专利名称：一种生物层析凝胶及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生化技术领域，特别涉及一种生物层析凝胶及其生产工艺。
背景技术：
生物层析凝胶是生物物质纯化分离所必需的试剂，它起到离子交换作用，已经在生化领域得到了广泛应用。随着生物制药工业的蓬勃发展，生物层析凝胶的需求量越来越大，对规格型号的要求也越来越多。特别对于基因工程所制备的蛋白类药物，其表达产物中混有较多的杂蛋白，而层析法是惟一可纯化基因工程药物的方法，因此更是离不开生物层析凝胶。
目前生物层析用的凝胶常用葡聚糖、琼脂糖、DEAE纤维素作为载体，如Pharmacia公司产品Sepharose CL-4B，Sepharose CL-6B等。但以琼脂糖作为载体存在着许多缺点，如价格昂贵，合成再生较复杂，需要用剧毒的CNBr活化等。这种状况严重影响了生化分离技术的提高，直接制约了生物制药产业化进程。因此，寻找、研究和开发一种新型凝胶是十分必要且具有巨大社会经济效益的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的生物层析凝胶，以替代现有的生物层析凝胶，使它不仅具有现有生物层析凝胶的优点，而且还具有其它一些特有的优点，同时其产品原料来源广泛、产品成本低。
本发明的另一目的是提供该新型生物层析凝胶的生产工艺。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的本生物层析凝胶主要是由分子量在10万至12万之间的聚氨糖所组成。
本发明采用聚氨糖作为生物层析凝胶的主要原料，是考虑到聚氨糖在某些方面具有和琼脂糖类似的优点，如具有良好的生物相容性、表面基团丰富、pH值使用范围宽等。同时，作为层析凝胶载体，它还没有琼脂糖的某些缺点。
上述的生物层析凝胶的生产工艺如下1、将一定量的壳聚糖溶于酸性介质中，并进行降解，降解的时间不小于3小时；2、降解所得的聚氨糖滴于氢氧化钠溶液中，然后水洗至中性；3、水洗后的聚氨糖移到容器中，搅拌，同时滴加交联剂，充分交联；4、交联反应后，用还原剂还原；5、还原后水洗至中性，用60至200目的分样筛分样，得到生物层析凝胶。
通常，所得的生物层析凝胶保存于20％的乙醇中。
本生物层析凝胶是以壳聚糖为主要原料制备而成的多聚氨基葡萄糖凝胶，简称为聚氨糖凝胶。壳聚糖(chitosan)又名壳多糖、脱乙酰甲壳素、几丁聚糖、聚葡萄糖胺，广泛应用于医药保健、水处理、日化等行业。
本生产工艺是利用聚氨糖2位上游离的-NH2与戊二醛上的-CHO在弱酸介质中发生希夫式反应，然后用硼氢化钠还原，使之变成弱碱阴离子交换剂的。
在本生产工艺中，高分子量的聚氨糖的分子链是较长的，戊二醛不易和其发生交联，因此为提高合成生物层析凝胶的稳定性，必须对聚氨糖进行适度降解，再对其进行交联。较合适的降解时间为3至6小时。
在上述的生产工艺中，所述的交联剂可以是甲醛、戊二醛、乙二醛、乙二醇双环氧丙基醚中的一种。
在上述的生产工艺中，利用戊二醛对壳聚糖进行交联后，戊二醛中的两个醛基只有一个参加了反应，还有一个醛基没有参加反应。
在上述的生产工艺中，还原剂最好是采用硼氢化钠。加入还原剂的作用在于1、制备的生物层析凝胶颜色由黄色变为乳白色；2、由于其结构中含有醛基结构，在紫外有吸收峰，因此加入还原剂可以防止对蛋白质的检测产生影响。
在上述的生产工艺中，交联的时间是一个比较重要的因素。交联时间不足，影响凝胶的酸性pH稳定性和机械强度，浪费原料；交联时间过长，易发生一些负反应，影响凝胶的吸附容量。通常，较合适的交联时间是在4～10小时之间。
在室温下，最佳的交联时间是在6～8小时之间。
在上述的生产工艺中，所述的交联反应应在搅拌的条件下进行。
在上述的生产工艺中，所述的反应介质可以是水、乙醇、乙醚或者石油醚中的一种。反应介质对产物的吸附性能影响不明显，石油醚、乙醚和水不互溶，但在石油醚和乙醚中不易分散水洗后的聚氨糖，交联后洗涤也较麻烦，故最好是选择水为反应介质。
在上述的生产工艺中，所述的氢氧化钠溶液的浓度范围为0.3％～3％。其中最佳的浓度范围为1％～2％。选择合适的浓度，将有利于聚氨糖的析出，且使其析出量较多。
亲和层析是蛋白质和酶纯化效率最高的分离技术。常用的层析介质如珠状葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶一般容易压缩，不易用于高压液相色谱；而用改性的硅胶具有刚性，但硅胶颗粒改性比较困难，而且生物亲和性较差。比较起来，本发明所采用的聚氨糖既有刚性，又有亲水性和抗菌性，完全可用于蛋白质、酶的吸附分离。
聚氨糖对血浆低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白有很好的吸附性，可应用于高脂血症患者的血液灌流。聚氨糖对胆固醇甘油三脂均有明显的吸附作用，而且随着脱乙酰度的提高而吸附率增大。
由丁二醇二缩水甘油醚交联的珠状高脱乙酰度聚氨糖或戊二醛交联的珠状高脱乙酰度聚氨糖吸附那些会引起自体免疫扰乱、变态反应和肿瘤等相关的免疫球蛋白，已用于临床，由苯丙氨酸和色氨酸固定化修饰的珠状聚氨糖选择地吸附免疫蛋白，这种修饰的聚氨糖比不修饰的聚氨糖对α-球蛋白的亲和性更高，而且对纤维蛋白的吸附量降低，还能降低血小板粘附性，对血液灌流是优良的吸附剂。
交联羧甲基聚氨糖具有两性离子交换能力，对含糖类的白蛋白或γ-球蛋白水溶液，不吸附糖类，却能吸附蛋白。以磷酸盐缓冲溶液为溶剂时，分别能吸附9.4mg/g白蛋白或58.4mg/gγ-球蛋白。改变溶剂的离子强度，还可以从γ-球蛋白中分离白蛋白，或从牛血清蛋白中分离出白蛋白。
在分离纯化酶方面，聚氨糖分离纯化溶菌酶、淀粉葡萄糖苷酶、纤维素酶等多种酶具有很好的效果。这些酶的作用底物在结构上与聚氨糖相似，在吸附过程中聚氨糖能牢固地吸附这些酶，有的还形成固定组成的络合物。
聚氨糖吸附淀粉糖苷酶的量比其他凝胶吸附剂的吸附量大得多，且pH值在4.0～4.5时有最大吸附量。珠状聚氨糖也强烈地吸附α-淀粉酶和乳糖酶，最佳pH值在6.0附近，吸附α-淀粉酶的最大吸附量达286mg/ml凝胶，用低离子强度的缓冲液就可洗脱。
用珠状的羧甲基聚氨糖直接对鸡卵蛋白进行亲和层析，然后以0.1mol/L乙酸洗脱，可获得高纯度的溶菌酶。
聚氨糖经戊二醛交联后，对蛋白质的吸附量都有下降，但对β-糖苷酶、α-淀粉酶碱性淀粉酶酸性淀粉酶和大豆胰淀粉酶抑制剂的吸附量反而增大，在2.4mol/L(NH4)2SO4溶液中，碱性磷酸酶的吸附率达99％，经50％乙二醇洗脱时，酶可定量回收，酶的纯度提高4.5倍，比活率达4.70un/mg。用聚氨糖纯化过的纤维素酶水解纤维素时，可使溶液中的纤维二糖含量由42％提高到95％。
本发明可将我国盛产的壳聚糖加工为高附加值的生物层析凝胶产品，其产品成本较低、应用面很广，具有较高的实用价值。
具体实施例方式
取2％(w/v)的壳聚糖先降解4小时，滴于浓度为2％的氢氧化钠溶液中析出，水洗至中性；然后移至三口瓶中，滴加0.6％的戊二醛溶液，同时搅拌交联6个小时；加入硼氢化钠使游离的醛基充分封闭，用分样筛水洗，得到60目～200目纯白色的生物层析凝胶。
在本实施例中，所述的交联剂采用戊二醛。戊二醛的浓度通常在0.5％～2.5％之间。在一定离子强度的磷酸缓冲液中，随着戊二醛浓度的提高，凝胶的交联度上升，其吸附能力将逐步下降。这是由于戊二醛用量过大时占用壳聚糖分子上过多氨基、使得参与吸附作用的氨基减少所造成的。而我们希望合成的层析凝胶具有较大的离子交换功能，交联仅是增加生物层析凝胶的机械强度及稳定性，因此交联剂用量应在保证凝胶稳定性的前提下尽可能的少。经实验表明，戊二醛最佳的浓度为0.6％。
本实施例所合成的生物层析凝胶外观为纯白色纤维状。
本生物层析凝胶对一般有机溶剂都很稳定，尤其在pH值为1.5的酸性条件下，凝胶不发生溶解，达到良好的稳定性，这一点明显优于DEAE纤维素。具体的稳定性试验结果见表1所示。
表1 聚氨糖生物层析凝胶稳定性试验结果
注“-”表示不溶，在室温下试验。
本实施例所得的生物层析凝胶装柱，上样，洗脱，分别接收洗脱组分，测定各组分的酶(中性蛋白酶)和蛋白含量(牛血清蛋白)，并与DEAE纤维素层析作比较，结果见表2、表3、表4和表5。
表2 聚氨糖层析凝胶对中性蛋白酶的分离
注以水为平衡液，三羟甲基氨基甲烷—盐酸(pH＝9)的缓冲液洗脱。
表3 DEAE纤维素层析分离中性蛋白酶的结果
注以水为平衡液，三羟甲基氨基甲烷—盐酸(pH＝9)的缓冲液洗脱表4 聚氨糖凝胶对牛血清蛋白层析分离
注以水为平衡液，三羟甲基氨基甲烷—盐酸(pH＝9)的缓冲液洗脱表5 DEAE纤维素对牛血清蛋白层析分离结果
由表2和表3可知，合成的聚氨糖层析凝胶对中性蛋白酶进行纯化，可以得到较好的纯化效果，酶活回收率达90.66％，酶活主要存在峰1、峰3，酶活损失较少，另外峰2、峰4也有少量的酶活。由表4和表5可知，在同一条件下，聚氨糖层析凝胶和DEAE纤维素对牛血清蛋白的吸附性能实验表明，聚氨糖层析凝胶性能稍优。通过两组实验的对比，可以得出以下结论1、合成的聚氨糖层析凝胶和DEAE纤维素对中性蛋白酶、牛血清蛋白的吸附状况相似，对牛血清蛋白的回收率甚至比DEAE纤维素高，分离效果稍优；2、合成的聚氨糖层析凝胶对酶的生物亲和性良好，优于DEAE纤维素，一次层析活性保持率大于90％。
因此，聚氨糖在某些方面具有和琼脂糖类似的优点，如具有良好的生物相容性、表面基团丰富、pH值适用范围宽等，作为层析凝胶材料是完全可行的。
权利要求
1.一种生物层析凝胶，其特征在于该生物层析凝胶主要是由分子量在10万至12万之间的聚氨糖所组成。
2.一种如权利要求1所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于该生产工艺如下(1)、将一定量的壳聚糖溶于酸性介质中，并进行降解，降解的时间不小于3小时；(2)、降解所得的聚氨糖滴于氢氧化钠溶液中，然后水洗至中性；(3)、水洗后的聚氨糖移到容器中，搅拌，同时滴加交联剂，充分交联；(4)、交联反应后，用还原剂还原；(5)、还原后水洗至中性，用60目至200目的分样筛分样，得到生物层析凝胶。
3.根据权利要求2所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于所述的降解时间为3至6小时。
4.根据权利要求2所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于所述的交联剂是甲醛、戊二醛、乙二醛、乙二醇双环氧丙基醚中的一种。
5.根据权利要求2所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于所述的还原剂是硼氢化钠。
6.根据权利要求2所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于较合适的交联时间是在4～10小时之间。
7.根据权利要求6所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于最佳的交联时间是在6～8小时之间。
8.根据权利要求2所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于所述的反应介质是水、乙醇、乙醚或者石油醚中的一种。
9.根据权利要求2所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于所述的氢氧化钠溶液的浓度范围为0.3％～3％。
10.根据权利要求9所述的生物层析凝胶的生产工艺，其特征在于所述的氢氧化钠溶液的最佳浓度范围为1％～2％。
全文摘要
本发明提供的一种生物层析凝胶及其生产工艺属于生化技术领域。它解决了现有的生物层析用凝胶所存在的价格昂贵、合成再生较复杂等缺点。本生物层析凝胶主要是由分子量在10万至12万之间的聚氨糖所组成，其生产工艺是将一定量的壳聚糖溶于酸性介质中，并进行降解，降解的时间不小于3小时；降解所得的聚氨糖滴于氢氧化钠溶液中，然后水洗至中性；水洗后的聚氨糖移到容器中，搅拌，同时滴加交联剂，充分交联；交联反应后，用还原剂还原；还原后水洗至中性，用60至200目的分样筛分样，得到生物层析凝胶。本发明采用聚氨糖作为生物层析凝胶的主要原料，具有良好的生物相容性、表面基团丰富、pH值使用范围宽等优点。
文档编号G01N30/00GK1540340SQ20031010821
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月25日 优先权日2003年10月25日
发明者钱俊青, 徐君义, 林荣业 申请人:玉环县海洋生物化学有限公司