银杏叶组合物及制备方法与应用的制作方法

专利名称：银杏叶组合物及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物药制剂，具体涉及一种银杏叶组合物及其制备方法与应用。
银杏(Ginkgo Biloba)是现存种子植物中最古老的一种，也是可上溯到2亿多年前二叠纪时的银杏家族的唯一幸存者。在中国，银杏叶制剂用于治疗已有5000多年了，也就是说，从中草药的最早起源就开始用于治疗了。自六十年代以来，银杏叶的植药提取物在很多国家用于治疗脑血管及周围血管疾病，如德国、法国、日本和韩国。
背景技术：
银杏叶中的主要有效成份是黄酮类化合物，它包括至少14种不同的化合物，例如黄酮醇、黄酮、黄烷酮和双黄酮等等，这些化合物中，黄酮苷和黄酮醇苷包括山萘素、槲皮素和异鼠李素与葡萄糖或鼠李糖结合物，是市场上用于治疗目的的银杏叶提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或“EGb761”)中最显著的组分，实验表明黄酮苷和黄酮醇苷为有力的抗氧剂，可清除氧自由基从而避免由于年龄老化而引起的细胞和组织损伤，它们会严重影响大脑功能，包括记忆力和注意力，参见J.Pincemail等人，La Presse Medicale Vol.15(1986)，1475-1479；J.Robak等人，Biochem Pharmacol Vol 37(1988)，837-841和J.Kleijnen与P.Knipschild Ginkgo biloba(Drug Profiles)，the Lancet3401136(1992)，另外，黄酮苷和黄酮醇苷也可改善周围血管循环，含有高浓度活性成分黄酮苷的银杏叶提取物的制备工艺在(专利)DE-B1767 098和DE-B 21 17 429中都有描述，这些制备物为银杏叶单一成份提取物。
除黄酮外，银杏叶中另一主要活性成份是萜内酯，包括银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯，银杏内酯为含有内酯结构的萜类，参见K.Nakanishi，Pure和Applied Chemistry，Vol.14(1967)89-113；M.Maruyama等人，Tetrahedron Letters(1967)，299-302及303-319和K.Okabe等人，Ginkgolides，J chem.Soc.(1967)，2201-2206，它们是20个碳的笼状分子，含有一个叔丁基和六个5元环A至F，所述六个五元环包括一个螺[4.4}壬烷，一个四氢呋喃环和三个内酯环，不同银杏内酯结构仅是螺壬烷骨架上C1，C3或C7上羟基数目和位置不同。最近发现，由于它们拮抗血小板活化因子(PAF)的特性，银杏内酯A、B、C和M特别是白果内酯B能有效治疗血小板活化因子诱发的疾病如哮喘、支气管炎、老年性痴呆、过敏、心功能失调、风湿病等等以及其它循环系统疾病，参见美国专利号4,734,280；P.Braquet，Drug of the Future，12，643，1987；V Lamant等人，Biochem Pharmacol Vol.36(1987)2749-52；K.Becker等人，Biomed Biochim Acta Vol 47(1988)10-11；P.Braquet等人，J Ethnopharmacol Vol.32(1991)135-9和B.Steinke等人，Planta Med Vol 59(1993)155-60银杏内酯A和B可增加脑血流量而对大脑起保护作用，参见J.Krieglstein等人，European Journalof Pharmaceutical Sciences Vol.3(1995)39-48，美国专利号5,002,965描述了一种使用银杏内酯防止器官移植中排斥反应的方法。
DE-A 33 38 995和相关美国专利号4,571,407使用白果内酯，一种结构与银杏内酯相关的倍半萜内酯，参见K.Nakanishi等人，R.T.Major等人和K.Weinges等人，J.Am.chem Soc.，Vol.93，1971，3544-3546治疗脑病，脑水肿，脱鞘神经病和脊髓病，在中脑动脉闭合前使用白果内酯在梗塞部位，皮质和梗塞面积明显减小，参见J.Krieglstein等人，European Journal of Pharmaceutical Sciences Vol.3(1995)39-48.实验表明白果内酯有助于复原动物的运动神经，参见C.Bruno等人，Planta Med 59，1993，302-307。另外，体外和体内实验证明白果内酯具有抑制卡氏肺囊虫生长的特性，参见C.Atzori等人，Antimicrobe Agents Chemother 37(7)1993，1492-1496。美国专利号5,264,216采用白果内酯能治疗下列病菌的某些感染阴道毛滴虫、大肠杆菌、乳酸杆菌，卡氏肺囊虫、金黄色葡萄球菌、类链球菌。白果内酯抗卡氏肺囊虫感染活性主要用于治疗艾滋病并发感染。
除上述化合物外，银杏叶至少含有12种烷基酚酸化合物，包括银杏酸(漆树酸)，它是6-烷基水杨酸，烷基为正13碳到正19碳有0-3个双键的烷基基团，参见J.L.Gellermann等人，Phytochemistry，Vol.15(1976)，1959-1961和Analytic.Chem.，Vol.40(1968)，739-743。同毒常青藤中刺激物结构相仿，银杏酸是银杏叶提取物毒性作用的因素，这些毒性作用包括胃肠道副作用、头痛、皮肤刺激和水肿，六十年代以来，已有多例在接触银杏叶或果实后出现过敏反应的报告，参见G.A.Hill等人，J.Am.Chem Soc.，Vol.56(1934)，2736-2738，W.F.Sowers等人，Arch，Dermatol.，Vol.91(1965)，452-456；L.E.Becker等人，J.Am.Med.AsSoc.，Vol.231(1975)，1162-1163；T.Nakamura，Contact Dermatitis，Vol.12(1985)，281-282；R.R.Tomb等人，Contact Dermatitis，Vol.19(1988)281-3和J.P.LepoitteVin等人，Arch Dermatol Res Vol.281(1989)，227-30。于是，许多国家的科学家努力开发脱敏的物质和方法以对抗银杏酸所致的过敏(参见美国专利号4,428,965)。DE-B 17 67 098和DE-B 21 17 429开发了一种采用氯代脂肪烃如四氯化碳来去除烷基酚化合物的工艺，然而在该工艺中相当多的有医疗价值的银杏内酯和白果内酯也会失掉了。DE-B 21 17 429开发了一种技术以除去具有丹宁特性的多酚类化合物(原花色素)，在工艺中使用了铅化合物。这些工艺的问题是可能危害操作人员的健康，对环境的潜在威胁以及药品中有害的残留物。
当前最常用的用于治疗目的的银杏叶提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或“EGb 761”)含有24％黄酮苷和6％萜内酯；参见K.DriauLa Presse Medicale Vol.15(1986)，1455-1457，银杏内酯A、B、C和J以及约占这6％的一半的白果内酯，银杏叶提取物通常含有低于10ppm烷基酚化合物，每日治疗剂量120mg。
在九十年代，尽了很大的努力增加银杏叶提取物中活性成分的含量并减小银杏酸的浓度，同时，也探讨了为不同治疗提供不同银杏叶提取物有效成份特定组合的可能性。银杏内酯和黄酮苷的组合可使提取物的活性转向抗PAF作用。相反，白果内酯和黄酮苷的组合对治疗脑病、脑水肿、脱鞘神经病、脊髓病更具活性，同时也开发了不使用氯代脂肪烃去除烷基酚和不使用铅去除原花色素的方法。
美国专利号5,399,348提及到一种银杏叶提取物的制备方法，它不采用氯代脂肪烃分离烷基酚化合物，而是首先通过一沉淀过滤工序，然后从脂肪烃进行多步液液萃取，使用铅化合物或聚酰胺以去除原花色素。该方法如下银杏叶以一种有机溶剂如丙酮水溶液，一至三个碳的醇水溶液或无水甲醇提取，分离大部份有机溶剂后得到一水溶液，然后用水稀释至固体含量(含固量)5-25％(重量)。稀释后的水溶液冷却沉淀以去除亲脂性组分，然后以硫酸铵处理并用甲乙酮、丙酮或甲乙酮、丙酮混合物萃取，萃取液以水和醇稀释后得到一水醇溶液，再以铅化合物或不溶性聚酰胺处理。处理后的水醇溶液最后再用一个脂肪烃或脂环烃溶剂萃取以进一步去除烷基酚化合物，最终得到一干燥提取物。
另外，在以甲乙酮或甲乙酮、丙酮混合物萃取后，萃取液可被浓缩至含固量50～70％，然后以水和醇稀释得到含固量10％(重量)含水、醇各50％(重量)的水醇溶液，然后将一种铅盐水溶液，乙酸铅、碱或乙酸铅或硝酸铅或氢氧化铅水悬浮液，最好是碱式乙酸铅溶液加入到上述水醇溶液中，直到由颜色褐色转为赭色，形成沉淀，并分离除去水醇溶液用脂肪烃或脂环烃溶剂萃取以进一步去除烷基酚化合物，然后浓缩至醇浓度不超过5％，加入硫酸铵至浓度为20％(重量)，得到的醇水溶液用比例为9∶1至4∶6的甲乙酮乙醇混合物萃取，形成一有机相萃取液，该相浓缩至固体含量50～70％后干燥，除了铅盐也可用聚酰胺如聚酰胺6，聚酰胺66或交联聚乙烯吡咯烷酮(Polyvidon)。
美国专利号5,399 348发现采用上述方法，所得银杏叶制备物含黄酮苷20到30％，银杏内酯A、B、C、J2.5～4.5％，白果内酯2.0~4.0％，烷基酚化合物小于10ppm以及小于10％的原花色素。
美国专利号5,322,688开发了一种与上述相似的去除烷基酚化合物的工艺，但是与采用铅去除原花色素不同，美国专利号5,322,688采用了萃取工艺，使用了不与水混溶的4或5个碳的醇如正丁醇。该方法的特点是银杏叶以丙酮水溶液，一至三个碳的醇水溶液或无水甲醇提取，蒸发或蒸馏除去提取液中大部份有机溶剂，得到的水溶液以水稀释至固体含量5-25％。稀释后的水溶液冷却、沉淀除去水不溶性的亲脂成分，然后水溶液以10～30％硫酸铵处理并用甲乙酮或甲乙酮丙酮混合物萃取，萃取液以丁醇或戊醇萃取，丁醇或戊醇萃取液以水和醇稀释，得到的水醇溶液再以脂肪烃或脂环烃溶剂萃取以进一步除去烷基酚化合物，最后浓缩水相溶液，所得浓缩物经干燥后即得提取物。
另外，在上述用甲乙酮或甲乙酮丙酮混合物提取后，也可将提取液浓缩至固体含量50至70％，然后以水稀释至固体含量10％(重量)，水浓缩液即用不与水混溶的C4或C5醇萃取，醇层浓缩至固体含量50至70％，该浓缩液以水和醇稀释得到一含干燥提取物5～20％的含醇20～60％(重量)的醇水溶液，将该溶液以脂肪烃或脂环烃溶剂萃取，以进一步除去烷基酚化合物，最后，浓缩水相浓缩物，经干燥得干燥提取物。
美国专利号5,322,688提出采用上述方法所得银杏叶制备物含有黄酮苷20～30％，银杏内酯A、B、C和J 2.5-4.5％，白果内酯2.0~4.0％，烷基酚类化合物低于10ppm以及小于10％的原花色素。
美国专利号5,389,370也采用了美国专利号5,322,688所描述的去除烷基酚化合物和原花色素的方法，但是提供了含高浓度活性成份以及它们的组合物的银杏叶提取物的制备方法。美国专利号5,389,370的工艺的特点是含黄酮苷至少1.4％的银杏叶以丙酮水溶液，最多三个碳的醇水溶液或无水甲醇提取，分离除去大部分有机溶剂直至浓度不大于10％，得到的经浓缩的水性溶液以水稀释至固体含量15～20％(重量)然后放置冷却直至沉淀生成，这些沉淀由不易溶于水的亲脂性成分组成，经过滤除去，剩下的水溶液以甲酸酯或乙酸酯如乙酸乙酯或乙酸乙酯与一脂肪烃或脂环烃的混合物进行多步萃取，水相中溶解的酯可藉蒸馏完全除去，剩余溶液以与水不相溶的C-4或C-5醇萃取，醇相以水洗涤，随后浓缩，残留的溶剂通过恒沸蒸馏完全除去，残留物以40％(重量)醇水溶液稀释生成一稀释的残留物。
另外，在上述工艺中，为去除乙酸乙酯或乙酸乙酯/烃萃取液中的提取伴随物，可将萃取液用活性碳或硅胶柱层析处理。而且，上述工艺中乙酸乙酯或乙酸乙酯/烃混合得到的萃取液可首先用活性碳处理以除去伴随的杂质，然后银杏内酯结晶析出，纯净的白果内酯和剩余的银杏内酯通过柱层析从母液中分离。
在上述工艺中最后一步得到的稀释后的残留物可用脂肪烃或脂环烃溶剂进一步萃取以降低烷基酚化合物含量，水相浓缩蒸发后得到一干燥提取物。
美国专利号5,389,370报告采用上述方法，得到银杏叶制备物含黄酮苷40～60％；银杏内酯A、B、C和J 5.5-8％而白果内酯5-7％，或银杏内酯5.5~8％而白果内酯小于0.1％，或白果内酯5-7％而银杏内酯不大于0.1％；原花色素0-10％以及最大浓度为10ppm的烷基酚化合物，优选其含量低于1ppm。
美国专利号5,637,302涉及到一种银杏叶提取物的制备方法，在这里银杏叶粗提物用由正丁醇和甲苯组成的溶剂进行萃取从而避免了使用氯代脂肪烃和铅化合物，此外，采用这一工艺也可解决其它发明中使用大量相互混溶的不同溶剂的问题。美国专利号5,737,302的工艺的特点如下，银杏叶用一含水溶剂丙酮水溶液或甲醇和/或乙醇和水溶液提取，这些含水的提取液直接用正己烷或正庚烷或甲苯/丁醇混合物萃取以除去非活性亲脂性物质如烷基酚和多元酚，脱脂后的溶液浓缩至一定体积即相当于生药的重量，然后放入冰箱中24小时，然后离心，得到二聚类黄酮组成的半结晶物质，水相以体积比1∶2到1∶4的甲苯/丁醇逆流萃取。甲苯-丁醇相用水逆流洗涤后浓缩成浸膏样并以水或水醇混合物洗涤，以进一步去除残留的微量甲苯和丁醇，最后干燥。
此外，脱脂后的水溶液仍含有一定比例的二聚黄酮，可使其通过吸附树脂如一芳香族聚合物树脂，它对酚有显著的活性能很容易地吸附很多活性成分，被吸附的活性成分用有机溶剂如低级醇(C1-C4)或与水混溶的酮从树脂上再洗脱。
美国专利号5,637,302发现采用上述方法，得到银杏叶提取制备物含22~26％黄酮苷，2.5~4.5％银杏内酯2.5~4.5％白果内酯，几乎不含烷基酚化合物且原花色素小于10％。

发明内容
本发明的目的是进一步确定每一个黄酮类组份，提供更为精制的银杏提取物，可测定其含量，调整它们之间的比例。这些单一的组份包括了黄酮醇，黄酮、黄烷醇及黄酮醇苷。产品的含量符合国家制定的药物测试要求和组份重现性，不管银杏叶原料中的各种组份有何不同。这种组份更确定的银杏提取物聚集了有效的活性成份，减少了未知成份。具有更规范的生产工艺和质控标准。本发明提高了所制备的药物的安全性，增强了医生、病人用药的信心和药物筛选的重现性。
本发明的另一个目的是提供一种高含量的银杏提取物，含量指标分别为黄酮类44-78％；银杏内酯2.5-10％；白果内酯2.5-10％。高含量的银杏提取物是许多国家药物标准的要求，但由于这些条款仅适用提纯的化合物，所以普通的提取物是难以满足的。到目前为止还不可能制备如此高含量的银杏提取物。
高含量提取物的另一个优点是减少了每天的用药剂量，缩小了制剂的体积。服用银杏制剂的大多数患者为老年人，所以这优点更为突出。
还有一优势是高含量提取物大大地除去了非活性成份，大量去除非活性成份增加了用药的安全性，更为简化的活性成份使主要成份的测试及杂质的确定更为方便。提纯的银杏提取物可用于器官移植时抑制异体排斥反应。
该发明还有一个目的就是除去银杏酸，消除过敏反应的发生。
因为现在的药用银杏提取物主要是用于治疗脑及周围动脉循环不良症，所以本发明还有一个目的是提供一种方法，使该方法能用于治疗冠心病引起的心绞痛。
本发明所提供的银杏浸膏含黄酮类44~78％，银杏内酯2.5~10％，白果内酯2.5~10％，银杏酸0.1~5ppm。
本发明涉及从银杏叶中提取的组份，特别是包括含有新活性成份及其混合物的不同组份。提供了制备这些相同提取物的方法，鉴别及测定其含量的方法，还提供了含有这些活性成份和混合物的药物及其应用于治疗冠心病引起的心绞痛的方法。
本发明提供了一种组合物，包括黄酮类化合物约44％~78％，银杏内酯2.5％~10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混和物)，白果内酯2.5~10％和银杏酸0.1~5ppm。
本发明提供了一种组合物，其中含有黄酮类化合物约44％~78％(其中包括黄酮醇、黄烷醇和黄酮苷)，银杏内酯2.5％~10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混和物)，白果内酯2.5~10％和银杏酸0.1~5ppm。
本发明提供了一种组合物，含黄酮类化合物约44％~78％(其中黄酮苷20~75％)，银杏内酯2.5％~10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混和物)，白果内酯2.5~10％和银杏酸0.1~5ppm。
本发明提供了一种组合物，含黄酮类化合物约44％~78％(其中黄酮苷与黄酮醇的比率为1~30∶1)，银杏内酯2.5％~10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混和物)，白果内酯2.5~10％和银杏酸0.1~5ppm。
本发明提供了一种组合物，它含约44％～78％的黄酮类化合物(其中含有黄酮苷)，5~20％的内酯(其由2.5％~10％的银杏内酯A、B、C和J的单一成分或其混合物，以及2.5~10％的白果内酯组成)，其中黄酮苷和内酯之比约3.5~4.5∶1，还含银杏酸0.1~5ppm。
本发明提供了一种组合物，其中含有黄酮苷的黄酮类化合物不少于44％，其中含有银杏内酯A、B、C和J的单一成分或其混和物的银杏内酯不少于6％，并含0.1~5ppm的银杏酸。
本发明提供的上述组合物中的银杏酸含量约0.1~0.5ppm。
本发明提供的组合物，它的组成成分是从银杏叶中提取的。
本发明提供的上述组合物，它的组成成分是从人工培养植物中获得的银杏叶中提取出来的。
本发明提供了一个获得银杏组合物的方法，步骤如下(a)得到干燥银杏叶(b)把叶子粉碎成小片(c)用水、1~3个碳的脂肪醇、丙酮及其混合溶液对粉碎的叶子进行回流提取，在此条件下，使黄酮类化合物和萜烯内酯的提取成为可能，从而得到提取液和残渣。
(d)将残渣和提取液分离(e)60℃浓缩提取液至密度约1.2到1.25。
(f)步骤(e)中的浓缩液至少要用两种树脂处理，处理条件是能结合黄酮类化合物和内酯。
(g)洗脱结合有黄酮和内酯的层析柱，得到含有黄酮和内酯的银杏提取物。
本发明提供了一个色谱法，即装柱进行柱层析的色谱法。
本发明提供的色谱法的方法中采用的树脂包括但并不限于多孔聚合物、硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、纤维素和葡萄糖凝胶。
本发明提供的色谱法，其中柱用水，1~3个碳的脂肪醇、丙酮及其混合物或酯(甲酯或乙酯)洗脱。
本发明提供了鉴别和分析银杏组合物中黄酮的方法，步骤如下(a)把组和物溶解在甲醇里，制备供试品溶液。
(b)制备标准品溶液将银杏叶标准品置于60％的乙醇水溶液中回流，然后过滤，蒸发乙醇，浓缩滤液，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取浓缩的水溶液；浓缩正丁醇提取液至干燥，再溶解在甲醇中。
(c)根据薄层色谱(TLC)方法进行分析在同一块薄层硅胶板上将每一个上述提及的溶液点样，用乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水的混和液展开后，在空气中干燥，用1％氯化铝的乙醇液喷匀，然后用365nm紫外光观察，在标准和对照样品色谱图上，可以在指定的位置看到8个黄色斑点。
本发明提供了一鉴别、分析银杏组合物中萜烯内酯的方法，步骤如下(a)制备供试品溶液用乙酸乙酯回流银杏组合物，然后过滤，浓缩滤液至干燥，并溶解于甲醇。
(b)制备标准品溶液将银杏内酯A、B、C、J和白果内酯等五个标准样品溶解于甲醇，制成五份标准溶液。
(c)根据TLC方法进行分析在同样的GF254薄层层析硅胶板上将上述提及的几种溶液分别点样，采用乙酸乙酯、甲苯、丙酮和环己烷的混和溶剂展开薄板，待展好之后，在空气中干燥，加热，于254nm紫外灯下观察，标准和试验样品在相同的位置出现相同颜色的斑点。
本发明提供了一个鉴别和分析检查银杏组合物中银杏酸的方法，步骤如下(a)制备供试品溶液，将银杏组合物用正己烷进行回流，然后过滤，滤液浓缩至干并溶解于乙酸乙酯。
(b)制备标准样品溶液将银杏酸标准品溶解于乙酸乙酯。
(c)用薄层层析法进行分析在同样的GF254薄层硅胶板上，取上述提及的溶液进行点样，采用正己烷、乙酸乙酯和乙酸的混和溶剂展开薄板，在空气中干燥，于315和368nm紫外光下观察，分析样品溶液吸收应小于标准品溶液的吸收。
本发明提供了测定银杏组合物中总黄酮的方法，步骤如下(a)制备标准品溶液将干燥芦丁定量溶于乙醇水溶液，得标准品溶液。
(b)绘制标准曲线吸取不同量的标准溶液至容量瓶，将每一容量瓶用水、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝4.5)、0.1M氯化钠和70％的含水乙醇加至刻度，根据在270nm的吸收，绘制标准曲线图。
(c)采用分光光度法分析样品用70％乙醇溶解组合物样品，吸取此溶液到一容量瓶，采用上述方法，制成样品溶液，根据标准曲线，在270nm处测出样品的吸收后就可得出其浓度，从芦丁干品计算出的总黄酮含量是标示量的85~115％。
本发明提供了测定银杏组合物中黄酮苷的方法，步骤如下(a)制备供试品溶液用甲醇和25％盐酸糖溶解样品组合物，回流，除去盐及不溶物，放置冷却并转移容量瓶，烧瓶用甲醇洗涤，洗涤液倾至容量瓶中，再用甲醇稀释至刻度。
(b)标准液的制备将槲皮素、山萘素、异鼠李素溶解于同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
(c)用高压液相的方法测定含量，计算槲皮素、山萘素、异鼠李素相对峰面积再通过下列公式计算总黄酮苷的含量＝槲皮素的量×2.50+山萘素量×2.63+异鼠李素的量×2.36。
本发明提供了测定萜稀内酯在银杏提取物中的含量的方法，步骤如下(a)样品溶液的制备该组合物用丙酮回流、过滤、浓缩滤液，残渣溶解于乙酸甲酯中，用水萃取，水层用乙酸甲酯再萃取一次。合并两份乙酸甲酯层，蒸干后定溶于甲醇中。
(b)标准液的制备将内酯A、B。C、J和白果内酯用甲醇定溶于同一容量瓶中。
(C)测试供试液及标准液通过高压液相色谱(HPLC)检测，根据外标法算出A、B、C、J和白果内酯的含量，总内酯含量可藉求和得到。
本发明提供了用银杏内酯A、B、C、J及白果内酯单体作为标准品来测试银杏组合物中内酯含量的方法。
本发明提供了用银杏酸单体作为标准品来测试银杏组合物中银杏酸含量的方法。
本发明提供了用芦丁单体作为标准品测定黄酮类化合物的方法。
本发明提供了用槲皮素、山萘素、异鼠李素单体作为标准品测定黄酮醇及其苷的方法。
本发明提供的上述组合物可用于食品添加剂或加入饮料中。
本发明提供的上述组合物可用于霜剂、油膏剂或出现这些制剂的原料中。
本发明提供了含上述成份的口服剂。
上述口服剂型包括丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂或悬浮液。
本发明提供了一种注射制剂，该注射剂可通过如下不同途径使用，如静脉、肌肉、皮下、腹腔注射。
本发明提供了采用上述成份的化妆品。
本发明提供了通过以上方法制备的药用组合物，它含有上述有效量的上述组合物及药用载体。本发明还提供了该药用组合物的制备方法。
该发明可接受的药用载体是指任何标准药用载体。这些载体的实例是众所周知的，包括但不限于标准药用载体，例如磷酸盐的缓冲生理盐水液，含有聚山梨醇酯80、水的油/水混悬液和各种类型的湿润剂的磷酸盐缓冲生理盐水，其他载体还包括灭菌溶液、片剂、包衣片和胶囊。
典型的载体包括赋形剂，例如淀粉、牛奶、糖、特种粘土、明胶、硬脂酸或盐(包括硬脂酸镁、钙)、滑石粉、植物脂肪或植物油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。载体也包括调味品和色素或其他添加剂。含有载体的组和物按常规方法配制。
本发明提供了一种治疗冠心病引起的各种类型和程度的心绞痛的方法，该方法是将以上药用组合物的有效剂量施予患者。
本发明提供了通过向患者施用以上药用组合物的有效剂量改善局部缺血引起心动过速的方法。
本发明提供了通过向患者施用上述药物组份的有效剂量缓解心绞痛的方法。
本发明提供了通过向患者施用上述药物组份的有效剂量减少三硝酸甘油酯的用量的方法。
本发明提供了通过向患者施用上述药物组份的有效剂量缓解心悸的方法。
本发明提供了通过向患者施用上述药物组份的有效剂量使血脂不正常的病人降低血液中的胆固醇和甘油三酸酯的方法。
本发明提供了通过向患者施用上述药物组份的有效剂量减少血液中血小板凝聚的方法。
本发明提供了通过向患者施用上述药物组份的有效剂量提高运动耐受性，延长运动持续时间、延长运动开始到心绞痛发生以及开始运动到ST部分降低1mm之间的间隔时间的方法。
本发明提供了通过向患者施用以上有效剂量的药用组合物治疗阳萎的方法。
本发明提供了通过向患者施用以上有效剂量的药用组合物治疗牛皮癣的方法。
本发明提供了通过向患者施用以上有效剂量的药用组合物治疗色素沉着的方法。
本发明提供了通过向患者施用以上有效剂量的药用组合物治疗健忘、AIDS、早老性痴呆症(阿耳茨海默氏病)、心绞痛、动脉硬化、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、孤独症、遗尿、脑外伤、心律失调、冻疮、风寒、冠心病、耳聋、痴呆、抑郁、伴随坏疽和绞痛的糖尿病血管收缩、头昏、视力模糊、记忆力下降、疲劳、丝虫病、头痛、高血脂、高血压、间歇性跛行、肾功能紊乱、腿部痉挛、心肌梗塞、帕金森症、血循环障碍、栓塞综合症、雷诺氏症、风湿、衰老、胸闷、耳鸣、结核、静脉曲张、眩晕的方法。
上述药用组合物被用于治疗疾病，因为它们具有如下作用镇痛、止痛、缓解气喘、消炎、阻止动脉粥样硬化形成、抗菌、抗癌、抗凝血、抗糖尿病、降高血脂、降高血压、抗核辐射、抗血小板凝聚、抗氧化、抗血栓、抗结核、抗咳嗽、支气管扩张、毛细管扩张、毛细管保护、脑循环兴奋剂、脑血管舒张药、使注意力集中、改善记忆力、改善听力、改善外周循环、增加多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、神经传导、调节剂、防止颈动脉粥样硬化和血管舒展剂等。
本发明的最佳实施方式下述实例将更有助于对该发明的理解，有这方面知识的人将真正认识到，上面所说的这些方法和结果只不过是很表面的描述了该发明。以下的说明将较为详尽。
下面的实例将有助于对本发明的理解，进而，本领域的技术人员将会认识上述方法和结果。
实例1、本发明提供了一种制备银杏组合物的方法，步骤如下(a)提取银杏绿叶在夏末到初秋时采集，此时，有效治疗成分含量高而水份低于8％，干燥后，在粉碎机里粉碎成小于4mm的碎片，然后用12倍体积的60％的含水乙醇常压下回流两次，每次3小时，过滤除去固体残渣后再用10倍体积的水进行第三次回流0.5小时，合并三次滤液。
(b)浓缩将步骤a得来的滤液减压浓缩至不含醇的粘稠浸膏(密度d＝1.2~1.25，温度t＝60℃)。
(c)沉淀用2倍量的热水溶解步骤(b)的粘稠浸膏，冷却后形成沉淀，过滤除去沉淀。
(d)柱层析将步骤(c)的滤液上大孔树脂柱(XAD-4)使树脂和叶子的比率为1∶1，用2倍量的纯水、6％、18％、30％含水乙醇分别洗脱，最后用65％乙醇洗脱，直至流分颜色变浅。18％和30％流分合并后真空浓缩至不含醇的小体积，然后此浓缩液上聚 酰胺柱，聚酰胺与粗叶比率为1∶3，用纯水和95％乙醇分别洗脱，将95％的流分和大孔树脂柱65％的流分合并，真空浓缩至不含醇。
(e)去除银杏酸用三分之二体积的环己烷萃取步骤(d)的浓缩液三次，含水部分减压浓缩。
(f)干燥将浓缩的浸膏的密度调整至1.05，然后喷雾干燥，喷雾干燥室温度控制在140~160℃。
成品为棕黄色粉末，有特殊香味，略有苦味。
前述方法具体来说，柱层析的特点是二次处理，即浸膏首先上大孔树脂柱(XAD-4)，柱与叶子的比率为1∶1，接着上聚酰胺柱，柱与叶子的比率为1∶3。
具体来说，除去银杏酸的特点就是通过二次处理，即浸膏经过大孔树脂柱(XAD-4)层析，然后用环己烷处理三次。
实例2、本发明提供了一个制备银杏组合物的方法，步骤如下(a)提取采集夏末秋初的银杏绿叶，此时的有效治疗成分含量高而水份含量低于8％，干燥后，在粉碎机里粉碎成小于4mm的叶片。然后用12倍量的溶剂系统回流2次，每次1~3小时，，溶剂系统可采用水，水-乙醇和丙酮-水，过滤除去固体或渣，合并上述的两次滤液。
(b)浓缩步骤(a)得到的滤液经真空浓缩成不含有机溶剂的浸膏，(d＝1.2~1.25，t＝60℃)(c)沉淀将步骤(b)得到的浸膏溶解于2倍量的沸水中，冷却至约12℃，有沉淀形成，过滤分离。
(d)柱层析将步骤(c)得到的浸膏上某一树脂柱，用水或水和有机溶剂的混合溶剂洗脱，混合溶剂可选用1~3个碳的醇和丙酮。洗脱流分浓缩后上另一种树脂柱，用一或两种溶剂系统洗脱，溶剂系统可选择水、1~3个碳的醇，酮和酯，然后可得到含高含量的内酯和黄酮类化合物的流分，减压浓缩此流分除去含水醇。
(e)除去银杏酸将步骤(d)得到的浓缩液用三分之二体积饱和或不饱和烷烃萃取三次，水部分真空浓缩。
(f)干燥将浓缩浸膏的密度调整至1.02~1.10(40℃)，然后喷雾干燥，喷雾干燥室温控制在140～160℃。
实例3、本发明提供了一制备银杏组合物的方法，步骤如下将100kg干燥银杏叶粉末和1000kg，50％乙醇溶液回流2小时，过滤、将过滤残渣再用1000kg，50％含水乙醇回流2小时，过滤，合并两次滤液，在60℃下真空浓缩至无醇(d＝1.2)，将浓缩液溶解于300kg水中并放置48小时，过滤。将滤液上大孔树脂和聚酰胺的混和柱，分别用100kg的水，100kg 30％乙醇溶液，100kg 60％乙醇溶液、100kg 90％乙醇溶液洗脱，合并30％、60％、90％乙醇的水溶液洗脱液，真空浓缩合并液至约70kg的浸膏，用正己烷萃取浸膏三次，将水相真空浓缩和干燥。1.5kg的最终产品含水低于5％，含47.2％黄酮类化合物，其中黄酮苷约24.8％，内酯6.3％和低于5ppm的银杏酸。
实例4、从实例3的柱层析开始从柱上下来的用30％的乙醇水溶液洗脱的流分经减压浓缩，除去乙醇，浓缩液萃取三次，每次用三分之二体积的乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯相在45℃减压蒸发，残留物用50％乙醇水溶液加热溶解，放置24小时，形成银杏内酯结出。分离结晶后，母液减压蒸发，分别用1.5倍重量活性炭和硅胶进行层柱分离，将所有白果内酯和银杏内酯的部分分别收集；浓缩至干，与银杏内酯结晶(A)10g合并，总萜内酯的含量不低于80％。
收集合并实例3中从柱中洗脱的60％乙醇水溶液部分和70％乙醇水溶液部分。减压浓缩至完全无醇。此浓缩物上聚酰胺柱，分别用10％、20％、75％和90％乙醇水溶液洗脱。将75％流分浓缩至干，粉状物用无水乙醇溶解，上聚酰胺柱，分别用100％乙醇、70％乙醇水溶液和20％乙醇水溶液洗脱，收集70％乙醇水溶液，与2kg硅胶混合，将混和物浓缩至干，用乙酸乙酯、乙醇分别洗脱。浓缩乙醇部分至干得(B)90g。总黄酮含量不低于80％。
高含量的内酯(A)和黄酮(B)浸膏按不同比例混合，得到不同含量的最终产品，例如10g(A)和90g(B)，得100g(A+B)，此混合物中含77％黄酮类化合物和8％内酯，10g(A)和70g(B)混和得80g(A+B)，则这一产品含70％黄酮和10％内酯。
实例5、鉴别和定量分析黄酮，内酯和银杏酸的方法，以及确定黄酮、内酯、萜烯内酯含量的方法。
本发明提供了一种鉴别和定量分析银杏叶组合物中黄酮的方法，步骤如下(a)制备供试液将0.1g组合物溶解于1ml甲醇。
(b)制备标准液将1g标准银杏叶用10ml 60％乙醇回流2小时，过滤、浓缩滤液、蒸干乙醇；分别用10ml的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、浓缩正丁醇部分至干并将它溶解于1ml甲醇中。
(c)测定供试液在相同的硅胶薄板上将上述每个溶液点样10μl，用乙酸乙酯∶甲酸∶乙酸∶水(100∶11∶11∶26)的混和溶剂展开后，将溶剂在空气中吹干除尽，用1％氯化铝乙醇溶液喷涂，365nm紫外灯下观察，在标准样品和供试样品色谱图上，在指定的位置可看到8个黄色斑点。
本发明提供了一种鉴别和定量分析银杏组合物中内酯的方法，步骤如下(a)制备供试液用20ml乙酸乙酯回流0.5g组合物30min，过滤、浓缩滤液至干溶解于2ml甲醇中。
(b)制备标准液，各取银杏内酯A、B、C、J和白果内酯B的标准品，溶解于甲醇中，得到5种0.5mg/1ml的标准品溶液。
(c)测试供试液将上述溶液各吸取10μl，点在同样的硅胶GF254板上，用乙酸乙酯∶甲苯∶丙酮∶环己烷(4∶3∶2∶1)的混和溶剂展开后，在空气中吹干溶剂，150℃加热1小时，在254nm波长光下观察，供试品和标准样品在指定的位置可看到相同颜色的色谱斑点。
本发明提供了一种鉴别和定量分析银杏混和物中银杏酸的方法，步骤如下(a)制备供试液将4g组合物加100ml正己烷回流2小时，过滤，浓缩滤液至干，并溶解在1ml乙酸乙酯中。
(b)制备标准液将银杏酸标准品溶于乙酸乙酯，使该溶液为每毫升含0.04mg标准品，(c)测试供试液将上述溶液各吸取10μl分别点在同样的硅胶GF254薄板上，用正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸(80∶15∶5)的混和溶剂展开后，在空气中吹干溶剂，在315nm波长处和368nm波长处的紫外灯下观察，供试液的吸收应低于标准液的吸收(0.0005％)。
本发明提供了一定量分析银杏叶组合物中黄酮化合物总含量的方法，步骤如下(a)制备标准品溶液将20mg干燥芦丁溶于70ml 70％含水乙醇中。
(b)绘制标准曲线各吸取该标准液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，到10ml的容量瓶中，分别加入3ml水，2ml的乙酸-乙酸钠的缓冲液(PH＝4.5)，2ml的0.1M的氯化铝，然后用70％含水乙醇加至10ml，在270nm处根据每个标准液样品的吸收绘制标准曲线。
(c)用分光光度法测定供试液在50ml的容量瓶中将25mg银杏组合物溶于70％含水乙醇中。吸取0.5ml该溶液加到一10ml容量瓶中，参照上述方法制备成供试液，在270nm处测定其吸收，由标准曲线可得知供试液浓度，在无水情况下，总黄酮量以芦丁计为标示量的85～115％之间。
本发明提供了一测定黄酮苷含量的方法，步骤如下(a)制备供试液用20ml甲醇和5ml 25％的盐酸溶解75mg银杏叶组合物，并回流60min，分离后，放置冷却并立即转移至50ml的容量瓶中，烧瓶用5ml甲醇洗3次，洗涤液并入容量瓶，用甲醇稀释至刻度。
(b)制备标准液将4.2mg的槲皮素、6.0mg的山萘素、1.2mg的异鼠李素用甲醇溶解于一个50ml的容量瓶中，并用甲醇稀释。此标准液每1ml中含24μg的异鼠李素，84μg的槲皮素、120μg的山萘素。
(c)测定供试液计算HPLC的相对峰面积来测定山萘素、槲皮素和异鼠李素的含量。总的黄酮苷含量＝槲皮素含量×2.50+山萘素的量×2.63+异鼠李素的量×2.36。
本发明提供了一测定萜烯内酯含量的方法，步骤如下(a)制备供试液将100mg组合物和60ml丙酮一起回流2小时，过滤后，浓缩滤液，残渣再用20ml乙酸甲酯溶解，用10ml水萃取，水层再用20ml乙酸甲酯萃取，合并两次的乙酸甲酯液层，浓缩至干并溶解于5ml甲醇中。
(b)制备标准液用甲醇溶解各30mg银杏内酯A、B、C、J和白果内酯(BB)于50ml的容量瓶中。
(c)测定供试液标准品和供试品进样量各15μl得，到它们的液相色谱图，用外标法可计算出银杏内酯A(GA)、B、C、J和白果内酯(BB)各自的含量，再计算出总的内酯含量，在无水浸膏中总的萜烯内酯含量约5~20％。
上述方法具体来说，用高度纯化的化学结构为C27H30O16的芦丁单体作为标准品，测定银杏总黄酮类化合物含量。
上述方法具体说来，用高度纯化的化学结构明确的槲皮素、山萘素、异鼠李素的单体作标准品，来测定银杏叶组合物中黄酮醇苷和黄酮苷的含量。
上述方法具体说来即用高度纯化、化学结构明确的GA、GB、GC、GJ和BB作标准品，鉴别内酯并测定内酯含量。
上述方法具体来说即用高度纯化、化学结构明确的银杏酸作标准品，来鉴定银杏叶组合物中的银杏酸。
实例6、包衣片，每片含银杏浸膏40.00mg乳糖100.00mg淀粉40.00mg微晶纤维素 36.00mg
羟丙基甲基纤维素30.00mg硬脂酸镁1.50mg欧巴托(OPADRY)(用于包衣)7.50mg包衣片总量 约255.00mg实例7、颗粒剂每袋的组成银杏浸膏 40mg蔗糖 420mg糊精 480mg淀粉 20mg羟丙基纤维素 20mg甜葡糖苷 20mg颗粒总量 1000mg实例8、注射液1安瓿包括银杏浸膏 40mg甘露醇 100mg烟酰胺 100mg精氨酸单盐酸盐 50mg乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 4.00mg实例9、饮料500ml饮料包括
银杏浸膏 2.0g38％乙醇 500ml香料 适量实验数据本发明中描述的银杏提取物可用常规方法配制制剂，例如，可制成口服液，包衣片剂，片剂或注射剂。本发明中的制剂可用来治疗脑血管和外周血管循环障碍，尤其是可用于治疗冠脉疾病所引起的心绞痛，在中国进行的临床试验表明，共243个病例证实了银杏提取物在治疗冠心疾病引起的心绞痛是安全有效的，临床试验详细情况概述如下参加医院4家医院参加了这项临床试验，包括北京中医药大学附属东直门医院；上海医科大学附属华山医院；上海第二医科大学附属第九人民医院；上海中医药大学附属龙华医院。
病人选择标准临床试验在1995年11月至1996年7月进行，243个患有冠脉疾病引起的心绞痛病人参与了试验。
选择病人的标准如下入选标准病人被明确诊断为心绞痛，胸痛每周发作2次以上。心电图上缺血改变或运动测试结果为阳性。
排除标准(1)病人具活动性心肌缺损或别的心肺功能疾病者，以及重度神经官能症，更年期综合症和颈椎病引起的胸痛。(2)病人患心绞痛并有高血压者(BP＞24/14.87Kpa)。(3)病人具严重的心肺功能衰竭，严重的心律失常，肝肾功能异常和造血功能障碍者。(4)哺乳期妇女和过敏体质患者。(5)年龄小于18岁或是大于70岁者。
删除数据标准不按处方服药的病人和缺少资料，临床试验结果无法确定的病人。
研究者随机把153个病人分属银杏组，90个病人分属对照组。银杏组再随机分组，123个属测试组，30个属开放组。在4个医院中治疗的243位病人的基础数据是表1-表5，结果表明，三组中的性别、年龄、发病时间，心绞痛和并发症的种类和严重程度均表现出显著差异，住院比例为72.4％。
表1 3组中年龄平均值和性别分布情况P＞0.05

表2 3组中疾病持续时间P＞0.05

表3 3组中心绞痛严重程度P＞0.05

表4 3组中心绞痛类型P＞0.05

表5 3组中心绞痛的并发症P＞0.05

诊断标准1、心绞痛严重程度的诊断标准在临床试验中心绞痛严重程度的诊断标准是参照1979年中西药结合治疗冠心病心绞痛及心律失常研讨会《冠心病心绞痛及心电图疗效评定标准》，标准详述如下(1)轻度典型的心绞痛发作常持续几分钟，1天发作1-3次或每周2~3次，发作并不严重，但病人有时需要服用硝酸甘油。
(2)中等程度每天心绞痛发作超过3次，每次持续几分钟至10分钟，疼痛比轻度发作严重，且病人通常需要服用硝酸甘油。
(3)严重每天心绞痛发作频繁，持续时间长且严重，日常生活受影响，病人经常服用硝酸甘油。
2、心绞痛类型的诊断标准在临床试验中心绞痛类型的诊断标准为国际心脏病学会及世界卫生组织联合委员会制订的《缺血性心脏病临床诊断标准》，诊断标准详述如下(1)劳累型心绞痛由于过度疲劳或其它增加心肌耗氧量需求引起的短暂性胸痛发作，疼痛通过休息或服用硝酸甘油后能迅速缓解。
(2)自发性心绞痛胸痛发作与任何提高心肌耗氧量的状况无明显关系，与劳累型心绞痛相比，疼痛持续时间长且更严重，通常服用硝酸甘油不易缓解。
(3)混合型心绞痛自发性心绞痛可伴随劳累型心绞痛产生，称为混合型心绞痛。
临床试验方案设计临床试验按以下方法进行243个患冠脉疾病引起的心绞痛患者参加了试验。研究者把153个病人作为银杏试验组，90个病人为对照组，银杏试验组再随机把123个病人分为测试组，30个病人分为开放组，这213个测试组与对照组的病例采用双盲，放大平行对照和开放治疗法进行。银杏组所用药物为这项发明所述银杏提取物的制剂。1g制剂含40mg银杏提取物，480mg糊精，420mg蔗糖，20mg淀粉，20mg低取代羟丙基纤维素和20mg甜菊糖甙。银杏制剂先制成颗粒然后装入小袋，每袋1g在临床试验中病人每次服用1袋银杏制剂，每天3次，治疗周期为6周。
对照组所用药物为百路达(Brainway)，由位于中国上海四川北路70号的上海信谊药厂生产。临床试验中病人每次服1粒百路达，每天3次。作为阳性对照品，治疗周期同样6周。
由于两药剂型不同(颗粒剂和胶囊)，所以各组均加服不同剂型的空白安慰剂，即治疗组除服用银杏颗粒外，加服空白胶囊(安慰剂)，对照组服用百路达外，加服空白颗粒剂(安慰剂)。各安慰剂的包装、外观均与相应药物完全一致。
从临床试验前一周开始，停服长效冠心病药物。病人患轻度高血压者允许服用他们的常用药。如病人不能忍受心绞痛发作时，硝酸甘油可暂时服用。
评估药物疗效的标准是根据中国卫生部1993年颁布的《中药新药临床试验指南》关于冠心病心绞痛病人的治疗这一部分以及1979年中西药结合治疗冠心病心绞痛及心律失常研讨会，《冠心病心绞痛及心电图疗效评定标准》进行评价。标准详述如下
对轻度心绞痛病人(1)显效胸痛消失或基本消失(2)有效胸痛发作明显减轻(3)无效胸痛症状无改善(4)恶化胸痛发作加重，达到“中度”以上标准度。
对中度心绞痛病人(1)显效胸痛症状消失(2)有效胸痛减轻或达到轻度标准(3)无效没有观察到有改善(4)恶化胸痛加剧，达到“较重度”水平。
对较重心绞痛病人(1)显效胸痛消失或减轻到“轻度”标准(2)有效胸痛减轻到“中度”标准(3)无效胸痛症状与治疗前相同(4)加重胸痛症状加重(或达到“重症标准”)。
心电图疗效评价标准(1)显效心电图恢复到“大致正常”或达到“正常心电图”(2)有效降低的S-T段，提高＞0.05mv，但不到正常水平，T波变化降低，或T波变化从平到向上，房室阻滞或室内传导阻滞改善。
(3)无效在心电图上未观察到改善。
(4)加重治疗后S-T段降低加重，T波加深或T波从平坦变为倒置，以及出现异位心律及心律失常者。
计算停止硝酸甘油停减率 临床试验结论在临床试验中，银杏组和对照组没有观察到明显的副作用，只有3个病人在治疗过程中有胃不适，其中一位病人有轻度呕吐，未经治疗即缓解。
从随机对照、双盲和开放的临床试验资料结果表明，这项发明中银杏提取物制剂在治疗冠心病心绞痛是安全、有效的。银杏制剂显示了很强的生物活性，与现有的治疗心绞痛的中药制剂比较，在安全性和有效性两方面，银杏制剂在一个或多个方面已超过现有制剂，且能降低硝酸甘油的使用。
1、银杏制剂药效成份在治疗冠心病心绞痛时是有效的，且疗效超过了对照药物。
表6银杏提取物药效成份对心绞痛病人的作用

**P＜0.01，*P＜0.05，与对照组比。
2、银杏制剂药效成份在改善缺血性心电图时是有效的，且有效率超过了对照组。
表7 银杏提取物药效成份改善缺血性心电图的作用

3、银杏制剂药效成份在减轻心绞痛过程中是有效的，且在减少硝酸甘油的使用上作用强于对照组。
表8银杏提取物药效成份对硝酸甘油停减情况

*P＜0.01，与对照组比4、银杏制剂药效成份能有效减轻心悸，且有效率超过了对照组。
表9银杏提取物药效成份对心绞痛症状的改善

*P＜0.01与对照组比5、银杏制剂有效成份能有效降低血脂异常病人的胆固醇及甘油三酯水平。
表10银杏提取物有效成份对血脂异常病人血脂的作用

*P＜0.05，与给药前比6、银杏制剂药效成份能降低中等密度和低密度全血比重，抑制血小板聚集，且给药前与给药后差异显著。
表11银杏提取物药效成份对病人血象变化的作用项目 测试对照组病例数给药前 给药后病例数 给药前给药后全高 60 5.97±1.52 5.96±1.39 30 6.19±1.206.29±1.05血中 30 8.07±1.51 6.86±0.90** 30 7.76±0.847.04±0.59**比低 63 8.85±3.10 8.28±2.51*30 8.46±3.138.25±2.56重血清比重 93 1.74±0.30 1.73±0.17 30 1.81±0.171.74±0.16血小板聚集率 30 75±16.4 57.1±15.5 30 72.3±15.462.6±14.9*P＜0.05，**P＜0.01与给药前比。
7、银杏制剂药效成份具有改善运动耐受力和延长运动持续时间，延长运动开始和心绞痛发作间隔时间，以及运动开始至ST段降低1mm间隔时间。且此作用强于对照药物。
表12银杏提取物药效成份对病人运动能力的作用项目测试组(n＝21) 对照组(n＝20)给药前 给药后 给药前 给药后总运动时间(S)405±141 550±125** 428±136497±144**^总运动耐受力 7.93±2.2510.23±1.97**8.13±2.40 9.44±2.20*(mets)ST段降低1mm 267±94 344±120** 303±114305±130运动量(mets)运动开始至ST 5.88±1.407.09±1.75** 6.30±2 6.31±2.15^^降1mm间隔(mets)运动开始至 390±138 523±119** 399±131480±132**心绞痛发作(S)ST恢复时间(S)574±149 585±134 608±132595±128运动顶峰时 1.60±0.371.63±0.45 1.56±0.48 1.58±0.44ST段降低*P＜0.05 **P＜0.01与给药前比^P＜0.05 ^^P＜0.01与对照组比8、银杏制剂药效成份可用于各种类型与不同程度的心绞痛，(表13、14)，且不影响血压和心率(表15)，也不影响肝、肾功能。
表13银杏提取物药效成份对3种程度心绞痛的作用心绞痛严重程度 病例数 显效 有效 无效轻度 55 2333 1中度 80 3346 1重度 18 3 7 8表14银杏提取物药效成份对3种类型心绞痛的作用心绞痛类型 病例数 显效 有效 无效劳累型 119 4865 6自发型 25 6 16 3混合型 9 5 3 1表15 3组病人给药前后血压和心率变化表(X±SD)项目测试组/开放组 对照组病例数 给药前 给药后病例数 给药前 给药后SBP(KPa)153 19.1±2.4 18.7±2.19019.2±2.219±1.8收缩压DBP(Kpa)153 11.4±1.1 11.3±1.19011.5±1 11.4±0.9舒张压(HR)心率153 76.9±8.9 75.9±7.59075.6±6.576.1±7.4
表16银杏提取物药效成份对病人肝肾功能的影响项目 测试组 对照组病例数给药前给药后 病例数 给药前 给药后谷丙氨转移酶 12316.8±6.6 14.8±6.860 13.6±5.914.3±6尿素氮1235.81±2.07 5.82±3.08 60 5.75±1.34 5.53±1.09肌 酐15381.8±24.1 78.2±20.3 90 84.7±18.3 84±20.4工业实用性通过上述说明可见，本发明提供了一种新的银杏叶提取物组合物，该组合物的制备方法，以及组合物中各种成分的检测方法。所述组合物可用作食品添加剂或加到饮料中，也可添加到霜剂、油膏剂或制作它们的原料中。所述组合物也可制成口服制剂、注射剂或化妆品。将本发明的组合物与药用载体结合可制成药用组合物从而治疗冠心病引起的不同程度不同类型的心绞痛、缺血性心脏病、心悸、降低血小板凝集、改善运动耐受力和延长运动持久力、治疗阳萎、牛皮癣、色素沉着等疾病。
权利要求
1.一种鉴定和定量分析由银杏叶提取得到的组合物中的黄酮的方法，包括以下步骤a)将组合物溶于甲醇以备检验；b)将标准银杏叶以60％醇水溶液回流后过滤；滤液浓缩后蒸发除去醇；浓缩后的水溶液分别以石油醚、乙酯乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇部分浓缩至干后，溶于甲醇得标准品溶液；c)用薄层层析法进行分析将上述每一溶液在相同的硅胶板上点样，以乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水的混合物展开，取出薄板、空气中阴干，喷以1％氯化铝乙醇溶液并在365nm紫外光下观察，在样品和对照品色谱中，指定位置出现八个黄色斑点。
2.一种鉴定和定量分析由银杏叶提取得到的组合物中萜内酯的方法，包括以下步骤a)将组合物与乙酸乙酯回流，过滤后，浓缩溶液至干并溶于甲醇，以备检验；b)将银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯溶于甲醇得到5个标准溶液；c)用薄层层析法进行分析将上述每一溶液在相同的硅胶薄板(GF254)上点样，以乙酸乙酯、甲苯、丙酮和环己烷的混合物展开，然后取出薄板、空气中阴干，加热并在254nm紫外光下观察，在样品和对照品色谱中，相同颜色的斑点出现在指定位置上。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于其中以所述的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯单体作为标准品，以鉴定银杏组合物中的萜内酯。
4.一种鉴定和定量分析由银杏提取得到的组合物中银杏酸的方法，包括以下步骤a)将组合物与正己烷回流，过滤后，浓缩滤液至干并溶于乙酸乙酯以备检验；b)将银杏酸标准品溶于乙酸乙酯得标准溶液；c) 用薄层层析法进行分析将上述每一溶液在相同的硅胶板(GF254)上点样，以正己烷、乙酸乙酯、乙酸的混合物展开，取出薄板、空气中阴干，在315nm-368nm紫外光下观察，样品的吸收应比标准品吸收为小。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于其中以所述的银杏酸单体作为标准品以鉴定银杏组合物中的银杏酸。
6.一种测定由银杏提取得到的组合物中总黄酮的方法，包括以下步骤a)将干燥的芦丁溶于70％乙醇配成标准溶液；b)移取不同量的标准溶液于容量瓶中，每一容量瓶中均加入水、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝4.5)、0.1M氯化铝和70％乙醇，以每个样品270nm下的吸收描点作标准线；c)依据分光光度法进行检验，将组合物以70％乙醇溶解，移取一定量的溶液于容量瓶中，其余同上测定270nm下的吸收，根据标准曲线得知样品的浓度，按无水状态下总黄酮含量以芦丁计为标示量的85％-115％。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于其中以所述的芦丁单体作为标准品以测定银杏组合物中总黄酮的含量。
8.一种测定由银杏提取得到的组合物中黄酮醇苷含量的方法，包括以下步骤a)将组合物溶于甲醇和25％盐酸并回流，然后冷却、转移至容量瓶中，烧瓶以甲醇洗涤，溶液倾入容量瓶中，甲醇稀释至刻度以备检验；b)将槲皮素、山萘素、异鼠李素溶于同一容量瓶中，以甲醇稀释得标准溶液；c)计算HPLC谱图上相对应的峰面积，以确定槲李素、山萘素和异鼠李素的量，总黄酮醇苷的量＝槲皮素×2.50+山萘素×2.63+异鼠李素×2.36.
9.根据权利要求8的方法，其特征在于其中以所述的槲皮素、山萘素、异鼠李素单体作为标准品测定银杏组合物中黄酮醇及黄酮醇苷的含量。
10.一种测定由银杏提取得到的组合物中萜内酯含量的方法，包括以下步骤a)将组合物以丙酮回流，过滤后，滤液浓缩，将残渣溶于乙酸甲酯，用水萃取；水层再以乙酸甲酯萃取；合并两乙酸甲酸层浓缩至干，溶于甲醇以备检验；b)将银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯J和白果内酯用甲醇溶于相同的容量瓶作为标准溶淮；c)依据HPLC方法检测，将标准品和供试品分别进样并记录谱图，银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯的量可通过每个图谱外标法计算得到，总萜内酯的含量为它们之和。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于其中以所述的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯单体作为标准品以测定银杏组合物中萜内酯的含量。
全文摘要
本发明涉及由银杏叶提取得到的组合物，特别是涉及鉴定和定量分析由银杏叶提取得到的组合物中的黄酮、萜内酯、银杏酸、总黄酮、黄酮醇苷的方法。
文档编号G01N30/90GK1508542SQ20031011851
公开日2004年6月30日 申请日期1999年3月19日 优先权日1998年3月19日
发明者谢德隆, 王宁, 高崎, 张国安, 邵宝平, 金小吾, 黄新生 申请人:上海杏灵科技药业股份有限公司