专利名称:一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，属于免疫检测【技术领域】。该试纸条由PVC底板、样品垫、涂覆金标标记群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体（3D2）的金标垫、在检测线包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体（4D11）和在质控线包被有羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、及吸水垫构成。该试纸条操作简便、快速、准确，全过程只需5min，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度高，对水稻白叶枯病菌最低检测限为1×104cfu/mL，对水稻细菌性条斑病菌最低检测限为1×105cfu/mL。本实用新型适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现粮食或种子样本中该病菌的快速检测。
【专利说明】一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及了一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，可以同时实现对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的快速检测，适用于大量样品的现场检测、进出口粮食的快速检测与应急处理，属于免疫检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]水稻白叶枯病菌(Xan thomonas oryzae p v.0ryzae)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.是黄单胞菌属水稻黄单胞菌的不同致病变种。水稻白叶枯病是一种世界性病害，以亚洲稻区发生为重，水稻细菌性条斑病的危害仅次于水稻白叶枯病，主要发生在我国南部地区，是国内重要的检疫性病害。这两种病害同时也被许多国家列为检疫性有害生物，限制从这两种病害的的疫区进口水稻种子及稻米。因此，发展一种灵敏专化、准确便捷的同时可从水稻上检测这两种细菌的检疫技术对国内植物检疫及我国水稻种子及稻米的出口均有重要意义。
[0003]对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的检测诊断方法包括野外观察、生理生化鉴定、免疫学检测和鉴定、以及PCR检测技术，环介导等温扩增(LAMP)技术和生物传感技术也被用来检测。但生化检测技术耗时过长，且检测结果存在不可靠性。PCR检测技术相比具有很好的灵敏性与准确性，但由于依赖于昂贵的仪器和专业的检测人员，不适用于大量产品的快速检测。ELISA检测技术在检测灵敏度上虽然不如PCR方法，但是具有检测快速、批量、便宜的优势。而胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点
[0004]由于水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌会对农业带来巨大威胁与损失，因此快速准确的检测方法显得尤为重要。
实用新型内容
[0005]本实用新型目的在于提供一种检测水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉。
[0006]本实用新型适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现大量粮食或种子样本中水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的快速检测。
[0007]本实用新型的技术方案，一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；
[0008]在PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有金标垫；所述金标垫一端与样品垫相连接叠放，金标垫另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上；
[0009]所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。
[0010]所述金标垫上包被有金标标记群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(3D2)；
[0011]所述检测线上包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(4D11)；
[0012]所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。
[0013]所述水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，步骤如下:
[0014](I)抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的单克隆抗体的制备
[0015]单克隆抗体是采用水稻白叶枯病菌(NCPPB3002，来自湖南省进出口检验检疫局)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免，I X 18Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，IX 18Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，IX 17 cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，分别挑选对水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，I X 17Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB3002菌体/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选到10个细胞株；
[0016](2)群选性单克隆抗体的配对筛选
[0017]将步骤(I)中纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，确定群选性免疫胶体金快速检测试纸条所需要的抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的群选性抗体；其中3D2为金标抗体，4D11为包被抗体；
[0018](3)水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
[0019]a、空白胶体金的制备:
[0020]采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 1%朽1檬酸钠,继续加热15~20min,至呈亮红色,然后室温中冷却，4 C冷减保存；
[0021]b、胶体金标记抗体的制备:
[0022]空白胶体金溶液用0.1M K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每HiL胶体金加入30 μ g抗体3D2，继续搅拌30 min,离心，吸取上清，用金标抗体保存液(0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液)重旋；
[0023]C、金标垫的制备:
[0024]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL标记好胶体金的抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(3D2)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6 μ L/cm,37°C烘干过夜，封袋备用；
[0025]d、包被膜的制备:
[0026]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(4D11)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠IgG抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量均为0.6μ L /cm，37°C烘干过夜，封袋备用。
[0027]将PVC底板、样品垫、金标垫、涂有检测线与质控线的硝酸纤维素膜检测层、和吸水垫组合，即得产品水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条。
[0028]其适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现粮食或种子样本中水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的快速检测，最低检测限分别为水稻白叶枯病菌为IXlO4cfu/mL和水稻细菌性条斑病菌IXlO5 cfu/mL。。
[0029]本实用新型试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌群选性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌。当待检样品中含有水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌时,抗原先和胶体金标记的群选性抗病菌抗体(3D2)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的群选性抗病菌抗体(4D11)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0030]与其他检测方法相比，免疫胶体金检测技术具有以下优点:1、迅速；2、灵敏度高；3、成本低廉；4、安全简便。
[0031]本实用新型与现有技术相比具有以下优点:
[0032]1.检测速度快，全过程只需要5 min即可，可以试验大批量样品的快速检测；
[0033]2.灵敏度高，最低检测限分别为I X 104cfu/mL和I X 105cfu/mL ；
[0034]3.操作简便，无需经过专业培训，易于推广；
[0035]4.不需要仪器，适合现场检测；
[0036]5.过程简单,直接上样检测,样本量少。
【附图说明】
[0037]图1本实用新型水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条结构示意图正视图；
[0038]图2本实用新型水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条结构示意图俯视图；
[0039]附图标记说明:1、PVC底板；2、硝酸纤维素膜检测层；3、样品垫；4、金标垫；5、检测线(T线)；6、质控线(C线)；7、吸水垫。
[0040]图3本实用新型水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条实物检测示意图；水稻白叶枯病菌(NCPPB 3002，来自湖南省进出口检验检疫局)
[0041]附图标记说明:1、2X106cfu/mL NCPPB 3002 菌体浓度；2、3.3 X 105cfu/mLNCPPB 3002 菌体浓度；3、lX105cfu/mL NCPPB 3002 菌体浓度；4、3.3X 104cfu/mL NCPPB3002菌体浓度；5、lX104cfu/mL NCPPB 3002菌体浓度；6、空白样。
[0042]图4本实用新型水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条实物检测示意图；水稻细菌性条斑病菌(NCPI3B 1585，来自湖南省进出口检验检疫局)
[0043]附图标记说明:1、1X107cfu/mL NCPPB 1585 菌体浓度；2、I X 106cfu/mL NCPPB1585 菌体浓度；3、5X105cfu/mL NCPPB 1585 菌体浓度；4、I X 105cfu/mL NCPPB 1585 菌体浓度；5、空白样。
【具体实施方式】
[0044]实施例1
[0045]如图1所示，一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板1，在PVC底板I两端分别设有样品垫3和吸水垫7 ；
[0046]在PVC底板I中部设有硝酸纤维素膜检测层2，在硝酸纤维素膜检测层2与样品垫3之间设有金标垫4 ;在金标垫4 一端与样品垫3相叠加,金标垫4另一端叠加在硝酸纤维素膜检测层2上；
[0047]在硝酸纤维素膜检测层2上按先后顺序设有检测线T线5和质控线C线6。
[0048]所述金标垫4上包被有金标标记群性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体3D2 ;所述检测线T线5上包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体4D11 ;所述质控线6上包被有羊抗鼠IgG。
[0049]实施例2
[0050]所述水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，其步骤是:
[0051](I)群选性的单克隆抗体的制备
[0052]采用水稻白叶枯病菌(NCPPB 3002，来自湖南省进出口检验检疫局)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免,IX 18Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，I X 18Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，I X 17 cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，分别挑选对水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，I X 17Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选到10个细胞株。
[0053](2)群选性单克隆抗体的配对筛选
[0054]将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，确定免疫胶体金快速检测试纸条所需要的抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的群选性抗病菌抗体；其中3D2为金标抗体，4D11为包被抗体；
[0055](3)水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
[0056]a.空白胶体金的制备:
[0057]采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 1%朽1檬酸钠,继续加热15~20min,至呈亮红色,然后室温中冷却，4 C冷减保存；
[0058]b.胶体金标记抗体的制备:
[0059]空白胶体金溶液用0.1M K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每mL胶体金加入30 μ g抗体(3D2),继续搅拌30 min,离心,吸取上清,用金标抗体保存液(0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液)重旋；
[0060]c.金标垫的制备:
[0061]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL标记好胶体金的群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(3D2)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6 μ L/cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用；
[0062]d.包被膜的制备:
[0063]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(4D11)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠IgG抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量均为0.6μ L /cm，37°C烘干过夜，封袋备用。
[0064]将PVC底板、样品垫、金标垫、涂有检测线与质控线硝的酸纤维素膜检测层、和吸水垫组合，即得产品水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条。
[0065]本实用新型试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌群选性特异性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌。当待检样品中含有水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌时，抗原先和胶体金标记的群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(3D2)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(4D11)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0066]检测时按如下步骤处理检测样品:取1g种子，先用蒸馏水冲洗以除去残片和表面污染杂菌，后放入0.001%吐温-磷酸缓冲液中低温(5°C ~ 15°C)浸泡4 h ~ 6 h，用均质器打碎，制备样品提取液。提取液于22°C ~ 25°C环境中放置4 h ~ 6 h，旋窝混匀悬浮液5min,进行检测。
[0067]检测时如样品为阴性，则试纸条只有质控线C线显色(图3中6号，图4中5号)；如果样品为阳性，及水稻白叶枯病菌浓度大于IX 104cfu/mL和/或水稻细菌性条斑病菌浓度大于I X 105cfu/mL,则试纸条质控线C线，检测线T线均显色。如果试纸条C线不显色，则说明试纸条质量出现问题。
【权利要求】
1.一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:在PVC底板(I)两端分别设有样品垫(3)和吸水垫(7)； 在PVC底板(I)中部设有包含检测线(5)和质控线(6)的硝酸纤维素膜检测层(2)，在硝酸纤维素膜检测层(2 )上依次设有包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体4D11的检测线(5)和包被有羊抗鼠IgG的质控线(6)； 在硝酸纤维素膜检测层(2)与样品垫(3)之间设有包被有金标标记群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体3D2的金标垫(4);金标垫(4)一端与样品垫(3)相叠加，金标垫(4)另一端叠放在硝酸纤维素膜检测层(2)上。
【文档编号】G01N33-558GK204287191SQ201420718740
【发明者】徐丽广, 孔德昭, 胥传来, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 [申请人]江南大学