发明SPR测定方法降低非特异性相互作用，可以测定糖分子和其他物质之间的特异性相互作用。
以下，根据实施例和比较例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些。
另外，在下面的实施例中，各种色谱、旋光度的测定、电泳均使用下面的仪器。
*)核磁共振(NMR)色谱JEOL EX 270，JNM-LA 500 NMR spectrometer(商品名)*)质谱分析Mariner(注册商标)Boispectromety(注册商标)Workstation(商品名，ESI-TOF，MS，PE Biosystems，CA，USA)VOYAGER-DERP(商品名，MALDI-TOF MS，PE Biosystems，CA，USA)*)旋光度Perkin Elmer model 241 polarimeter(商品名)*)紫外分光光度计JASCO V-530 UV/Vis spectrometer(商品名)*)表面等离子体振子共振生物传感器SPR670(商品名，Nippon Laser& Electronics LAB)*)电泳装置ATTO CompactPAGE AE-7300(商品名)*)电泳用现成凝胶ATTO PAGEL-Compact AE-6000(12.5％)Lot244S024(商品名)此外，色谱法中还使用二氧化硅凝胶。
*)薄层色谱法Merck Silica gel 60 F524(No.5715)(商品名)*)调制的薄层色谱法Merck Silica gel 60 F524(No.5744)(商品名)*)中压柱色谱法Merck Silica gel 60(No.9385，0.040-0.063mm，230-400mesh)(商品名)[实施例1·接头化合物的合成]本发明接头化合物按照下列步骤合成。
如下述通式(10)所示，室温条件下，在甲醇(式中，MeOH)中，苄胺(化合物1，式中，Bn表示苄基)和，6当量的丙烯酸甲酯反应，给上述苄胺作标记附加2个单元的丙烯酸甲酯，以收率为93％获得化合物2。然后，在室温条件下，在含有该化合物2的甲醇中，加入过量(50当量)的乙二胺，使该乙二胺与化合物2缩合，得到化合物3。另外，加入过量(50当量)的乙二胺是为了防止乙二胺的2个氨基同时与化合物2缩合。
具体地，为获得化合物2，在苄胺(4.7mL，44.6mmol)的甲醇溶液(143mL)里加入内烯酸甲酯(8.52mL，104mmol)，室温下，在氮氛围中搅拌8个小时，追加丙烯酸甲酯(3.87mL，47mmol)，室温下，搅拌12个小时。在搅拌过的溶液中，再加入丙烯酸甲酯(7.47mL，94mmol)彻夜搅拌，得到甲醇/丙烯酸甲酯反应溶液。减压浓缩甲醇/丙烯酸甲酯反应溶液，把残渣用中压二氧化硅凝胶色谱法(300g，甲苯∶乙酸乙酯＝5∶1-3∶1)进行纯化，得到化合物2呈无色油状溶液。
所得化合物2收量为11.7g(收率为95％)。此外，把得到的化合物2进行1H NMR(400MHz，CD3OD)测定，为δ7.28-7.20(5H，m，aromatic)，δ4.79(6H，s，OMe*×2)，δ3.57(2H，d，J＝4.6Hz，NCH2*Ph)，δ2.76(4H，td，Jgem＝4.6，Jvic＝6.8Hz，CH2*NBn)，δ2.46(4H，td，Jgem＝4.6，Jvic＝6.8Hz，COCH2*CH2NBn)。另外，每个化学希夫碱δ表示在H为复数时记为*质子，即表示针对H*、的测定值，以下描述相同。此外，实施ESI-MS(positive)测定(飞行时间型质谱分析仪测定)的时候，为m/z(质量/电荷比)302.1[(M+Na)+]。
接着，如下述通式(11)所示，室温条件下，在含有化合物3的甲醇中，加入11当量的丙烯酸甲酯，给化合物3附加4个单元的丙烯酸甲酯，以收率为81％获得化合物4。然后，在甲醇中添加2M的氢氧化钠水溶液的碱条件下，水解化合物4的甲酯，获得在末端含有4个单元羧基(-COOH基)的化合物5以收率为96％。
为了获得化合物4，具体地实施操作如下。即，把化合物2(9.97g，35.7mmol)溶解在甲醇(120mL)，在氮氛围气氛下，0℃搅拌5分钟，加入无水乙二胺(60mL，1.11mol)，0℃搅拌5分钟后，室温下彻夜搅拌，再加入无水乙二胺(50mL，0.93mol)，室温下彻夜搅拌，得到化合物2/无水乙二胺反应溶液。将该化合物2/无水乙二胺反应溶液浓缩，得到黄色油状残渣。在该黄色油状残渣中加入甲醇(120mL)溶解，加入丙烯酸甲酯(19.3mL，234mmol)室温下彻夜搅拌，再加入丙烯酸甲酯(19.3mL，234mmol)室温下彻夜搅拌，得到黄色油状残渣/丙烯酸甲酯反应溶液。将该黄色油状残渣/丙烯酸甲酯反应溶液减压浓缩，把残渣用中压二氧化硅凝胶色谱法(700g，三氯甲烷∶甲醇＝20∶1-7∶1)进行纯化，得到化合物4呈黄色油状溶液。
所得到的化合物4收量为24.5g(收率为81％)。此外，把得到的化合物4进行1H NMR(400MHz，CD3OD)测定，为δ7.29-7.28(5H，m，aromatic H)，δ3.66(12H，s，OMe*×4)，3.27(4H，q，J＝6.1Hz，CH2*NHCO)2.81(4H，t，J＝6.8Hz，CH2NBn)，δ2.75(8H，t，CH2×4，J＝6.8Hz，CH2*NCH2)，δ2.52(4H，t，CH2×2，J＝5.9，6.1Hz，CH2*NHCO)，δ2.41(12H，t，CH2×(2×4)，J＝6.8，6.6Hz，NCOCH2*CH2NHCO，MeOCOCH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 680.4[(M+H)+]。
为了获得化合物5，具体操作如下。即，把化合物4(1.0mg，1.47mmol)溶解在甲醇(7.4mL)，将4M氢氧化钠水溶液(7.4mL)加入其中，氩氛围气氛下，0℃搅拌2个小时，得到化合物4/氢氧化钠水溶液。在该化合物4/氢氧化钠水溶液加入4M盐酸(7mL)，用pH试纸确认pH＝3后，对化合物4/氢氧化钠水溶液减压浓缩，冻干残渣水溶液。把所得到的冻干残渣用HP-20(300mL，H2O-H2O∶甲醇＝1∶1-甲醇)纯化，用H2O/甲醇收集析出的级分并减压浓缩。然后，把减压浓缩的残渣冻干得到化合物5呈淡黄色结晶。
所得化合物5收量为878mg(收率为96％)。此外，将得到的化合物5进行1H NMR(400MHz，CD3OD)测定时，为δ7.54-7.38(5H，m，aromatic H)，δ3.60(2H，s，NCH2*Ph)，δ3.58(2H，t，J＝6.1Hz，CH2*NCO)，δ3.34-3.24(16H，m，CH2×8，CH2*NBn，MeOCOCH2CH2*N，NCH2CH2*NHCO)，δ2.79(4H，t，CH2×2，J＝7.0Hz，COCH2*CH2NBn)，δ2.60(8H，t，CH2×4，J＝6.4Hz，MeOCOCH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 624.3[(M+H)+]。
另外，在本实施例中，化合物5只合成到4个单元的羧基，但根据需要，不水解化合物4的甲酯，再缩合乙二胺，继续加成丙烯酸甲酯反应，在末端可以很容易地合成带有8、16、32单元的羧基骨架结构。
其次，如下述通式(12)所示，在5当量的1-羟基苯三吡咯(式中，HOBt)以及，含有10当量的二异丙基乙胺(式中，DIPEA)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，一边从0℃-40℃变化温度，一边用5当量的o-[7-偶氮苯三吡咯-1-基]-N，N，N′，N′-四甲基脲己氟磷酸盐(式中，HATU)作为活性剂，用另一个氨基被t-丁氧基羰基(式中Boc，以下称为Boc基)保护的亚苯基二胺衍生物(化合物6，5当量)与上述化合物5的末端羧基进行缩合，得到化合物7(收率57％)。接着，在氢氛围下，在50℃甲醇中，使用钯(10％的Pd-C)进行化合物7的接触还原反应，该化合物7的仲氨基的保护基即苄基去保护得到收率为80％的化合物8。
为了获得化合物6，具体操作如下。即，把m-亚苯基二胺(7.81g，72.2mmol)溶解在甲醇(240mL)，加入二-t-丁氧基碳酸盐(16.5mL，71.8mol)和三乙胺(10mL，71.5mol)，在氩氛围下，遮光0℃搅拌30分钟，然后，在室温下彻夜搅拌，得到m-亚苯基二胺反应溶液。减压缩合该m-亚苯基二胺反应溶液，把残渣用中压二氧化硅凝胶色谱法(500g，三氯甲烷∶甲醇＝10∶1-7∶1)进行纯化，得到化合物6呈黄色结晶。
所得化合物6收量为13.3g(收率为88％)。此外，所得化合物6进行1H NMR(400MHz，CDCl3)测定时，得到δ7.03(1H，dd，J＝7.8，8.1Hz，aromaticH)，δ6.54(1H，d，J＝8.1Hz，aromatic H)，δ6.36(1H，t，J＝7.8Hz，aromatic H)，δ3.67(2H，s，NH2)，δ1.51(9H，m，CH2×3 ofBOC)。此外，得到ESI-MS(positive)m/z 209.1[(M+H)+]。
还有，为了获得化合物7，具体操作如下。即化合物5(54.8mg，87.9μmol)和1-羟基苯三吡咯(66.4mg，492μmol)在氮氛围下，溶解在无水二甲基甲酰胺(0.9mL)中，0℃搅拌15分钟，得到化合物5/1-羟基苯三吡咯反应溶液。在化合物5/1-羟基苯三吡咯反应溶液加入HATU(168mg，441μmol)和二异丙基乙胺(150mL，882μmol)和化合物6(98.2mg，471μmol)室温下彻夜搅拌，再50℃搅拌5小时，得到化合物5/化合物6反应溶液。减压浓缩该化合物5/化合物6反应溶液，把残渣用中压二氧化硅凝胶色谱法(80g，三氯甲烷∶甲醇＝15∶1-5∶1)进行纯化，得到化合物7呈白色结晶。
所得化合物7的收量为69.2mg(收率为57％)。此外，得到的化合物7经过1H NMR(400MHz，CDCl3)测定时，得到δ7.39(4H，s，1H×4，aromatic H)，δ7.39-6.53(21H，m，aromatic H)，δ3.63(2H，s，NCH2*Ph)，δ3.15(4H，d，CH2×2，J＝6.2Hz，CH2*NHCO)，δ2.76(8H，t，CH2×4，J＝6.2Hz，MeOCOCH2CH2*N)，δ2.49(8H，t，CH2×4，J＝6.2Hz，MeOCOCH2*CH2N)，δ2.45(4H，t，CH2×2，J＝6.4Hz，CH2*NBn)，δ2.38(4H，t，CH2×2，J＝6.6Hz，NCH2CH2*NCO)，δ2.03(4H，t，CH2×2，J＝6.4Hz，NCOCH2*CH2NBn)，δ1.48(36H，s，CH3×12，Me of BOC)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z 693.3[(M+2H)2+]。
为了获得化合物8，具体操作如下。即在化合物7(49.8mg，36.0μmol)中加入10％Pd-C(70.2mg)甲醇悬浮液中，氢氛围下室温彻夜搅拌，得到化合物7反应溶液。把化合物7反应溶液用膜过滤器过滤再对滤液进行减压浓缩，得到白色结晶的化合物8。
所得到化合物8的收量为36.8mg(收率为80％)。此外，得到的化合物8经过1H NMR(400MHz，CD3CD)的测定时，得到δ7.64(4H，s，1H×4，atomatic H)，δ7.05-6.91(12H，m，aromatic H)，δ3.40(4H，t，CH2×2，J＝5.4Hz，CH2*NHCO)，δ3.19(8H，br，CH2×4，MeOCOCH2CH2*N)，δ2.98(4H，br，CH2×2，NCH2CH2*NHCO)，δ2.89(4H，t，CH2×2，J＝5.6Hz，CH2CH2*NH)，δ2.71-2.70(4H，br，CH2×2，J＝5.6Hz，MeOCOCH2*CH2N)，δ2.36(4H，t，CH2×2，J＝5.4Hz，NHCOCH2*CH2NBn)，δ1.39(36H，s，CH3×12，Me of BOC)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z 647.9[(M+2H)2+]。
其次，如下述通式(13)所示，在温度50℃，三乙胺(式中，TEA)的存在下，在DMF中，去保护成为自由的化合物8，用5氟苯基(Pfp)活化得到生物素，使该生物素与化合物8的氨基缩合反应，得到化合物9(收率为63％)。然后，在0℃温度条件下，在含有三氟乙酸(式中，TFA)的CH2Cl2中，除去化合物9的Boc基的保护，得到本发明接头化合物作为化合物10。
为了获得化合物9，具体操作如下。即把生物素(80.1mg，0.397mmol)、二环己基羰二亚胺(80.8mg，0.39mmol)在氩氛围下，溶解在无水二甲基甲酰胺(1mL)中，50℃搅拌4个小时，加入5氟苯(120mg，0.65mmol)50℃彻夜搅拌，得到生物素反应溶液。在生物素反应溶液中加入化合物8(70.6mg，54.5mmol)、三乙胺(60μL，0.811mmol)50℃彻夜搅拌，得到化合物8反应溶液。减压浓缩该化合物8反应溶液，把残渣溶解在乙酸乙酯100ml中，用饱和食盐水(50mL×3)洗涤后，有机相中加入硫酸钠并干燥。从干燥的残渣中滤去干燥剂，减压浓缩滤液，用中压二氧化硅凝胶色谱法(25g，三氯甲烷∶甲醇＝10∶1-5∶1)进行纯化，得到化合物9呈白色结晶。
所得化合物9的收量为52.3mg(收率为63％)。此外，得到的化合物9经过1H NMR(400MHz，CD3OD)测定时，得到δ7.61(2H，s，atomatic H)，δ7.57(2H，s，aromatic H)，δ7.06-6.95(12H，m，aromatic)，δ4.31(1H，dd，JB7/B6＝4.3，JB7/B3＝6.6Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.09(1H，dd，JB3/B4＝4.5，JB3/B7＝6.6Hz，Biotin NCH*CHS)，δ3.35(4H，t，CH2×2，J＝6.8Hz，CH2CH2*NCH2CH2CONHph)，δ3.19-3.17(4H，m，CH2×2，NCH2*CH2CONHCH2CH2)，δ2.98-2.93(1H，m，JB4/B3＝4.5Hz，BiotinNHCHCH*S)，δ2.78-2.72(9H，m，CH+CH2×4，JB6a/B6b＝10Hz，JB6a/B7＝4.3Hz，Biotin NHCHCH2*S，NCH2*CH2CONHph)，δ2.53-2.50(4H，br，CH2×2，CH2*CH2NCH2CH2CONHph)，δ2.44-2.40(9H，m，CH+CH2×4，JB6b/B6a＝10Hz，Biotin NHCHCH2*S，NCH2CH2CONHph)，δ2.20(2H，t，JB12/B11＝7.6Hz，BiotinCH2CH2CH2CH2*CO)，δ2.16(4H，t，CH2×2，J＝6.8Hz，CH2CH2*NCH2CH2CONHph)，δ1.55-1.51(4H，br，CH2×2，BiotinCH2*CH2CH2*CH2CO)，δ1.40(36H，s，CH3×12，Me of BOC)，δ1.28-1.24(2H，m，CH2×1，Biotin CH2CH2*CH2CH2CO)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z761.4[(M+2H)2+]。
为了获得化合物10，具体操作如下。即把化合物9(52.3mg，34.4μmol)溶解在二氯甲烷(1.5mL)中，加入三氟乙酸(1mL)0℃搅拌1个小时，得到化合物9/三氟乙酸反应溶液。减压浓缩该化合物9/三氟乙酸反应溶液，把残渣用LH20(140mL，甲醇析出)纯化，得到黄色结晶的化合物10。
所得化合物10的收量为50.9mg(收率为94％)。此外，得到化合物10经过1H NMR(400MHz，CD3OD)测定时，得到δ7.51(4H，s，atomatic H)，δ7.21(8H，s，aromatic H)，δ6.83-6.81(4H，m，aromatic H)，δ4.32(1H，dd，JB7/B6＝4.3，JB7/B3＝8.0Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.14(1H，dd，JB3/B4＝4.4，JB3/B7＝8.0Hz，Biotin NCH*CHS)，δ3.59-3.52(12H，m，CH2×6，NCH2*CH2CONHph，CH2*CH2NCNH2CH2CONHph)δ3.47-3.37(4H，m，CH2×2，CONCH2*CH2CONH)，δ3.35-3.33(4H，m，CH2CH2*NCH2CH2CONHPh)，δ3.02(1H，dt，JB4/B9＝4.9Hz，Biotin NHCHCH*S)，δ2.92-2.89(8H，m，CH2×4，NCH2CH2*CONHPh)，δ2.79(1H，dd，Jgem＝12.8，Jvic＝5.0Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.58(1H，d，Jgem＝12.8Hz，BiotinNHCHCH2*S)，δ2.37(2H，t，J＝7.0Hz，CONCH2CH2*CONH)，δ2.31(2H，t，J＝7.1Hz，CONCH2CH2*CONH)，δ2.21(2H，t，CH2×1，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.48-1.19(6H，br，CH2×3，Biotin COCH2CH2*CH2*CH2*)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z 1142.6[(M+Na)2+]。此外还得到[a]D22＝+0.947(c 0.972，MeOH)。
经确认得到的化合物10为ESI-MS(positive)m/z 1120.62[(M+H)+]，具有通式(13)表示的化合物10的结构。此外，通过进行NMR测定，得到的NMR测定数据也确认了具有上述化合物10表示的结构。
用实施例1得到的接头化合物(化合物10)按照以下步骤合成通式(13)表示的配位体结构。
如下述通式(14)所示，用溶剂为水∶乙酸(AcOH)∶甲醇＝12∶1∶15(5％乙酸溶液，pH4)针对上述化合物10加入9当量的麦芽糖，室温下，搅拌1.5天。然后，用飞行时间型质谱分析仪确定形成了4个单元的希夫碱之后，分2次添加20当量的NaBH3CN作为还原剂，室温下，搅拌4天，进行还原氨基反应。把得到的化合物用HP-20(ダイアイオン)纯化，得到化合物11作为本发明配位体(收率为89％)。所得该化合物11其麦芽糖集合了由5个单元-7个单元形成的混合物。
(其中，R1、R2、R3、R4各自独立地具有用H-或 表示的结构)[实施例3·配位体的合成]使用在实施例2中得到的接头化合物(化合物10)，按照以下步骤合成包括上述通式(5)所表示的结构配位体。
如下述通式(15)所示，除了使用所述通式(8)所示的糖分子来替代麦芽糖以外，其他均与实施例2操作相同得到化合物12。
为了得到具体化合物12，实施以下操作。即，把接头化合物10(2.4mg，2.1μmol)和，所述的通式(8)表示的糖分子(简称为GlcNS6S-IdoA2S-Glc，11.0mg，12.8μmol)溶解在混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝12/1/15，0.4mL)中，室温搅拌2个小时。向接头化合物10/GlcNS6S-IdoA2S-Glc反应溶液)中加入氢化氰硼钠(约3mg，40μmol)室温下搅拌2天后，再加入氢化氰硼钠(约2mg，40μmol)室温下彻夜搅拌，进行还原。将还原的接头化合物10/GlcNS6S-IdoA2S-Glc反应溶液减压浓缩，用SephadexG-50 fine[100mL析出液0.85M食盐水+PBS(1/1vol.)混合溶液]纯化，收集浓缩经过在254nmUV吸收证实的级分，将残渣冻干。由此得到的冻干的残渣用HP-20(60mL)再次脱盐，收集浓缩用水/甲醇＝1/1析出的级分，冻干。由此得到的冻干的残渣级分用SephadexG-10(20mL)再度脱盐，经过在254nmUV吸收证实的级分，冻干，得到白色结晶的化合物12。
所得化合物12的收量为4.99mg(收率为42％)。此外，得到的化合物12经过1H NMR(500MHz，D2O)测定时，得到δ7.14-7.12(4H，br，aromaticH)，δ6.91-6.59(12H，br，arometic H)，δ5.36-5.34(4H，br，H-1″)，δ5.12(4H，br，H-1′)，δ4.51(4H+1H，d，J＝2.6Hz，H-5′，Botin NHCH*CH2S)，δ4.29(4H×2，d，Jgem＝9.3Hz，H-6″b，H-2′)，δ4.19(4H×3，d，Jgem＝9.3Hz，H-6″a，H-3′，Biotin NHCH*CHS)，δ4.05(4H，d，J＝2.5Hz，H-4′)，δ4.00-3.93(4H×3，m，H-5″，H-1b，H-6b)，δ3.86-3.85(4H，m，H-5)，δ3.78-3.72(4H，m，H-4)，δ3.70(4H，t，H-3″)，δ3.67-3.59(4H×2，m，H-3，H-6b)3.56-3.52(4H，br，Link PhNHCOCH2CH2NCH2CH2*)，δ3.42(4H，t，J＝6.6Hz，Link COCH2CH2*NCO)，δ3.36-3.30(4H×2+8H，m，H-2，H-4″，LinkPhNHCOCH2CH2*N)，δ3.25(4H，dd，J＝10.3，3.3Hz，H-2″)，δ3.18-3.05(1H×2，br，H-1a，Biotin NHCHCH*S)，δ2.93-2.90(4H，br，LinkPhNHCOCH2CH2NCH2*CH2)，δ2.89(1H，br，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.82(4H，t，J＝6.6Hz，Link COCH2*CH2NCO)，δ2.72-2.70(1H，br，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.58(8H，t，J＝6.6Hz，Link PhNHCOCH2*CH2N)，δ2.05(2H，br，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.53(2H，t，J＝7.6Hz，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)，δ1.30(2H，t，J＝6.9Hz，COCH2CH2*CH2CH2)，δ1.17(2H，t，J＝7.1Hz，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。
在重水(D2O)中，在500MHz下测定NMR鉴定目的物。集合化度是根据以下所述强度比计算出来的。即NMR的伊杜糖醛酸部分的1位质子和接头结构内的芳香族质子(以16H为基准)的两者强度比为4.1∶16，推测GlcNS6S-IdoA2S-Glc平均集合4.1个分子。GlcNS6S-IdoA2S-Glc的n个分子集合的化合物的分子量(Mw)采用化合物10的分子量1120.4加上集合1个GlcNS6S-IdoA2S-Glc分子时的分子量840.97，如式⑥所示。
Mw＝1120.4+840.97n (式⑥)n＝4代入上式⑥，得到分子量4568.4，以此为基础计算收率如上所述求出42％。
关于实施例1得到的接头化合物即化合物10(以后，称作生物素接头10)，为了进行测定SPR因糖分子集合度的不同与植物凝血素间的相互作用而合成配位体。
(4-1糖分子单元未确定的配位体的合成)用生物素接头10集合糖分子得到配位体。生物素接头10溶解于甲醇但对水不溶，所以，使糖集合的还原氨基反应的溶剂作为水、乙酸、甲醇的混合溶剂，在pH4的条件下进行反应。
首先，选择葡萄糖作为集合生物素接头10的糖分子，在下述通式(19)中，按照以下步骤合成化合物16所表示的配位体。
如下述通式(19)所示，针对实施例1得到的生物素接头10使用8当量(每1个1-氨基为2当量，8.0mg，44μmol)的葡萄糖把两者溶解于混合溶剂中室温下彻夜搅拌得到生物素接头10/葡萄糖反应溶液。反应的踪迹用ESI-MS来测定。少量取出反应中的上述生物素接头10/葡萄糖反应溶液用甲醇稀释测定稀释标样，当确认希夫碱基形成时，在该阶段中，大部分的生物素接头10的氨基以游离状态存在，希夫碱基的生成率低。这样，依次追加上述生物素接头10/葡萄糖反应溶液，最后使28当量的葡萄糖反应，经ESI-MS测定的结果可知，生物素接头10以希夫碱基的形式存在。另外，生物素接头10中的4个残基氨基并不都成为希夫碱基，还有，仅3个、或2个、或1个残基的氨基成为希夫碱基的化合物也存在。
在该阶段中，在生物素接头10/葡萄糖反应溶液加入氢化硼钠作为还原剂，使希夫碱基还原。还原反应结束后，用HP-20(商品名)纯化还原的生物素接头10/葡萄糖反应溶液，得到本发明配位体的化合物16。
对所得化合物16进行ESI-MS测定的结果，可知该化合物已经集合了7个或8个葡萄糖分子。这是因为过量地加入葡萄糖的缘故，在希夫碱基被还原而产生的仲氨基上葡萄糖进一步参加反应的缘故。从ESI-MS测定的结果来看，可知上述化合物16是一种7个或8个葡萄糖单元(分子)的配位体的混合物。另外，所得上述化合物16的收率假设为8个分子集合的化合物，为42％。以下，将该化合物16简称为8-Glc。
为了得到化合物16，具体地进行以下操作。即，使生物素接头10(6.0mg，5.4μmol)和葡萄糖(8.0mg，44μmol)溶解于混合溶剂(＝6/1/15，0.4mL)中室温下彻夜搅拌后，追加葡萄糖(10mg，55μmol)，6小时后，在次追加葡萄糖(10mg，55μmol)彻夜搅拌，得到生物素接头10/葡萄糖反应溶液。将氢化氰硼钠(10mg，160μmol)加入该生物素接头10/葡萄糖反应溶液中，室温下彻夜搅拌，进行还原反应。减压浓缩经该还原反应的生物素接头10/葡萄糖反应溶液，把其残渣用HP-20(70mL)纯化，收集浓缩用水/甲醇＝1/1析出的级分，冻干，得到白色结晶的化合物16。
所得化合物16的收量为5.1(收率为42％，以8个取代物为计)。此外，得到的化合物16经过1H NMR(400MHz，D2O)测定时，得到δ6.92(4H，d，J，＝7.6Hz，aromatic H)，δ6.73(4H，s，aromatic H)，δ6.50-6.45(8H，br，aromaticH)，δ4.3-4.27(1H，m，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.05-4.02(1H，br，BiotinNHCH*CHS)，δ3.95-3.91(8H，m，H-2′)，δ3.76-3.71(8H，m，H-5′)，δ3.65-3.59(8H×2，m，H-3′，H-6′b)，δ3.58-3.45(8H×3，m，H-6′a，H-4′，H-1′b)，δ3.25(8H，dd，Jgem＝15.0，Jvic＝9.6Hz，H-1′a)，δ3.19-3.16(8H，br，LinkCH2*CH2NCH2CH2CONHPh，NHCOCH2CH2*NCO)，δ2.72-2.68(9H，br，CH2×4+1H，Link NCH2*CH2NHCOPh，Biotin NHCH2CH2*S)，δ2.54-2.49(5H，br，CH2×2+1H，Link CH2*NCH2CH2NHCOPh，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.41(8H，br，CH2×4，Link NHCOCH2CH2*NCO)，δ2.07(2H，br，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ2.00(4H，br，Link NHCOCH2CH2*NCO)，δ1.32(4H，br，Biotin COCH2CH2*CH2CH2*)，δ1.17-1.16(2H，br，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2)。此外，得到ESI-MS(positive)m/z 1217.5[(M8+2H)2+]。另外，M7为，含有7分子葡萄糖的配位体的分子量，M8为，含有8分子葡萄糖的配位体的分子量。
下面，将麦芽糖集合到生物素接头10上得到配位体。
用实施例1制得的生物素接头10按照如下顺序合成所述的通式(14)表示的结构的配位体。
如上述通式(14)所示，除了使用麦芽糖的当量(起始为9当量，再加9当量)以外，其他与上述实施例2相同进行操作，得到化合物11的本发明配位体。
制得的化合物11中的麦芽糖的集合度测定其混合物的NMR，从麦芽糖非还原末端1位质子和接头内的芳香族质子(以16H为基准)的强度比计算。两者的强度比为5.3∶16，推测麦芽糖平均集合5.3个分子。n个麦芽糖分子集合的化合物的分子量(Mw)采用生物素接头10的分子量1120.4加上1个麦芽糖分子集合时的分子量326.3，如下式①所示。
Mw＝1120.4+326.3n (式①)把n＝5.3代入上式①中，得到分子量2849.8，以此为基础，计算上述化合物11的收率，求出88％。以下，将该化合物11简称为5.3-Mal。
为了得到化合物11，具体操作如下。即，将生物素接头10(3.2mg，2.9μmol)和麦芽糖(9.4mg，26μmol)溶解于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝6/1/15，0.2mL)中，室温下搅拌8个小时后，再加入麦芽糖(9.3mg，26μmol)室温下彻夜搅拌，得到生物素接头10/麦芽糖反应溶液。在该生物素接头10/麦芽糖反应溶液中加入氢化氰硼钠(约5mg，80μmol)室温下彻夜搅拌后，再加入氢化氰硼钠(约5mg，80μmol)室温下彻夜搅拌还原。减压浓缩经该还原反应的生物素接头10/麦芽糖反应溶液，把其残渣用HP-20(70mL)纯化，收集浓缩用水/甲醇＝1/1析出的级分，冻干，得到白色结晶的化合物11。
所得化合物11的收量为7.81(收率为89％，以5.3个取代物为计)。此外，得到的化合物11经过1H NMR(500MHz，D2O)测定时，得到δ7.31-6.51(16H，br，aromatic H)，δ5.05(1H×5.3，br，H-1)，δ4.56-4.44(1H，br，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.25-4.20(1H，br，Biotin NHCH*CHS)，δ3.92-3.91(1H×5.3，br，H-2′)，δ3.84-3.82(1H×5.3×3，br，H-5，H-5′，H-6b)，δ3.78(1H×5.3×2，dd，Jgem＝13.7，Jvic＝4.5，Hz，H-6a，H-6′b)，δ3.72-3.69(1H×5.3×3，br，J3/4＝8.2Hz，H-6a′，H-3′，H-3)，δ3.67-3.62(1H×5.3，br，H-4′)，δ3.53(1H×5.3，d，J2/1＝10.0Hz，H-2)，δ3.41(1H×5.3，t，J4/3＝9.5Hz，H-4)，δ3.37-3.36(4H，br，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh)，δ3.33-3.30(4H，br，Link NHCOCH2CH2*NCO)，δ3.27-3.24(1H×5.3，br，H-1′b)，δ3.17-3.05(1H×5.3+1H，m，Jgem＝13.1，Jvic＝6.2Hz，H-1′a，Biotin NHCHCH*S)，δ2.88-2.84(9H，br，CH2×4+1H，Link NCH2*CH2NHCOPh，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.77-2.70(1H，br，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.60-2.65(4H，br，LinkNHCOCH2*CH2NCO)，δ2.56(8H，br，CH2×4，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.20(2H，t，JB12/B11＝5.0Hz，Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ2.18-2.13(4H，br，Link CH2CH2*NCH2CH2NHCOPh)，δ1.59-1.55(2H，br，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2)，δ1.54-1.43(2H，br，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)，δ1.28-1.27(2H，br，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。另外，得到ESI-MS(positive)m/z 1702.2[(M8+2H)2+]，1540.3[(M7+2H)2+]，1376.9[(M6+2H)2+]。另外M6为，含有6分子麦芽糖的配位体的分子量，M7为，含有7分子葡萄糖的配位体的分子量，M8为，含有8分子葡萄糖的配位体的分子量。
(4-2 4个糖分子单元的配位体的合成)如上述，针对生物素接头10过量地加入集合的糖，得到超过需要的糖而集合成不均匀的集合物。因此，为了得到目的4个单元(分子)的糖分子的配位体，调制所加糖分子的当量数。其中，选择葡萄糖、麦芽糖、乳糖3种糖作为集合化的糖分子。
首先，使用实施例1制得的生物素接头10，按照以下步骤合成具有所述通式(16)Y表示O的结构的配位体。
如下述通式(20)所示，首先对生物素接头10加入6当量葡萄糖，依次加入葡萄糖共计加入12当量时，除了即使还残存未参加反应的接头还要添加还原剂之外，其余与上述实施例4中的(4-1)相同，进行同样操作，得到化合物19的本发明的配位体。
R＝HO-或…(20)(相当于19) 或(相当于20) (相当于21)用HP-20同样地纯化经彻夜还原的生物素接头10/葡萄糖反应溶液制得的产物，经过ESI-MS测定的结果，证实了该产物是由4或5个葡萄糖分子集合的化合物的混合物。葡萄糖的集合度经该产物的NMR测定，葡萄糖还原物即山梨糖醇的1位质子和接头内的芳香族质子(以16H为基准)的强度比计算，两者的强度比为4.2∶16，推测平均4.2个葡萄糖分子集合。n个葡萄糖分子集合的化合物的分子量(Mw)采用生物素接头10的分子量1120.4加上1个葡萄糖分子集合时的分子量164.1，如下式②所示。
Mw＝1120.4+164.1n (式②)把n＝4.2代入上式②中，得到分子量1089.2，以此为基础计算上述化合物19的收率为24％。收率低是由于用HP-20纯化时而产生的损失的缘故。因此通过调整当量可以合成约4个葡萄糖分子集合的化合物。以下，将在末端具有4.2个山梨糖醇的山梨糖醇型的化合物19简称为4-Glc。
为了制得化合物19，具体操作如下。即，把生物素接头10(4.91mg，3.11mmol)和，葡萄糖(3.45mg，19.2mmol)溶于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝12/1/15，0.2mL)中，室温下，搅拌8个小时，得到生物素接头10/葡萄糖反应溶液。进一步再该生物素接头10/葡萄糖反应溶液里，加入葡萄糖(1.64mg，9.1mmol)室温彻夜搅拌后，加入氢化氰硼钠(4mg，48mmol)，室温彻夜搅拌，还原。将还原的生物素接头10/葡萄糖反应溶液减压浓缩，残渣用HP-20(70mL)纯化，收集并浓缩甲醇析出的级分，使残渣冻结干燥，得到白色结晶的化合物19。
所得化合物19的收量为2.77mg(收率为35％)。此外，所得化合物19经过1H NMR(500MHz，D2O)测定时，得到δ7.05-7.02(4H，m，aromatic H)，δ6.86-6.52(12H，m，aromatic H)，δ4.44(1H，dd，JB7/B8＝5.3，JB7/B3＝7.5Hz，BiotinNHCH*CH2S)，δ4.17(1H，dd，JB3/B4＝4.5，JB3/B7＝7.9Hz，Biotin NHCH*CHS)，δ3.92(4H，td，J＝8.6，4.7Hz，H-2)，δ3.80-3.73(12H，m，H-3，H-6b，5)，δ3.68-3.60(8H，m，1H×4×2，H-6a，4)，δ3.30-3.25(20H，m，1H×4+CH2×2×2，H1a，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh，CONCH2*CH2CONH)，δ3.07(4H，1H×4，dd，Jgem＝13.2，Jvic＝8.2，Hz，H1b)，δ3.06-3.04(1H，m，Biotin NHCH*CHS)，δ2.86-2.83(8H，CH2×4，br，Link NHCH2*CH2CONHPb)，δ2.63-2.61(4H，2H×4，2，Link CONCH2CH2*CONH)，δ2.54-2.53(8H，br，CH2×4，LinkNCH2CH2*CONHPh)，δ2.21-2.06(6H，br，CH2×3，LinkCH2CH2*NCH2CH2CONHPb Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ1.55(2H，br，CH2×1，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2)，δ1.43-1.42(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)，δ1.30-1.23(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 911.4[(M+2Na)2+]。另外，[a]D22＝+0.373(c 0.0295，H2O)。
接着，用实施例1制得的生物素接头10，按照以下步骤合成具有所述通式(17)Y表示O的结构的配位体。
如下述通式(20)所示，除了把8当量的麦芽糖换成葡萄糖以外，其余与上述实施例4中的(4-1)相同，进行同样操作，得到化合物20的本发明的配位体。所得化合物20在NMR中末端葡萄糖1位质子和，芳香族的强度比为4.1∶16，推测它是平均4.1个分子的麦芽糖集合的化合物。化合物20的收率计算同化合物19一样把集合度4.1代入上述(式①)中，求得收率为69％。以下，末端具有4.1分子的α-葡萄糖的化合物20称为4-Mal。
为了得到化合物20，以下进行具体操作。即，使生物素接头10(25.0mg，15.8μmol)和，麦芽糖(34.3mg，95.1μmol)溶于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝15/1/15，0.55mL)中，室温下，搅拌9个小时，得到生物素接头10/麦芽糖反应溶液。再把麦芽糖(10.7mg，29.7μmol)加入到该生物素接头10/麦芽糖反应溶液中，室温下彻夜搅拌后，加入氢化氰硼钠(15mg，240μmol)，室温下彻夜搅拌，使之还原。把还原的生物素接头10/麦芽糖反应溶液减压浓缩，用HP-20(70mL)纯化残渣，收集并浓缩用水/甲醇＝1/1以及甲醇析出的级分，冻干残渣，得到白色结晶的化合物20。
所得的化合物20的收量为26.7mg(收率为70％)。此外，所得化合物20经过1H NMR(500MHz，D2O)测定时，得到δ7.06-7.01(4H，m，aromatic H)，δ6.78-6.77(4H，m，aromatic H)，δ6.70-6.66(4H，m，aromatic H)，δ6.51-6.50(4H，m，aromatic H)，δ5.04(4H，d，1H×4，Jvic＝2.7Hz，H-1)，δ4.43(1H，dd，JB7/B6＝8.0，JB7/B3＝4.9Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.19-4.17(1H，br，Biotin NHCH*CHS)，δ3.92-3.90(8H，m，CH×4×2，H-2′，5′)，δ3.83-3.80(8H，m，CH×4×2，H-5，6′a)，δ3.73(8H，dd，CH×4×2，J3/2＝5.2，J3′/2′＝5.0Hz，H-3，3′)，δ3.60(4H，dd，CH×4，J＝7.4，11.7Hz，H-4′)，δ3.53(4H，dd，CH×4，J2/3＝8.0，J2/1＝3.7Hz，H-2)，δ3.41(4H，t，CH×4，J＝9.5Hz，H-4)，δ3.30-3.22(12H，m，1H×4+CH2×2×2，H1′b，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPhCONCH2*CH2CONH)，δ3.14(4H，dd，1H×4，Jgem＝12.9，Jvic＝8.0Hz，H-1′a)，δ3.06(1H，m，Biotin NHCHCH*S)，δ2.84-2.83(9H，br，CH+CH2×4，Link CONCH2CH2*CONH，BiotinNHCHCH2*S)，δ2.70-2.66(5H，br，CH+CH2×4，Link CONCH2*CH2CONH，Biotin NHCH*CH2S)，δ2.62.-2.60(4H，br，CH2×2，Link CONCH2CH2*CONH)，δ2.53-2.52(8H，br，CH2×4，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.20-2.04(6H，br，CH2×3，Link CH2CH2*NCH2CH2CONHPh，Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ1.55(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2*CH2CH2)，δ1.43-1.42(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)，δ1.30-1.23(2H，br，CH2×1，BiotinCOCH2CH2CH2CH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 817.0[(M+3H)3+]。另外，[a]D22＝+5.11(c 0.243，H2O)。Calcd for C104H165N15O48S·11.9H2OC，47.30；H7.16；N，7.96％.FoundC，47.30；H，6.88；N，7.86％。
接着，用实施例1制得的生物素接头10，按照以下步骤合成具有所述通式(18)Y表示O的结构的配位体。
如下述通式(20)所示，除了把8当量的乳糖换成葡萄糖以外，其他与上述(4-1)相同，进行同样操作，得到化合物21的本发明的配位体。所得化合物21在NMR中末端半乳糖1位质子和，芳香族质子的强度比为4.2∶16，推测它是平均4.2个分子的乳糖集合的化合物。此时，也可以根据上述式①的分子量进行计算，代入集合度4.2，求得分子量为2477.8，以此为基础，进行计算，求出收率为57％。以下，末端具有4.2分子的β-半乳糖的化合物21称为4-Lac。
为了得到化合物21，以下进行具体操作。即，使生物素接头10(7.88mg，5.0μmol)和，乳糖(10.6mg，29.4μmol)溶于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝20/1/15，0.4mL)中，室温下，搅拌10个小时，得到生物素接头10/乳糖反应溶液。再把乳糖(3.59mg，10.0μmol)加入该生物素接头10/乳糖反应溶液中，室温下彻夜搅拌后，加入氢化氰硼钠(5mg，80μmol)，室温下彻夜搅拌，使之还原。把还原的生物素接头10/乳糖反应溶液减压浓缩，用HP-20(70mL)纯化残渣，收集并浓缩用水/甲醇＝1/1以及甲醇析出的级分，冻干残渣，得到白色结晶的化合物21。
所得化合物21的收量为7.08mg(收率为59％)。此外，所得化合物21经过1H NMR(600MHz，D2O)测定时，得到δ6.99(4H，d，J＝8.3Hz，aromatic H)，δ6.72(4H，d，J＝6.9Hz，aromatic H)，δ6.65(4H，d，J＝8.3Hz，aromatic H)，δ6.47(4H，t，J＝6.2Hz，aromatic H)，δ4.38(4H，d，1H×4，Jvic＝7.7Hz，H-1)，δ4.35(1H，m，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.09(1H，dd，JB3/B4＝4.4，JB3B7＝7.9Hz，Biotin NHCH*CHS)，δ3.97-3.94(4H，m，CH×4，H-2′)，δ3.84-3.81(8H，m，CH×4×2，H-5，H-5′)，δ3.79(8H，d，CH×4×2，J4/3＝3.0Hz，H-4，6a)，δ3.75-3.73(12H，m，CH×4×2，H-3′，6′a，6b)，δ3.63(4H，dd，CH4，J4′/3′＝6.1Hz，H-4′，6′b)，δ3.57-3.56(4H，m，CH2×4，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh)，δ3.52(4H，dd，J3/2＝10.0，J3/4＝3.5 Hz，H-3)，δ3.49(4H，t，CH2×2，J＝6.3Hz，LinkCH2CH2*NCH2CH2CONHPh)，δ3.46(4H，dd，J2/1＝7.7，J2/3＝10.0Hz，H-2)，δ3.29-3.19(12H，br，CH×4+CH2×4，Link NCH2*CH2CONHPh，H-1’b)，δ3.02-2.98(5H，m，Biotin NHCHCH*S，H-1’a)，δ2.81-2.75(9H，br，CH+CH2×4，Link NCH2*CH2CONHPh，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.59(1H，d，Jgem＝13.2Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.48(8H，br，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.13-2.03(6H，br，Link CONCH2CH2*CONH，Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ1.47(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)，δ1.35(2H，br，CH2×1，BiotinCOCH2CH2CH2*CH2)，δ1.18(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。此外，ESI-MS(positive)m/z 831.3[(M+3Na)3+]。另外，[a]D22＝-11.3(c 0.292，H2O)。Calcd for C104H165N15O48S·10.4H2OC，47.78；H7.12；N，8.04％.FoundC，47.78；H，6.95；N，8.00％。

在本实施例中，合成引入乙酰基来替代生物素的接头化合物，作为对照化合物。即，如下述通式(21)所示，使吡啶中的乙酸酐与引入生物素之前的仲胺化合物8反应并乙酰化，得到化合物14。然后，把化合物14的末端的Boc基与先前的条件相同，去保护，定量地得到接头化合物15。以下，把该接头化合物15简称为乙酰接头15。
为了得到化合物14，具体操作如下。即，把化合物8(13.1mg，54.5μmol)溶于吡啶(0.5mL)中，然后其中加入乙酸酐(0.5mL，5.3mmol)室温下，搅拌4个小时。减压浓缩反应溶液，用甲苯共沸2次，用中压二氧化硅凝胶色谱法(5g，三氯甲烷∶甲醇＝10∶1-5∶1)纯化，得到黄色结晶的化合物14。
所得化合物14的收量为12.8mg(收率为95％)。此外，所得化合物14经过1H NMR(400MHz，CD3OD)测定时，得到δ7.60(4H，t，J＝6.6Hz，aromaticH)，δ7.09-6.97(12H，m，aromatic H)，δ3.32(4H，t，J＝6.6Hz，AceNCH2*CH2CONH)，δ3.19-3.17(4H，br，AceNCH2CH2CONHCH2*)，δ2.77(8H，t，J＝6.1Hz，NCH2CH2*CONHPh)，δ2.52(4H，t，J＝6.4Hz，AceNCH2CH2CONHCH2CH2*)，δ2.42(8H，d，J＝6.1Hz，NCH2*CH2CONHPh)，δ2.12(4H，t，J＝6.6Hz，AceNCH2CH2*CONH)，δ1.90(s，3H Me of Ace)，δ1.40(s，36H Me of Boc)。此外，ESI-MS(positive)m/z 688.9[(M+2H)2+]。
还有，为了得到乙酰接头15，具体操作如下。即，把化合物14(12.8mg，9.6μmol)溶解在二氯甲烷(0.5mL)中，加入三氟乙酸(0.5mL)0℃搅拌1个小时，得到化合物14/三氟乙酸反应溶液。减压浓缩化合物14/三氟乙酸反应溶液，把残渣用LH-20(140mL，甲醇析出)纯化，得到乙酰接头15的黄色结晶。
所得乙酰接头15的收量为14.9mg(收率为100％)。此外，所得乙酰接头19经过1H NMR(400MHz，CD3OD)测定时，得到δ7.50(4H，s，aromaticH)，δ7.27-7.19(8H，m，aromatic H)，δ6.86-6.81(4H，m，aromatic H)，δ3.57-3.51(12H，br，AceNCH2CH2CONHCH2*，NCH2*CH2CONPh)，δ3.40(4H，dd，J＝6.4Hz，AceNCH2*CH2CONH)，δ3.35-3.32(4H，br，J5/4＝5.1Hz，AceNCH2CH2CONHCH2CH2*)，δ2.91(4H，t，J7/6＝6.1Hz，NCH2CH2*CONHPh)，δ1.88(s，3H，Me of Ace)。此外，ESI-MS(positive)m/z 647.8[(M+2H)2+]。
用上述制得的乙酰接头15，集合麦芽糖得到配位体。如下述通式(22)所示，除了使27当量的麦芽糖与乙酰接头15反应，来替代葡萄糖与生物素接头10反应以外，与上述实施例4的(4-1)相同，进行同样操作，得到化合物18。
所得化合物18在NMR中麦芽糖非还原末端1位质子和接头由来的芳香族质子的强度比为7.9∶16，推测它是平均7.9个分子的麦芽糖集合的化合物。由n个麦芽糖分子集合的化合物的分子量(Mw)采用乙酰接头15的分子量936..1加上1个分子麦芽糖集合时的分子量326.3，如下述式③所示。
Mw＝936.1+326.3n (式③)把n＝7.9代入上述(式③)中，得到分子量3562.8，以此为基础，计算化合物18的收率为50％。以下，把该化合物18简称为Ace-8-Mal。
为了得到化合物18，具体操作如下。即，使乙酰接头15(3.73mg，7.3μmol)和，麦芽糖(11.5mg，33.6μmol)溶于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝6/1/15，0.25mL)中，室温下彻夜搅拌后，再加入麦芽糖(13.0mg，38.0μmol)室温搅拌，7个小时后再加入麦芽糖(14.7mg，42.9μmol)之后，加入氢化氰硼钠(20mg，320μmol)室温下彻夜搅拌，得到反应溶液。向该反应溶液中再加入氢化氰硼钠(20mg，320μmol)室温下彻夜搅拌。再次减压浓缩加入氢化氰硼钠的反应溶液，将残渣用HP-20(70mL)纯化，收集浓缩用水/甲醇＝1/1析出的级分，冻干残渣，得到白色结晶的化合物18。
所得化合物18的收量为7.02mg(收率为50％，以8个取代物为计)。此外，所得化合物18经过1H NMR(500MHz，D2O)的测定时，得到δ7.09-7.04(4H，br，J＝7.6Hz，aromatic H)，δ6.93-6.91(4H，br，aromatic H)，δ6.65-6.58(8H，br，aromatic H)，δ5.05(1H×8，d，J1/2＝2.3Hz，H-1)，δ3.88(1H×8×2，br，H-2′，5′)，δ3.82(1H×8，br，H-6b)，δ3.74(1H×8×2，dd，Jgem＝12.4，Jvic＝5.5Hz，H-6′b，H-6a)，δ3.69(1H×8，br，J3/4＝9.4Hz，H-3)，δ3.67-3.64(1H×8×2，br，H-3′，6′a)，δ3.59-3.57(1H×8，br，H-4′)，δ3.53(1H×8，dd，J2/1＝9.9，J2/3＝3.5Hz，H-2)，δ3.41(1H×8，t，J4/3＝9.6，Hz，H-4)，δ3.30(8H，br，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh，NHCOCH2CH2*NCO)，δ3.24(1H×8，br，H-1′b)，δ3.15(1H×8，br，H-1′a)，δ2.87-2.82(8H，br，Link NCH2*CH2CONHPh)，δ2.66(4H，br，J＝8.0Hz，LinkCH2*CH2NCH2CH2CONHPh)，δ2.57(8H，br，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.10-2.08(4H，br，J＝7.1hz，Link NHCOCH2*CH2NCO)，δ1.88(3H，s，Me of Ace)。此外，ESI-MS(positive)m/z 1190.4[(M8+2Na+H)3+]，1081.1[(M7+2H+Na)3+]。此外，M7有7个分子麦芽糖的配位体的分子量，M8有8个分子麦芽糖的配位体的分子量。
为了比较对照，如下述通式(23)所示，使用在特许文献2记载的末端具有2个芳香族氨基残基的接头化合物22(divalent type，叫做生物素接头22)，集合2个单元(分子)的糖分子合成配位体。
同样地与上述实施例4的(4-2)中得到的集合4个单元糖分子的配位体情形相同，用生物素接头22合成集合2个单元(分子)的糖分子的配位体。另外，集合2个单元糖选择葡萄糖和麦芽糖。
首先，让生物素接头22集合葡萄糖，得到配位体的化合物23。如下述通式(24)所示，除了使4当量的葡萄糖与生物素接头22反应取代使葡萄糖与生物素接头10反应以外，其他均与上述实施例4的(4-1)操作相同，得到化合物23。化合物23的集合度在化合物23的NMR测定中，由葡萄糖还原物即山梨糖醇1位质子和生物素接头22内的芳香族质子(以8H为基准)的强度比计算。两者的强度比为2.1∶8，推测化合物23平均有2.1个分子集合葡萄糖。n个分子集合葡萄糖的化合物的分子量(Mw)采用生物素接头22分子量567.7加上1个分子葡萄糖集合时的分子量164.1，如式④所示。
Mw＝567.7+164.1n(式④)把n＝2.1代入上述式④中，得到分子量912.3，以此为基础，求出化合物23的收率为73％。以下，将化合物23简称为2-Glc。
接着，使麦芽糖集合在生物素接头22上，得到配位体的化合物24。如下述通式(24)所示，除了用麦芽糖代替葡萄糖以外，同样与得到上述化合物23的操作相同，集合麦芽糖，得到化合物23。在化合物24的NMR测定中，葡萄糖1位质子和生物素接头22内的芳香族质子(以8H为基准)的强度比计算。两者的强度比为2.0∶8，推测化合物24平均有2.0分子集合麦芽糖。n个分子集合麦芽糖的化合物的分子量(Mw)采用生物素接头22分子量567.7加上1个分子麦芽糖集合时的分子326.3，如式⑤所示。
Mw＝567.7+326.3n (式⑤)把n＝2.0代入上述式④中，得到分子量1207.2，以此为基础，求出化合物24的收率为76％。以下，将化合物24简称为2-Mal。
R＝HO-或…(24)(相当于23) (相当于24)为了得到化合物23，具体操作如下。即，使生物素接头22(4.14mg，7.3μmol)和，葡萄糖(3.84mg，21.3μmol)溶于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝6/1/15，0.25mL)中，室温下搅拌6小时，得到生物素接头22/葡萄糖反应溶液。向该生物素接头22/葡萄糖反应溶液中再加入葡萄糖(1.38mg，7.66μmol)室温下彻夜搅拌后，加入氢化氰硼钠(6mg，96μmol)室温下彻夜搅拌还原。将该还原的生物素接头22/葡萄糖反应溶液减压浓缩，将残渣用HP-20(70mL)纯化，收集浓缩用水/甲醇＝1/1析出的级分，冻干残渣，得到白色结晶的化合物23。
所得化合物23的收量为4.84mg(收率为74％)。此外，所得化合物23经过1H NMR(600MHz，D2O)的测定时，得到δ7.51(4H，d，J＝6.6Hz，aromaticH)，δ6.62(4H，d，J＝9.1Hz，aromatic H)，δ4.33(1H，dd，JB7/B4＝3.0，JB7/B6＝5.0hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ3.88(2H，dd，J2/1＝4.4，J2/3＝4.9Hz，H-2)，δ3.84(1H，dd，JB3/B4＝4.4，JB3/B7＝3.7Hz，Biotin NHCH*CHS)，δ3.75(2H，dd，J3/2＝4.9，J3/4＝3.2Hz，H-3)，δ3.74-3.72(2H，m，H-6b)，δ3.72-3.69(4H，br，CH2×2，Hz，Link NCH2CH2*NHCOPh)，δ3.69-3.67(2H，m，H-5)，δ3.64(4H，t，CH2×2，J＝4.6Hz，Link NCH2*CH2NHCOPh)，δ3.60(2H，dt，J4/3＝2.5，J4/5＝7.7Hz，H-4)，δ3.53(2H，dd，J＝2.2，6.0Hz，H-6a)，δ3.33-3.29(2H，dt，Jgem＝13.7，Jvic＝4.7Hz，H-1a)，δ3.11(2H，dt，Jgem＝11.2，Jvic＝3.3Hz，H-1b)，δ2.72(1H，dd，Jgem＝12.9，Jvic＝5.0Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.57(1H，d，Jgem＝13.2，Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.55-2.53(1H，m，J＝3.3，Hz，Biotin NHCHCH*S)，δ2.14(2H，t，JB12/B11＝7.0，Hz，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.22-1.10(4H，m，CH2×2 BiotinCOCHCH2*CH2CH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 470.7[(M+2Na)2+]。[a]D22＝+6.61(c 0.145，H2O)。Calcd for C40H61N7O14S·6.5 H2OC，47.45；H，7.31；N，9.69％.FoundC，47.44；H，6.580；N，9.60％。
此外，为了得到化合物24，具体操作如下。即，使生物素接头22(4.12mg，7.3μmol)和，麦芽糖(7.9mg，22.1μmol)溶于混合溶剂(水/乙酸/甲醇＝12/1/15，0.25mL)中，室温下彻夜搅拌，得到生物素接头22/麦芽糖反应溶液，然后，加入氢化氰硼钠(6mg，96μmol)室温下彻夜搅拌还原。将该还原的生物素接头22/麦芽糖减压浓缩，将残渣用HP-20(70mL)纯化，收集浓缩用水/甲醇＝1/1析出的级分，冻干残渣，得到白色结晶的化合物24。
所得化合物24的收量为6.71mg(收率为75％)。此外，所得化合物24经过1H NMR(500MHz，D2O)的测定时，得到δ7.60(4H，d，J＝4.5Hz，aromaticH)，δ6.74(4H，d，J＝8.8Hz，aromatic H)，δ5.09(2H，d，J1/2＝3.7Hz，H-1)，δ4.44(1H，dd，JB7/B6＝4.8，JB7/3＝3.1Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ3.95-3.93(2H，br，H-2′)，δ3.91-3.90(2H，br，H-5′)，δ3.90-3.89(2H+1H，br，Biotin NHCH*CHS，H-3′)，δ3.87-3.86(2H，br，H-5)，δ3.82(2H，d，Jgem＝12.7Hz，H-6a)，δ3.76(2H，dd，Jgem＝12.5，Jvic＝5.2Hz，H-6b)，δ3.72(4H，m，1H×2×2，Jgem＝12.1，J3/4＝9.3Hz，H-6′a，H-3)，δ3.66(4H，br，CH2×2，Link NCH2CH2*NHCOPh)，δ3.62(4H，d，Jgem＝11.8Hz，H-6′b，H-4′)δ3.58-3.54(6H，m，CH2×2+1H×2，Link NCH2CH2*NHCOPh)，δ3.42(2H，t，J4/3＝9.6Hz，H-4)，δ3.37(2H，dt，Jgem＝13.7，Jvic＝4.8Hz，H-1′b)，δ3.29(2H，td，Jgem＝7.4，Jvic＝3.0Hz，H-1′a)，δ2.83(2H，dd，Jgem＝13.0，Jvic＝5.1Hz，BiotinNHCHCH2*S)，δ2.67(2H，d，Jgem＝12.8Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.65-2.62(2H，m，Biotin NHCHCH*S)，δ2.24(2H，t，JB12/B11＝7.0Hz，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.31-1.19(4H，m，CH2×2，JB11/B12＝7.0，JB9/B10＝7.4Hz，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2*)，δ0.95-0.91(2H，m，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。此外，得到[a]D22＝+6.95(c 0.222，H2O)。Calcd for C52H81N7O24S·9.1 H2OC，47.13；H，7.17；N，7.09％.FoundC，45.13；H，6.63；N，7.37％。
如上所述，合成4个单元或2个单元集合糖分子的配位体。以下，用这些配位体根据SPR测定分析与蛋白质之间的相互作用。
在SPR测定中，大多数情况下，分析物与除了配位体外的分子进行非特异性相互作用。为此在实际测定的时候，观测的是特异性相互作用和非特异性相互作用共同引起共振角度的变化。减弱非特异性相互作用来观测察特异性相互作用在检测上是最大的问题。本发明人认为，根据下面的方法是否能解决这个问题(称作2通道分析法)。
本实施例中使用的进行STR测定的装置SPR670(商品名Nippon LaserElectronics LAB)有(S)，(R)2个通道，如图3所示，同时可以观测到它们各自表面上的配位体和分析物之间的相互作用。例如，一个表面固定4-Mal，另一个表面固定4-Glc，与葡萄糖结合的植物凝血素即伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A，Con A)在这2个表面上同时相同条件冲洗。Con A与4-Mal末端存在的吡喃葡萄糖结合，但很难与不具有末端的4-Glc结合。4-Mal和4-Glc除了在末端是否存在糖以外结构都相同，若与ConA之间的相互作用有差别，认为是由于存在于4-Mal末端的吡喃葡萄糖所引起的。即，所观测到的(S)，(R)的共振角度变化之差就相当于吡喃葡萄糖与Con A之间的相互作用。
如此地，分别把2种不同的配位体固定在(S)和(R)上，观察两者之间的相互作用之差，应用这样的现有技术手段，本发明人发现，除了末端有无糖之外，把具有相同结构的化合物用作配位体，由此可以检测出糖分子和蛋白质之间的特异性作用。
(5-1导入配位体的芯片的制作)首先，为了根据SPR测定分析糖分子和蛋白质之间的相互特异作用，把配位体固定在传感片上。即，把在实施例4中合成的配位体利用生物素-亲和素之间的键固定在芯片上，得到导入配位体的芯片(配位体载体)。另外，使亲和素固定于SPR传感片之后，再固定配位体。
为了得到具体的引入配位体的芯片，操作如下。即，首先，将13×20×0.7mm玻璃基板蒸镀有50nm金薄膜的日本激光电子株式会社生产的传感片，放入UV臭氧清洗器(商品名NL-UV253，日本レ一ザ一電子株式会社)照射20分钟紫外线，用臭氧清洁传感片的表面。接着，把该传感片浸入到装有100μM的4，4′-二硫代丁酸乙醇溶液的玻璃皿中，室温下，缓慢地震动30分钟(商品名Bio Dancer，New Brunswick Scientific公司)。用金-硫键把4-硫代丁酸固定在芯片上。用乙醇清洗该芯片3次之后，浸入到装有160mM水溶性碳化二亚胺的水溶液1mL和13mM的N-羟基琥珀酰亚胺1，4-Dioxan溶液9mL的混合溶液的玻璃皿中，室温下，缓慢地震荡30分钟。在玻璃皿中加入10mL水，室温下震荡5分钟，结束活性化反应。用水清洗4次芯片风干后，安装在SPR670的传感片架上。将其上的芯片用流动缓冲液冲洗，在金膜上照射激光，此时，记录所观测的表面等离子体振子共振角度变化。另外，流动缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)，除了冲洗样品外，经常以5mL/min的流速用流动缓冲液冲洗芯片。此外，SPR测定都是在一定温度(25℃)下进行的，测定用的样品溶液全部都用针筒式滤器(Whatman(copyrighe)PURADISC(注册商标)25TF 0.2mm PTFE Membranefilter)过滤，然后再使用。
流动冲洗芯片，共振角度变化达到一定值之后，把0.1mg/mL的NeutrAvidin(PIERCE，NeutrAvidin(注册商标)，CA47105)乙酸钠水溶液(10mM，pH5.5)，以5μL/min的流速，每60μL冲洗3次。在SPR中冲洗样品后，换成流动缓冲液，把剩余的样品冲洗掉，共振角度变化达到一定值之后，操作如下。为了使残存的活性酯失活(封闭反应)，用含有1.0M氨基乙醇的PBS溶液(pH8.5)以5μL/min的流速每60μL冲洗2次，得到亲和素附加芯片(亲和素附加物)。
接着，在各种浓度的实施例4中得到的配位体的PBS溶液以10μL/min的流速每60μL依次冲洗，上述亲和素附加芯片上固定配位体，得到引入配位体的芯片(配位体载体)。另外，配位体的固定反复进行直到无法确定SPR传感图应答单元的上升。
直到固定配位体的SPR传感图如图4所示的一个例子。这里，S通道(以下简称为(S))表示在上述实施例4(4-3)中得到的4-Mal，R通道(以下简称为(R))表示固定4-Glc时的传感图。传感图的横轴表示时间，纵轴表示共振角度变化(Response(RU；Response Unit))。
除了添加分析物时候以外，作为流动缓冲液的磷酸缓冲液(pH7.4，以下简称为PBS)不断地以5μL/min的流速冲洗。往芯片上添加分析物结束后，自动地使PBS流动，清洗剩余的没有参加结合的分析物。若以5μL/min的流速60μL冲洗0.1mg/mL的NeutrAvidin乙酸钠水溶液(10mM乙酸钠，pH5.5)，可以观测到共振角度的增加，即可知NeutrAvidin已经被固定在芯片上。
其后，为了封闭芯片上残存的活性酯，将含有1.0M乙醇胺的PBS溶液以5μL/min的流速冲洗60μL。封闭后，当共振角度变化达到一定值时，和NeutrAvidin溶液冲洗之前和之后的共振角度变化量作为固定量。该传感图的固定量(S)为3690RU，(R)为3480RU。
接着，以10μL/min的流速分别冲洗60μL在(S)上固定4.9μM、16.3μM、49μM的4-Mal溶液，在(R)上固定0.49μM、4.9μM的M4-Glc溶液。将没有被固定的多余的配位体冲洗掉，当共振角度变化达到一定值时，和固定前和固定后的共振角度变化量作为固定量。另外，配位体的固定反复进行直到即使冲洗集合物固定量也不增加的状态为止。在该传感图上4-Mal的固定量为220RU，4-Glc的固定量为220RU，2种不同配位体固定程度相同可以制作导入配位体的芯片。用同样的方法制作配位体不同的各种类型的配位体导入芯片。
(5-2配位体固定的鉴定)合成的配位体通过生物素-NeutrAvidin键用SP测定鉴定是否被固定在芯片上，其使用化合物18(Ace-8-Mal)，所述化合物18(Ace-8-Mal)是在比较例1(无生物素)中得到的根据乙酰接头15使麦芽糖集合而成的。即，在与5.3-Mal条件相同，NeutrAvidin被固定的芯片上把Ace-8-Mal冲洗，其若没有被固定时，可以证实没有固定非特异配位体。
首先，与上述(5-1)一样，制作已固定NeutrAvidin的亲和素附加物芯片。此时的NeutrAvidin固定量，(S)为6620RU，(R)为6330RU。在芯片的(S)上，依次以10μL/min的流速分别冲洗0.61μM的Ace-8-Mal溶液、5.48的Ace-8-Mal溶液、0.61μM的5.3-Mal溶液、5.48μM的5.3-Mal溶液60μL，(R)上只继续冲洗PBS。此时，相当于(S)和(R)之差(D)的传感图为图5。另外，在同一图里，Ace-8-Mal表示为Ace-Mal，5.3-Mal表示为Bio-Mal。
如图5所示，从SPR测定结果上看，含有生物素的5.3-Mal特异地被固定在芯片上，不含生物素的Ace-8-Mal完全没有被固定。因此，用生物素接头集合糖分子的化合物(配位体)通过生物素-亲和素(NeutrAvidin)的键可以特异地固定在芯片上。
(5-3配位体导入芯片所含有的糖分子和植物凝血素之间的相互作用)在上述(5-1)得到的配位体导入芯片上以20μL/min的流速冲洗0.61μL各种浓度的蛋白质的PBS溶液，根据SPR测定，观察配位体导入芯片和蛋白质之间的键以及解离动向。
另外，所用的蛋白质如下所述*)BSA(SIGMAALUBMUN，BOVINE)*)ConcanavalinA(伴刀豆球蛋白A，SEIKAGAKU KOGYO)*)Pee Lectin(豌豆植物凝血素，SEIKAGAKU KOGYO)*)Peanut Lectin(花生植物凝血素，SEIKAGAKU KOGYO)*)RCA120(蓖麻豆植物凝血素，SEIKAGAKU KOGYO)另外，导入上述蛋白质的配位体导入芯片，在该配位体导入芯片表面上，以60μL/min的流速冲洗60μL 10mM氢氧化钠水溶液由此解离再生，再利用。该操作在传感图中冲洗达到植物凝血素之前的应答单元值(Response(RU；Response Unit))之前反复进行1-3次。
首先，在上述(5-1)中得到的含有5.3-Mal和8-Glc的配位体导入芯片上，研究与Con A的相互作用。首先，与上述(5-1)一样，把NeutrAvidin固定在芯片上，得到亲和素附加芯片。此时NeutrAvidin的固定量(S)为5470RU，(R)为4380RU。然后，在亲和素附加芯片的(S)上固定5.3-Mal，在(R)上固定8-Glc，得到配位体导入芯片。另外，配位体的固定量(S)为390RU，(R)为390RU。
在这样制作的配位体导入芯片上以10μL/min的流速冲洗60μL0.1MconA溶液。此时，观察到的(S)、(R)以及两者之差的(D)共振角度变化图示于图6。如图6所示，若冲洗ConA溶液，配位体导入芯片上的配位体和Con A结合，(S)、(R)的共振角度都增大了。接着，冲洗与结合无关的ConA溶液以10μL/min的流速冲洗约1000秒PBS之后，又以60μL/min的流速冲洗60μL 10mM氢氧化钠水溶液，解离与配位体结合的Con A。观察到随着解离的进行共振角度急剧降低，共振角度与冲洗ConA之前的基础线保持一致并达到一定水平时，可知Con A完全被解离了。在同一图的(D)中，与表示结合、解离的代表性SPR传感图相同。即，在该体系里可以观测到Con A和吡喃葡萄糖之间的特异性相互作用。
进一步地，使各种浓度的Con A作用于上述配位体导入芯片SPR测定相互作用。此外，关于与BSA，及与PSA的相互作用进行SPR测定也观测到共振角的变化。
从以上结果可知，即，如下合成的依生物素接头集合糖分子的配位体可以固定在使亲和素(NeutrAvidin)固定的芯片上。此外，还可以分析Con A和吡喃葡萄糖之间的特异性相互作用。
此外，根据利用配位体导入芯片的[2通道分析法]得出的结论是，可以消除与蛋白质之间的非特异性相互作用。还有，与ConA同样，作为吡喃葡萄糖识别植物凝血素的PSA非特异地相互作用，可知，即使是具有糖识别能力的植物凝血素固定在芯片上的糖分子存在结合上的差异。
此外，制作本发明的4-Mal及4-Glc，和比较例的2-Mal及2-Glc所固定的配位体导入芯片，在其上，冲洗各种浓度的ConA，BSA，PSA，RCA120，PNA，SPR测定观察共振角度变化。
关于糖分子集合程度与植物凝血素之间的相互作用而产生的差异，其结果示于表1。

KD(Ka/Kd)解离常数，Ka结合速度常数，Kd解离速度常数表1表示解离常数(KD)的数值越小分子间的结合越大。通过表1的比较可知，针对相同分析物的解离常数，4个单元的糖分子集合的体系是2个单元体系的约2/3。即，通过更多地集合糖确认了与ConA结合得更紧密。
为了更进一步地详细地研究，如比较Con A和配位体之间的结合速度常数(Ka)、解离速度常数(Kd)可知，即，虽然两者结合速度没有差别，但解离速度有4个糖分子的配位体约为2个单元的1/2，她们之间的差异较大。也就是说，在具有4个单元的糖分子配位体中，结合的Con A处于很难解离的状态。若增加集合化的糖分子数结合速度没有发现变化，但一次结合了Con A解离之后增加再结合的机会使解离速度降低，受其影响，解离常数值变小。从该结果可以确认，本发明的接头化合物集合糖分子因群集效应增强了与相互作用分子的结合。
接着，改变糖分子，分析半乳糖和识别半乳糖的植物凝血素之间的相互作用。该分析使用了配位体导入芯片，该配位体导入芯片是把在上述(5-1)得到的仅末端是否有半乳糖差异的4-Mal和4-Glc固定在NeutrAvidin芯片上的。使用浓度不同的RCA120，还有PNA再与上述相同进行SPR测定。此外，在4-Lac和4-Glc的配位体导入芯片上，加入各种浓度的Con A，BSA，PSA，RCA120，PNA溶液进行SPR测定，观察共振角的变化(D)。从这些观测结果可知，如采用集合乳糖的配位体，可以分析半乳糖和半乳糖结合的植物凝血素RCA120及PNA之间的特异性相互作用。
以上所得结果如下。
1)利用本研究合成的接头集合糖分子制得的配位体，根据生物素-亲和素(NeutrAvidin)的键可以将其固定在SPR传感片上。
2)在采用被称为“2通道分析法”的方法中，除了末端糖分子以外，对照的配位体具有相同的结构，将SPR测定中最大的问题非特异性相互作用相抵消，并可以检测出糖和蛋白质之间的特异性作用。
3)通过使用使集合度不同的固定糖配位体的糖芯片，可以观察到因群集效应而带来的糖分子和植物凝血素之间的强烈结合。
如上述，本发明接头化合物集合糖分子得到集合物(配位体导入芯片)最适合于SPR测定中的植物凝血素和糖分子之间的相互作用的分析。
(6-1亲和柱的制作)利用实施例4合成的配位体制作亲和柱。
按照一般制作亲和柱的方法，制作并固定实施例4中得到的配位体4-Mal的亲和柱。柱载体采用Amershan公司生产的Hitrap NHS-activated Hp(柱体积1mL)。其适用于在凝胶基质上通过间隔把N-羟基琥珀酰亚胺作为活性基而固定(每1mL凝胶，有10mmol的NHS基)，含有氨基化合物被固定在载体上。亲和柱的制作流程概况如图6所示。
注入到柱上的溶液使用与柱连接的1mL或5mL的注射器(商品名テルモシリンジ、伽马射线消毒完毕的1mL，5mL)，手工操作使从柱的下端流出的溶液以每秒1滴的速度进行。此外，全部的溶液都是用针筒式滤器过滤的(Millex-GS Syringe Drive Filter Unut 0.22μm)。制备下列1-3溶液的缓冲液。
1)NeutrAvidin偶联缓冲液(含0.5M氯化钠的10mM乙酸钠水溶液pH5.5)
2)封闭缓冲液(含0.5M氯化钠的0.5M乙醇胺水溶液pH8.3)3)洗涤缓冲液(含0.5M氯化钠的0.1M乙酸钠水溶液pH4.0)把N-羟基琥珀酰亚胺固定在凝胶上而形成的凝胶载体，其中填充的活性化柱(Amershan公司生产的Hitrap NHS-activated Hp)1mL，向柱子中过冷盐酸(1mM)1mL，把填充的异丙醇除去，然后立刻，过2.0mg/mLNeutrAvidin偶联缓冲溶液，栓塞密封，室温下放置30分钟。接着过封闭缓冲溶液6mL，室温下放置30分钟后，依次过洗涤缓冲溶液6mL、封闭缓冲溶液6mL，PBS 6mL。然后，再过1mL的0.5mg/mL配位体(4-Mal)PBS溶液，栓塞密封，室温下放置30分钟。然后，过PBS 5mL将多余的配位体冲洗掉。
(6-2亲和性色谱法)用上述(6-1)中的亲和柱，使与配位体相互作用的蛋白质和，没有相互作用的蛋白质分离，另外，所用的蛋白质有下列3种。
*)BSA(SIGMA ALUBMUN，BOVINE)*)Concanavalin A(ConA，SEIKAGAKU KOGYO)*)Pee Lectin(PSA，SEIKAGAKU KOGYO)从实施例5(5-3)SPR测定的结果可知，ConA强烈地与4-Mal结合，通过氢氧化钠水溶液才能解离。此外，PSA和BSA不存在特异性的相互作用。
由上述可以推测，如将这些蛋白质的混合溶液通过亲和柱，只有ConA与4-Mal结合，附着在柱上，除此以外都白白地流掉析出。被保存的ConA可能通过含有氢氧化钠的PBS溶液通过亲和柱而被析出。或者也可能以葡萄糖溶液作为结合抑制剂通过亲和柱被析出。另外，该亲和层析的步骤如图7所示。
首先，过一下(6-1)制作的亲和柱，也就是说，将各种蛋白质的最后浓度均调整为1mM的蛋白质混合PBS溶液1mL，栓塞密封，室温下放置5分钟。
然后，过5mL的PBS溶液把流出液每1mL收集(作为Mix-1.2.3.4.5)。然后作为解离剂依次每5mL过0.1mM、1.0mM、10mM、1M葡萄糖PBS溶液，每1mL收集各自的流出液(依次地作为0.1Glc-1～5，1Glc-1～5，10Glc-1～5，1000Glc-1～5)。过PBS 5mL洗涤亲和柱后，过10mM的氢氧化钠PBS溶液5mL，每1mL收集流出液(作为NaOH-1.2.3.4.5)。
(6-3·蛋白质的鉴定)根据上述(6-2)的亲和层析技术，把收集的级分用紫外分光光度计测定280nm的吸光度，把被确认为吸收的级分上柱SD-PAGE，如下所述。
先制备下列溶液。再把所有的溶液用针筒式滤器过滤的(Millex-GSSyringe Drive Filter Unut 0.22μm)。
*)0.5M Tris-HCl缓冲液pH6.8*)电泳槽用缓冲溶液(ナカライテスク製造，用于电泳缓冲液)*)标样调整用缓冲溶液(SDS 0.3mg，2-巯基乙醇0.3mL，甘油6mL，50mM Tris-HCl缓冲溶液3mL，离子交换水1mL)*)标记色素溶液(溴酚蓝1mg，甘油0.1mL，离子交换水1mL)*)クマ ジ一亮蓝(クマジ一ブリリアントブル一)染色溶液(ナカライテスク生产的快速染色剂CBB试剂盒使用)冻干收集的级分1mL后，加入100μL的离子交换水再次溶解。混合20μL的该溶液和标样调整用缓冲溶液10μL，95℃下加热10分钟调整标样溶液。在填充了电泳用缓冲溶液的电泳槽里装上现成的凝胶(ATTOPAGEL-Compact AE-6000(SDS含12.5％))，每个泳道上滴上标记色素溶液1μL和，变性的标样溶液10μL，以20mA的电流进行电泳。同时把Prestainedprotein maeker.Low range(ナカライテスク生产)作为标准开始电泳。电泳结束后，取下凝胶，浸入到クマジ一亮蓝染色溶液中，室温下50分钟震荡(New Brunswick Scientfic公司生产Bio Dancer使用)。震荡后用离子交换水洗涤凝胶，再浸入到60℃的离子交换水中脱色。把脱色的凝胶干燥保存。
具体地使用12.5％的丙烯酰胺凝胶(ATTO PAGEL-Compact AE-6000)实施SDS-PAGE，根据クマジ一亮蓝染色。其结果如图8。如图8所示，在Mix-2中级分观察到Con A、PSA、BSA 3条带，它们被析出。在Mix-3中，BSA和PSA带消失，只有Con A带出现。在以后的级分里，没有观察到BSA和PSA带，在Mix-4，Mix-5，10Glc-1，NaOH-2的任一级分中，都看到了ConA带。从这些结果来看，可清楚地了解了下面2个事实。
(1)BSA和PSA都没有过柱。(由于过量的蛋白质原本被吸附的ConA的一部分也被析出，所以在Mix-2中都能看到3种蛋白质)。
(2)大部分的ConA与载体上的4-Mal结合并吸附在柱上，用解离剂从柱上析出。
从以上结果可知，使用4-Mal固定的亲和柱，从Con A和PSA和BSA的混合溶液中只能选择性地分离Con A。
另外，在本发明具体实施方式
中，没有举例说明的实施方式或实施例均作为理解本发明的技术内容，仅仅限定在上述的具体实施例不应狭义地解释，本发明的精神和所附的权利要求书均可以作各种变换实施本发明。
工业上的利用本发明的接头化合物如上所述，可导入4个单元以上的糖分子的部位包含4个芳香族氨基。此外，与糖分子特异地相互作用的蛋白质进行检测或分离时所使用的蛋白质分析用的支持物可结合的部位包括生物素部位或亚氨基生物素部位。还有，所述的接头化合物可以几乎不受与蛋白质之间的非特异性相互作用的影响。
再者，本发明的配位替是将糖分子导入所述接头化合物而形成的。
因此，本发明利用接头化合物或配位体，检测生物分子的相互作用，从而可以用于生物技术产业方面。尤其是，可以用于在利用芯片技术或亲和色谱技术的领域。此外，还可以用于生物探头或生物传感器的领域，进一步还应用于制药领域或诊断·检查等的医疗技术方面。
权利要求
1.一种多用途型接头化合物，其特征在于，具有通式(1)表示的结构 其中，Y具有O或NH表示的结构，上述X包括由4个链所构成的多个部位的结构，所述4个链在末端具有芳香族氨基且在主链也可具有碳-氮键的烃衍生链。
2.如权利要求1所述的多用途型接头化合物，其特征在于，上述X包括通式(2)表示的结构 其中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自独立地为1-6的整数。
3.如权利要求2所述的多用途型接头化合物，其特征在于，在上述通式(2)中，包括m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4均用2表示的结构。
4.一种配位体，由在权利要求1至3中任一项所述多用途型接头化合物的芳香族氨基导入糖分子而形成的。
5.如权利要求4所述的配位体，其特征在于，所述糖分子为单糖类、寡糖类、多糖类中的任一种。
6.一种配位体，其特征在于，包括通式(3)所示的结构 其中，Y具有O或NH表示的结构，R1，R2，R3，R4为各自独立地表示H-或 的结构，R6，R7，R8，R9，R10的结构选自HO-或 或者 表示的结构所构成组群的结构，其中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自独立为1-6的整数。
7.一种配位体，其特征在于，包括通式(4)所示的结构 其中，Y具有O或NH表示的结构，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自独立地为1-6的整数。
8.一种多用途型接头化合物的制造方法，其特征在于，包括以下步骤生物素类化合物和，与芳香族氨基末端用保护基团保护的4个分支链的化合物进行缩合反应步骤；去掉上述芳香族氨基末端的保护基的去保护步骤。
9.一种配位体的制造方法，其特征在于，用权利要求1至3中任一项所述的多用途型接头化合物和糖分子进行还原氨基反应。
10.一种糖分子的导入方法，该方法是把糖分子排列在支持物表面上的糖分子导入法，其特征在于，使含有权利要求4至7中任一项所述配位体的溶液与，表面上链霉亲和素或亲和素所固定的载体接触。
11.一种配位体的载体，其特征在于，把权利要求4至7中任一项所述的配位体，通过生物素-亲和素键固定在支持物表面上而形成，其中所述的键为生物素部位或亚氨生物素部位与链霉亲和素或亲和素之间的键。
12.权利要求11所述的配位体载体，其特征在于，链霉亲和素或亲和素固定于上述支持物上。
13.如权利要求11或12所述的配位体载体，其特征在于，将配位体载体用作表面等离子体振子共振测定用的传感片。
14.如权利要求11或12所述的配位体载体，其特征在于，将配位体载体用作亲和层析用的亲和柱。
15.一种表面等离子体振子的测定方法，该方法是使用糖分子固定在载体表面上的传感片，检测的糖分子相互作用的方法，其特征在于，使用末端结构不同的导入的糖分子所构成的至少2个传感片，上述至少2个传感片包含第1糖分子被固定在支持物表面上形成的第1传感片和，与上述第1糖分子末端结构不同的第2糖分子被固定在支持物表面上形成的第2传感片，用第1传感片得出的检测结果和，用第2传感片得出的检测结果，测定两者之差。
16.如权利要求15所述的表面等离子体振子的测定方法，其特征在于，用权利要求1或3项所述的相同结构的接头化合物在上述传感片上固定糖分子。
17.如权利要求15或16所述的表面等离子体振子的测定方法，其特征在于，在上述传感片固定大致相同数量的糖分子。
全文摘要
多用途型接头化合物，包括通式(1)表示的结构其中，Y具有O或NH表示的结构。上述X包括由4个链形成的多分支部位的构造，所述4个链是在末端具有芳香族氨基且在主链上具有碳－氮键的烃衍生链。所述多用途型接头化合物在蛋白质分析用的支持物表面上很好地再现糖分子二维排列。此外，配位体由所述的多用途型接头化合物导入糖分子而形成的。
文档编号G01N33/531GK1681825SQ0382130
公开日2005年10月12日 申请日期2003年8月6日 优先权日2002年9月9日
发明者隅田泰生, 荒野明男, 林秀树, 楠本正一, 迈克尔·索贝尔 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 国立大学法人鹿儿岛大学