专利名称：Sars冠状病毒结构蛋白orf3及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及SARS冠状病毒(SARS-CoV)的结构蛋白及其应用。具体地，本发明涉及一种新的SARS病毒结构蛋白ORF3及其片段，以及抗ORF3蛋白或其片段的抗体。
背景技术：
WHO于2003年3月12日向全球发出了近10年来的首次传染病预警，该曾一度被称为非典型肺炎(atypical pneumonia)的传染病自2002年11月中旬首次在中国广东境内发现，它起病急，传染力强，抗生素治疗无效，截至5月10日18时，全世界已有33个国家和地区发现该病，累计患病人数7296人，死亡人数526人，死亡率达3-6％。
2003年4月16日世界卫生组织正式确认引起严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，以下简称SARS)的病原体为一种新型冠状病毒-SARS冠状病毒(以下简称SARS-CoV)。它是一种正链、单链RNA病毒(ssRNA positive-strand viruses，no DNA stage)，属套病毒目(orderNidovirales)、冠状病毒科(family Coronaviridae)、冠状病毒属(genusCoronavirus)、SARS冠状病毒(SARS coronavirus)。
电镜下，冠状病毒颗粒呈不规则形，直径约为60-220nm，有包膜，包膜上具有糖蛋白，其中一种长的包膜糖蛋白突起长度约为20nm，包膜内含有核衣壳。通常将包装到病毒颗粒中的病毒表达蛋白称为结构蛋白，但是有些非结构蛋白也能够插到病毒包膜中。一般认为结构蛋白质与病毒颗粒的形成与释放、以及宿主细胞的识别、宿主的感染和致病有关(S.G..Siddell，Ed.，TheCoronaviridae Plenum Press New York，1995)。序列分析表明SARS-CoV与已知冠状病毒一样同样存在结构蛋白复制酶(replicase)、S蛋白(spikeprotein)、E蛋白(envelope protein)、M蛋白(membrane protein)、N蛋白(nucleocapsid protein)，这些结构蛋白的氨基酸序列在结构和功能上与已知冠状病毒相似。其中SARS-CoV的E、M、N蛋白所包含的保守基因序列同样存在于其他冠状病毒中；S蛋白是冠状病毒的糖蛋白，位于病毒表面，负责参与受体细胞的受体结合以及膜融合，S蛋白的羧基末端由跨膜域和富含半胱氨酸残基的胞质尾区组成。S蛋白上还包含了重要的病毒中和表位，但是，由于SARS-CoY的S蛋白与其他冠状病毒S蛋白间的氨基酸序列差异，目前还不能够从中推知SARS-CoV的S蛋白的受体结合特异性或抗原表位的结构特征(Paul A.Rota et al’Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute Respeiratory Syndrome’Sciencexpress/1May 2003)。由于S基因的变异，其宿主范围、组织趋向及毒力都可能发生改变，因此，对于S蛋白及其共价复合物的研究将有助于理解S蛋白如何影响SARS的发病机制以及相关药物的开发研制。
加拿大多伦多基因组科学中心的研究小组于4月12日在网上发布了病毒全序列，SARS-CoV全基因组序列长约30kb，具有5’帽结构和3’polyA尾(Marco A.Marra et al’The Genome Sequence of the SARS-AssociatedCoronavirus’Sciencexpress/1May 2003)，来自加拿大的SARS-CoV分离株预测有14个开放阅读框(Rota PA，Oberste MS，The Genome sequence of theSARS-associated coronavirus.Science.2003 May 30；300(5624)1399-404.)。已知的结构蛋白复制酶、S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白的编码序列分别位于ORF1a和ORF1b、ORF2、ORF5、ORF6、ORF12(Rota PA，Oberste MS，The Genomesequence of the SARS-associated coronavirus.Science.2003 May30；300(5624)1399-404.)。一般说来，RNA病毒具有高遗传突变率的特征，这既是进化的需要也是RNA病毒用于逃避宿主防御的有效机制(Yijun Ruan etal)。基因序列分析表明SARS-CoV的基因组序列与已知的三种冠状病毒亚群序列截然不同，极有可能是独立进化而来，所以将其归为冠状病毒的一个新的分支。取自不同来源的14株SARS-CoV基因组序列比较结果显示总共有127个单核苷酸变异，其中94个改变了氨基酸残基(Yi jun Ruan et al)，但是这些差异对于SARS-CoV本身进化的意义以及对于不同株型是否在被感染的宿主个体间存在的各种差异上起到关键性的作用，目前还不可知。
现有SARS检测手段有3种，包括采用抗体检测的方法ELISA(IGM/IGA)方法可以可靠地检出出现临床症状20天后SARS病人血清中的病毒抗体。某些病人在14-21天时，已经可以检测到抗体；采用免疫荧光法检测可以检测出病毒感染VERO细胞10天后产生的M免疫球蛋白；采用分子检测方法已经发展了7对引物使用于检测过程中，检测中的阳性对照RNA可以从Bernhard-NochtInstitute in Hamburg，Germany免费获得。检测样品包括血液、粪便、呼吸道分泌物。PCR结果可以辅助临床诊断评价，但是不能肯定或排除疾病的可能；细胞培养方法利用VERO细胞来检测SARS病人的呼吸道分泌物和血液样品，阳性结果表示SARS病人感染了冠状病毒，阴性结果不表明病人不是SARS。但是这些检测手段还不能及时有效的作为检测诊断SARS的有效方法，一般都还需要结合临床症状等辅助手段综合判断。
目前，有效控制乃至消灭SARS对于人类生命的危害已经成为摆在全球科学家面前的重要课题。人们从发现病源到病原体的确认到基因组测序、序列分析也只有短短几个月的时间，尽管已经取得了一些进展，但目前人们对SARS冠状病毒知之甚少。为了获取更多有价值的线索，人们逐渐把更多的目光投向对病毒蛋白的分离、病毒蛋白的功能分析及其应用的研究上，人们迫切需要通过更多的途径寻找到更多的、有价值的SARS-CoV表达蛋白，进一步了解它们在病毒复制、发病机理方面的作用，提供有效的SARS冠状病毒的检测方法和试剂，促进SARS疫苗的研制和SARS新药的开发。目前，除了结构蛋白S、E、M、N被确认之外，目前，除了上述开放阅读框被确认编码SARS-CoV结构基因之外，还没有明确确认其他SARS-CoV结构基因并证实该结构基因的功能和活性特征的报道，尤其是定位在病毒表面的其他蛋白。
由于临床缺少有效SARS的治疗药物，所以现阶段将感染病人迅速隔离治疗是最有效的防治手段。为了开发SARS检测方法和治疗方法，本领域迫切需要开发新的SARS结构蛋白以及相关的诊断方法和试剂盒。
发明内容
本发明目的就是提供一种新的SARS结构蛋白及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种结构蛋白，该蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且定位在SARS病毒颗粒上具有免疫原性，可与S蛋白形成了链间二硫键共价复合物的由(a)衍生的多肽。
在在另一优选例中，该蛋白的分子量为31KD-34KD，它能够在非还原胶上与S蛋白形成链间二硫键共价复合物。
较佳地，所述蛋白含有SEQ ID NO1的氨基酸序列。更佳地所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体，所述的抗体特异性地与本发明上述的结构蛋白结合。更佳地，所述的抗体是单克隆抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种抗原性多肽，它具有SEQ ID NO1中连续的25-100氨基酸，且与本发明上述的特异性抗体特异性结合。在另一优选例中，所述多肽具有SEQ ID NO9的氨基酸序列。还提供了所述抗原性多肽的偶联物。
在本发明的第四方面，提供了一种检测试剂盒，它含有本发明上述的结构蛋白、上述的抗体、上述的多肽、或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的方法，包括步骤(a)将样品与选自下组的物质接触本发明上述的结构蛋白、上述的抗体、上述的多肽、或其组合；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体。
在另一优选例中，所述的样品为血清或痰液。
在另一优选例中，所述的物质是氨基酸序列为SEQ ID NO1的蛋白。
在另一优选例中，所述的物质是权利要求2所述的抗体，且所述抗体是单克隆抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种组合物，含有本发明上述的结构蛋白和药学上可接受的载体。
图1感染病毒24小时的细胞质中的蛋白质电泳图谱，第1泳道为分子量标准，从上到下依次为175kD，83kD，66kD，43kD，33kD，25kD，14kD和7kD。第2泳道为感染病毒24小时的细胞质中的蛋白质。
图2ORF3蛋白质N端7-19位肽段FFTLGSITAQPVK(SEQ ID NO3)的质谱碎片图。
图3ORF3蛋白质180-193位肽段LKEDYQIGGYSEDR(SEQ ID NO4)的质谱碎片图。
图4ORF3蛋白质C端236-274位肽段LVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAMDPIYDEPTTTTSVPL(SEQ ID NO5)的质谱碎片图。
图5蛋白质C端236-274位肽段LVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAM#DPIYDEPTTTTSVPL(SEQ ID NO6)的质谱碎片图。
其中M#为氧化的甲硫氨酸。
图6A为ORF3蛋白免疫印迹实验，在病毒感染的细胞(第2道)和分泌到细胞外的病毒(第3道)中都检测到ORF3蛋白，第1道以未感染病毒的细胞作为对照。B为S蛋白和ORF3蛋白的免疫印迹实验。左图为S蛋白的免疫印迹实验，在还原胶上(第1道)，可在180KD检测到S蛋白，而在非还原胶上(第2道)，可在180KD和210KD处同时检测到S蛋白。右图为ORF3蛋白的免疫印迹实验，在非还原胶210KD处也检测到了ORF3蛋白(第2道)，说明ORF3蛋白与S蛋白确实形成了链间二硫键共价复合物。
图7ORF3蛋白质金标免疫电镜观察和凝集反应，ORF3蛋白质在冠状病毒表面呈阳性反应，从而确认ORF3蛋白质定位在病毒表面，是一个结构蛋白质。
图8ORF3蛋白质抗体在病人血清中的检测，通过ELISA实验在病人血清中也检测到ORF3蛋白质抗体呈阳性反应。A图中采用SBP1多肽为检测探针；B图中采用SBP2多肽为检测探针；C图中采用S1多肽为检测探针；D图表示SBP2多肽和S1多肽对病人血清检测反应的相关性。
具体实施例方式
本发明人通过质谱分析SARS病毒的天然蛋白质，首次发现并分离了一种新的结构蛋白质。这个蛋白质属于ORF3(位于SARS冠状病毒基因组S基因和E基因之间)的基因产物。ORF3蛋白质也定位在病毒颗粒上，属于一种结构蛋白，它可能与识别宿主细胞和感染有关。在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一种新的SARS冠状病毒结构蛋白质，该蛋白质的分子量为31KD-34KD，它能够在非还原胶上与S蛋白形成链间二硫键共价复合物。所述结构蛋白质是指，包装到病毒颗粒中的病毒表达蛋白，特别是指ORF3的基因产物，它具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，该序列可以是通过基因工程技术而来也可以是人工合成而来。ORF3基因产物的分子量为31KD-34KD，暗示ORF3基因产物具有翻译后的修饰或不同形式的亚型(详见实施例3)。
由本发明所获得的ORF3基因产物通过液相色谱-电喷雾离子阱质谱鉴定，并由质谱测序证实了该蛋白质氨基酸序列(由SEQ ID NO1所示)。ORF3位于S和E基因之间，结构分析表明，ORF3蛋白具有三个跨膜区，蛋白的N端1-22位在膜外，C端160个氨基酸在膜内。C端209-264位还存在一个潜在的ATP酶活性位点。ORF3蛋白含有8个半胱氨酸，都位于C端的胞内区。该蛋白的N端22位有一个潜在的糖基化位点。在该蛋白中N端11位在不同株中有突变，本实验也证明第11位氨基酸由R变为G(详见实施例2)。
通过进一步抗体制备和免疫印迹实验、免疫电镜实验、临床血清ELISA实验(详见实施例3、4、5)证实本发明ORF基因产物定位于病毒颗粒表面，是一个结构蛋白，它能够与S蛋白形成二硫键复合物，并且ORF3基因产物与S蛋白在功能上密切相关，从而可以与S蛋白共同介导病毒与宿主细胞的结合，进而完成对宿主的攻击。
如本文所用，“结构蛋白ORF3”或“ORF3蛋白”指具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽。该术语还包括将SEQ ID NO1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且同样定位在SARS病毒颗粒上具有免疫原性，或可与S蛋白形成链间二硫键共价复合物的由(a)衍生的多肽。
本发明还包括具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列75％、85％、90％、95％同源性的且具有相同功能活性的序列，可使用欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的Clustal计算机程序测定序列同源性。
本发明还包括SARS的ORF3蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然SARS的ORF3蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明进一步提供SARS冠状病毒结构蛋白质的抗原性部分或区段。所述“抗原性部分或区段”是指具有一定分子结构的ORF3基因产物的片段，特别是具有SEQ ID NO9所示的抗原性部分或区段，当该分子结构以适当形式存在时，它能在患病生物体内对所属的ORF3基因产物诱发免疫应答。用于在已知氨基酸顺序中测试这种有用的抗原表位的各种方法是已知的，根据这些序列，可以用实验方法测定这些表位，例如借助于WO8606487中的筛选技术。这些抗原性部分或区段同样会诱导对SARS冠状病毒的保护作用。因此，这些抗原的部分或区段也同样都包含在本发明的范围内。
在本发明中，术语“SARS的ORF3多肽”指具有SARS的ORF3蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括具有与SARS的ORF3蛋白相同功能的、SEQ ID NO1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SARS的ORF3蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，“ORF3蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表 1
本发明还涉及编码ORF3的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO1的蛋白质，但与SEQ ID NO2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的ORF3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。所述载体可以是质粒、病毒颗粒及其他载体形式。表达载体中的多核苷酸序列可以可操作地和表达控制序列连接，还包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择性标记。所述宿主细胞可以是细菌如大肠杆菌，真菌如酵母，昆虫细胞如Sf9，动物细胞如CHO、COS等。通过本文的阐述，适当的载体、宿主细胞的选择都在本领域技术人员的知识范围内。
本发明也涉及经重组技术产生的本发明的结构蛋白，特别是ORF3基因产物的方法。可以用本领域熟知的方法将多核苷酸序列插入到载体中，载体可以通过转化、转导、转染等方式进入宿主细胞。宿主细胞经过本领域所熟知的方法培养一段时间，用常规方法如物理或化学方法破碎宿主细胞，回收并纯化培养物。
此外，本发明还提供了另一种分离并纯化本发明的结构蛋白，特别是ORF3基因产物的方法。该方法包括培养SARS冠状病毒，分离病毒蛋白并采用梯度分离胶分离病毒蛋白，切下31KD-34KD的条带，进行胶内酶解和质谱鉴定。
本发明结构蛋白ORF3或其片段可以直接用于检测抗SARS的抗体，也可用于与BSA等分子量的蛋白偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由ORF蛋白或片段、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醛(当与ORF3的N-端偶联时)、EDAC(当与ORF3的C-端偶联时)。
本发明的ORF3蛋白或其偶联物可用于免疫兔、鼠等动物，从而获得抗本发明结构蛋白ORF3的抗体(“本发明抗体”)。本发明抗体包括特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于SARS病毒、基因产物或片段。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段(如Fab’或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、嵌合抗体、人源化抗体等。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明结构蛋白ORF3或偶联物，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerl ing等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本发明的ORF3蛋白、免疫原性片段(短肽)、偶联物和抗体都可用检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体，从而作为早期检测SARS的有效指标之一。
本发明还提供一种检测试剂盒，它含有本发明的ORF3基因产物、免疫原性片段(短肽)、偶联物和抗体，该检测试剂盒可用于检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体，从而作为早期检测SARS的有效指标之一。
本发明还提供一种体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的方法，包括(a)将样品与本发明所述的结构蛋白特别是ORF3基因产物以及与本发明所述抗原性部分或区段、相应抗体、包括多克隆抗体、单克隆抗体、以及多肽接触；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体，所述的样品可以是血清或痰液。
本发明的ORF3蛋白、免疫原性片段和偶联物还可用于制备治疗性的药物组合物或预防性的疫苗组合物。
因此，本发明还提供一种组合物，它含有本发明所述(a)安全有效量的本发明结构蛋白ORF3、ORF3的免疫原性片段、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。本发明的组合物可通过常规方法进行制备。以结构蛋白ORF3计，其用量例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。此外，载体和配制方法的例子可以参见《Remington药物科学》(Remington’sPhamaceutical Science)。
此外，本发明的ORF3基因产物可以用于开发ORF3基因产物的抑制剂和促进剂以及抑制或促进S蛋白在介导与受体细胞的受体结合以及膜融合方面作用的抑制剂和促进剂。比如膜融合抑制剂能够阻止病毒穿入宿主细胞。
本发明首次确认并获得ORF3基因产物与S蛋白结合的链间二硫键共价复合物；首次在病人血清中获得ORF3的抗体，并与S蛋白质抗体呈强相关性；首次通过基因工程技术获得大规模的ORF3基因表达产物；首次通过蛋白分离纯化方法获得ORF3基因产物。结构蛋白ORF3的确定，以及功能的鉴定，功能和抗原决定簇蛋白的确定将有助于进一步理解基因组序列的差别与病毒发病机理之间的关系以及有助于SARS检测手段的改进，新型疫苗、药物的开发。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 分离ORF3蛋白1、细胞培养和蛋白质提取非洲绿猴肾细胞株Vero-E6(购自ATCC)在添加了10％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素(penicillin)，50μg/ml链霉素(streptomycin)的DMEM培养液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)中，于37摄氏度和5％CO2条件下培养。所有细胞培养用试剂购自GIBCO BRL公司。将含有SARS冠状病毒株BJ-01(购自军事医学科学院)的原液(病毒的滴度为TCID50 106)用DMEM培养液(含2％胎牛血清)稀释10倍，每1ml稀释液感染107 Vero-E6细胞；感染1小时后除去病毒稀释液，然后加入DMEM培养液(含2％胎牛血清)，于37摄氏度和5％CO2条件下培养。
将病毒液或感染病毒的细胞收集后，用100mM Tris，0.5％NP-40溶解收集细胞质，煮沸10分钟后保存。(以上工作均在生物安全3级实验室进行)2、SDS-PAGE电泳胶内蛋白质酶解采用7.5-17％的梯度分离胶分离病毒蛋白。图1为感染病毒24小时的细胞质中的蛋白质电泳图谱。第1泳道为分子量标准，从上到下依次为175kD，83kD，66kD，43kD，33kD，25kD，14kD和7kD。第二泳道为从感染病毒24小时的细胞中提取的蛋白质。第2泳道中的蛋白质条带经质谱鉴定后，发现有SARS病毒的N蛋白存在，同时，在1，2和3条带中，均发现有ORF3蛋白质(见实施例2)。
将图1中条带1和条带2切下，置于50％H2O-40％MeOH-10％HAc中漂洗脱色后，冻干。依次加入5mM二硫苏糖醇和点20mM碘代乙酰胺还原和封闭半胱氨酸。胶条捣碎置于100mM NH4HCO3(pH 8.3)，加入TPCK-胰蛋白酶，37℃保温24小时。酶解后，凝胶内蛋白质经0.1％TFA-60％ACN抽提2-3次后，冻干浓缩。
实施例2 液相色谱-电喷雾离子阱质谱鉴定蛋白质测定在Finnigan MAT LCQ离子阱质谱仪上进行，毛细管温度，200℃；喷雾电压，4.25kV；鞘气流速，50；联用的HPLC为Survey型，反相C18柱(Keystone公司产品)，50×1.0.18I.D.mm，流速2ul/min；洗脱液，A液，0.1％FA-H2O；B液，0.1％FA-ACN。MS/MS能量为35％。数据库检索采用Sequest自动检索软件进行，检索数据库SARS病毒基因组数据库。将条带1，2，3分别用质谱进行酶解肽谱分析。图2，3，4，5为肽段的质谱图。
根据检测结果，并经过数据库检索，发现条带1，2，3中出现ORF3的基因产物，ORF3蛋白质的氨基酸序列列于SEQ ID NO1。质谱鉴定出的肽段为FFTLGSITAQPVK(SEQ ID NO3)、L KEDYQIGGYSEDR(SEQ ID NO4)、LVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAMD PIYDEPTTTT SVPL(SEQ ID NO5)，这些肽段的氨基酸覆盖率占总蛋白质的24.08％，并由质谱测序确证了该蛋白质的序列(SEQ ID NO1)是可靠的。
ORF3蛋白质的氨基酸序列列于SEQ ID NO1。
MDLFMRFFTLGSITAQPVKI DNASPASTVHATATIPLQASLPFGWLVIGV50AFLAVFQSATKIIALNKRWQ LALYKGFQFICNLLLLFVTIYSHLLLVAAG100MEAQFLYLYALIYFLQCINA CRIIMRCWLCWKCKSKNPLLYDANYFVCWH150THNYDYCIPYNSVTDTIVVT EGDGISTPKLKEDYQIGGYSEDRHSGVKDY 200VVVHGYFTEVYYQLESTQIT TDTGIENATFFIFNKLVKDPPNVQIHTIDG250SSGVANPAMDPIYDEPTTTTSVPL274(SEQ ID NO1)ORF3编码序列参见SEQ ID NO2。
实施例3抗体制备和免疫印迹实验在多肽合成仪上，通过人工合成了S蛋白质的抗原肽S1(332-351位，TKFPSVYAWERKKISNCVAD，SEQ ID NO7)和S2(758-780位，RNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFG，SEQ ID NO8)以及ORF3蛋白质的抗原肽SBP1(176-199位，STPKLKEDYQIFFYSEDRHSGVKD，SEQ ID NO9)，对兔子免疫后制备获得多克隆抗体。
N蛋白抗体采用全长N蛋白(实施例1)免疫获得。
分别采用S2和SBP1抗体与转膜后的蛋白质反应，用ECL显色。分别用ORF3蛋白质的抗体(抗SBP1)进行免疫印迹实验，在病毒感染的细胞和分泌到细胞外的病毒中都检测到ORF3蛋白质(图6A)。检测的蛋白质分子量在31KD-34KD左右，与SDS-PAGE的结果相符，并暗示ORF3蛋白质可能有翻译后修饰或不同形式的亚型。
用S蛋白的抗体(抗S2)进行免疫印迹实验，在还原胶上，可在180KD处检测到S蛋白，而在非还原胶上，可在180KD和210KD处同时检测到S蛋白，说明S蛋白与其他蛋白质形成了链间二硫键复合物，复合物的分子量在210KD。再用ORF3蛋白的抗体(抗SBP1)进行免疫印迹实验，在非还原胶210KD处也发现了ORF3蛋白。这说明ORF3蛋白与S蛋白确实形成了链间二硫键共价复合物。结果见图6B。
实施例4 免疫电镜实验首先是把ORF3蛋白抗体(抗SBP1)与SARS冠状病毒颗粒混合后温浴，然后用金标(Protein A-Gold)进行标记号并在透射电子显微镜下观察。结果表明ORF3蛋白存在于病毒颗粒上(图7A)。
随后又进行了免疫凝集实验。把ORF3蛋白抗体(抗SBP1)与SARS冠状病毒颗粒混合后温浴，然后在透射电子显微镜下观察，同时用抗S2和抗N蛋白的抗体作为阳性对照。结果表明，在抗SBP1抗体存在的情况下出现了病毒颗粒的凝集(图7B)。实验确认ORF3蛋白定位在病毒颗粒，是一个结构蛋白。
ORF3蛋白抗体(抗SBP1)金标免疫电镜观察和凝集反应结果如图7所示。图7A为ORF3蛋白抗体(抗SBP1)存在下的SARS冠状病毒颗粒的金标免疫电镜图。图7B为ORF3蛋白抗体(抗SBP1)、抗S2和抗N蛋白的抗体存在下的SARS冠状病毒颗粒的免疫凝集电镜图。
实施例5临床血清ELISA实验选用了56个SARS病人和36个正常人的血清，分别与ORF3的抗原肽SBP1和SBP2进行ELISA实验，以S1抗原肽作为阳性对照。
结果见图8。SARS病人中一部分人的血清均与有SBP1和SBP2有显著反应，另一部分则低于正常人的反应。此外，与SBP2有显著反应的病人血清在检测S1抗原肽的反应时出现类似的反应。统计分析表明它们有显著的相关性(图8D)，这表明，ORF3蛋白和S蛋白在功能上密切相关。
实施例6抗原多肽的与载体的连接(偶联物的制备)对于实施例3合成的ORF3蛋白质的抗原肽SBP1(SEQ ID NO9)，先用PBS溶解(对某些不溶的多肽，可以先用半量PBS溶解，若不溶则用1M NaOH调节PH使之全溶)，取0.5ml多肽(浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml)与15mgBSA(1.5ml)混匀，然后加入交联剂(针对交联方向的不同，选择不同的交联剂，N-端交联加入戊二醛，C-端加入EDAC)，混合后于室温反应5小时，避光不断摇晃；交联结束后，放入透析袋中，对PBS 4℃透析过夜；量体积，以BSA计算浓度，于-20℃保存备用。
实施例7抗原多肽免疫动物制备抗体取实施例6制备的偶联物约0.5ml(偶联物含量分别为0.1mg、0.5mg)，加入PBS 1.5ml后与CFA(完全弗氏佐剂)混合，在三通管中反复推打，直至感觉费力，放置3-5分钟后，无两相分离即可。
将经过佐剂乳化处理的抗原免疫兔子和小鼠；每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠则注射0.8ml/只。分别皮下注射动物两足垫、颈部、背部多点注射(每点0.2ml)。
初次免疫三周后，取同样剂量多肽抗原、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐剂)，乳化后对动物进行加强免疫，注射剂量不变。
三周后对动物取血，收集抗血清。使用BSA包被的层析柱，清除针对BSA的抗体。挑选抗体滴度较高的抗原多肽，制得单克隆抗体。
实施例8检测应用(1)抗原多肽检测病人血清样品使用经过处理的实施例3制备的抗原多肽(SEQ ID NO9)包被，与病人血清混合反应，结果本发明的抗原肽段可以识别病人血清中早期针对SARS的特异性抗体，并与之结合，洗涤后加入HRP酶连二抗反应；最后加入显色底物，进行检测。
结果表明，本发明的ORF免疫原性肽可特异性地与抗SARS病毒的抗体结合。
(2)抗体(单抗与多抗)检测病原体对于实施例7获得的抗体(多抗和单抗)，用ELISA法与病人血清反应，检测病人组织液、血液中的病毒结合，对病原体进行检测。
结果表明，本发明的多抗和单抗可特异性地与SARS病毒结合。
实施例9 SARS冠状病毒ORF3蛋白原核表达及纯化在本实施例中，用对应于SARS冠状病毒ORF3蛋白的全长基因克隆(SEQID NO2)两端序列20bp的引物，通过反转录PCR扩增得到ORF3的全长序列，然后插入原核表达载体pQE30中(Qiagen公司)的多克隆位点。将重组质粒转化大肠杆菌M15诱导表达蛋白。挑单克隆在相应的抗性培养液中培养过夜后，以1∶10比例接种至相同抗性的培养液中振荡培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L诱导表达蛋白。重组的ORF3蛋白按照操作手册经Ni-NTA亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测。分子量约为34KD，与预测值相符。
Western印迹纯化后的ORF3蛋白经12％SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜。用封闭液(3％Gelatin)封闭后，加入免疫后兔抗血清(1/1000稀释)，37℃孵育1小时，洗涤后加入HRP标记的羊抗兔的IgG(H+L)，37℃孵育1小时，充分洗涤后ECL显色。
结果，重组表达的ORF3在约34kDa处有一显色条带，与预测相符。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>SARS冠状病毒结构蛋白ORF3及其应用<130>035182<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>274<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>1Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln1 5 10 15Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr20 25 30Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile35 40 45Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala50 55 60Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile65 70 75 80Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu85 90 95Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile100 105 110Tyr Phe Leu Gln Cys Ils Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp115 120 125Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn130 135 140Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr145 150 155 160Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser165 170 175Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp180 185 190Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr195 200 205Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly210 215 220Ile Glu Ash Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro225 230 235 240Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn
245 250 255Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val260 265 270Pro Leu<210>2<211>825<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>2atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt 60gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca 120ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc 180aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt 240tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt 300atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca 360tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatcccagaa cccattactt 420tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat 480aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc 540aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat 600gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact 660acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca 720ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat 780cccatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaa 825<210>3<211>13<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>3Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln Pro Val Lys1 5 10<210>4<211>14<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>4Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp Arg1 5 10<210>5<211>39<212>PRT
<213>SARS病毒(SARS virus)<400>5Leu Val Lys Asp Pro Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser1 5 10 15Ser Gly Val Ala Asn Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr20 25 30Thr Thr Thr Ser Val Pro Leu35<210>6<211>39<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<220>
<221>misc feature<222>(23)..(23)<223>Met为氧化的甲硫氨酸<400>6Leu Val Lys Asp Pro Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser15 10 15Ser Gly Val Ala Asn Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr20 25 30Thr Thr Thr Ser Val Pro Leu35<210>7<211>20<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>7Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn1 5 10 15Cys Val Ala Asp20<210>8<211>23<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>8Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr
1 5 10 15Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly20<210>9<211>24<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>9Ser Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Phe Phe Tyr Ser Glu1 5 10 15Asp Arg His Ser Gly Val Lys Asp20
权利要求
1.一种结构蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且定位在SARS病毒颗粒上具有免疫原性，可与S蛋白形成了链间二硫键共价复合物的由(a)衍生的多肽。
2.一种抗体，其特征在于，所述的抗体特异性地与权利要求1所述的结构蛋白结合。
3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体。
4.一种多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO1中连续的25-100氨基酸，且与权利要求2所述的抗体特异性结合。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的结构蛋白、权利要求2所述的抗体、权利要求4所述的多肽、或其组合。
6.一种体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的方法，其特征在于，包括步骤(a)将样品与选自下组的物质接触权利要求1所述的结构蛋白、权利要求2所述的抗体、权利要求4所述的多肽、或其组合；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的样品为血清或痰液。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物质是氨基酸序列为SEQ ID NO1的蛋白。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物质是权利要求2所述的抗体，且所述抗体是单克隆抗体。
10.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的结构蛋白和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种新的SARS冠状病毒结构蛋白及其应用。这个蛋白质属于ORF3(位于SARS冠状病毒基因组S基因和E基因之间)的基因产物。ORF3蛋白质被定位在病毒颗粒上，与识别宿主细胞和感染有关。ORF3蛋白或其免疫原性片段可作为抗原，用于生产抗体以及开发检测和治疗SARS的制剂。
文档编号G01N33/53GK1616485SQ20031010860
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月14日 优先权日2003年11月14日
发明者吴家睿, 曾嵘, 孙兵, 杨瑞馥, 施木德 申请人:中国科学院上海生命科学研究院