专利名称：幽门螺杆菌尿素酶血清抗体快速诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用胶体金双抗原夹心法制备的幽门螺杆菌尿素酶血清抗体快速诊断试剂盒。
现有技术幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病因子，在胃癌的癌变模式中也起着先导作用，胃癌的发生与幽门螺杆菌感染的时间长短具有直接关系。1994年，世界卫生组织国际癌症研究机构正式将幽门螺杆菌列为I类(即肯定的)致癌源。我国人群Hp菌感染率高达50％左右，每年有1200万的新增感染人群。以往诊断Hp感染常用胃粘膜组织病理学检查、胃粘膜组织Hp菌培养和采用13C、14C呼吸试验以及14N排泄试验。病理组织学检查及细菌培养除要求较高的试验条件外，尚要以接受胃镜检查为前提，不能被广泛应用，复查时更不易被病人接受；呼吸试验和尿素排泄试验虽具有灵敏和特异的特点，但因价格昂贵，不利于临床上推广普及。二十世纪八十年代末，国内建立了Hp血清抗体检测方法，但因采用Hp全菌抗原、Hp全菌超声破碎抗原、酸提取抗原和高分子量相关抗原等，明显存在因交叉反应所造成的假阳性和因菌株间抗原性差异而造成的假阴性，可靠性较差，以致某些临床单位出现对胃炎及消化性溃疡病人不经进一步诊断而盲目开展抗Hp菌治疗的趋势。二十世纪九十年代，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所发明了人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体体外检测试剂盒(申请号95108003.2，公开号CN1140257A)，该发明采用酶联免疫法，用Hp尿素酶抗原包被酶标反应板，其酶标抗体为HRP-SPA。该方法虽在一定程度上弥补了过去Hp血清抗体检测方法的缺陷，但仍存在一些出于该方法本身的缺陷，而无法解决的问题，如只能检测血清中的IgG抗体、时间长(2-3小时)、步骤多(2-3步)、需特殊仪器(酶联检测仪)、保存时间短(3个月)、须同时操作多人份血清、病人获得检测结果时间长等。
本发明旨在为临床诊断Hp感染、开展抗Hp感染治疗的随访以及Hp感染的流行病学调查提供一种灵敏、快速、特异的诊断试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供用于Hp菌患者血清抗体快速诊断的试剂盒产品，该试剂盒以幽门螺杆菌尿素酶为抗原，基于膜免疫层析的原理，采用胶体金双抗原夹心法来制备。
该试剂盒包括粘贴于检测板条上的检测膜，试剂垫和吸收垫，其特征在于检测膜上包被有Hp菌尿素酶抗原、试剂垫包被了胶体金标记的Hp菌尿素酶抗原。
该产品可同时检测血清中IgG、IgM型抗体和唾液等分泌物中的IgA型抗体；具有灵敏度高、特异性强、操作简便、无需专用的仪器和设备、结果直观等特点。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法，包括A、Hp菌尿素酶抗原的制备；B、喷膜，将抗原喷涂到硝酸纤维素膜上；C、标记，用胶体金标记抗原；D、组装，在检测板条上组装检测膜、试剂垫、吸收垫；E、切条，用切条机切成小条；F、成品，将小条放入扣盒中，并密封。
本发明的实施方式(一)、Hp尿素酶抗原的制备细菌培养将Hp菌株接种于含10％脱纤维羊血的布氏琼脂平皿中置混合气体(5％氧气，10％二氧化碳，85％氮气)环境中，37℃培养三天后收菌。
细菌破碎及预处理将收集的Hp菌用生理盐水洗涤一遍后，用凝胶过滤洗脱液(0.05M Tris-Cl，pH0.8，含0.005％的硫柳汞)将菌稀释至适当浓度(约14亿菌/ml)，经超声破碎(在冰浴下进行)后，高速离心(12000rpm，30’)后取上清备用。
凝胶过滤过程及洗脱峰尿素酶活性检测凝胶过滤介质选用Sephacryl S 300(Amerson-Pharmacia公司产品)，柱型2.6×75cm，抗原上柱体积15-30ml，洗脱液为0.05M Tris-Cl，pH8.0，洗脱速度为16滴/分钟，收集、检测及记录自动进行，每管收集50滴，每隔5管测定一次尿素酶活性，尿素酶试剂由本公司配制。
尿素酶提纯效果分析将凝胶过滤后尿素酶活性峰成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察尿素酶提纯效果。SDS-PAGE按参考文献进行，浓缩胶采用5％浓度，分离胶采用11％浓度，电泳采用Tris-甘氨酸缓冲系统，凝胶经考马斯亮兰R-250染色，收集高纯度部分备用。
纯化尿素酶成分抗原性Western-blot分析将纯化的尿素酶成分，经SDS-PAGE电泳后，将各蛋白转移到硝酸纤维素膜(简称NC膜)上，NC膜经5％脱脂奶粉封闭过夜后，放入1∶50稀释的兔抗Hp抗血清中，室温震荡2小时，用0.05％Tween20-TBS洗NC膜三次后，浸泡NC膜于1∶200稀释的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)中，室温振荡2小时，用Tween20-TBS洗NC膜三次后，用底物显色液(6mg 4-氯-1-萘酚溶于2ml冷甲醇，与含6ul 30％H2O2的10ml TBS混合)浸泡待检NC膜，室温震荡10-30分钟，观察其抗原性，将抗原性良好的尿素酶成分用于试剂盒用抗原。纯化后的抗原保存于-20℃以下。
(二)检测膜的喷涂与处理将硝酸纤维素膜(孔径为8um)平放于BioDot X-Y喷涂仪上。将纯化的尿素酶抗原用PBS稀释为1mg/ml，加入试剂瓶中。设程序为尿素酶喷涂程序(生物喷头，线状，角度0，速度50cm/秒，频率150Hz，开放时间4％，X0＝0，Y0＝3.5mm，长度30mm，高度2mm，压力4psi)，喷涂。将膜置于室温晾干后放入干燥箱待用。
(三)、胶体金的制备和标记采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金。取750ml去离子水在快速磁力搅拌条件下加热至95℃。加入7ml 1％的四氯化金溶液，继续在快速搅拌中煮沸5分钟。而后，加入8.4ml的1％的枸橼酸钠溶液，并在剧烈搅拌中煮沸5分钟。将经枸橼酸钠还原的四氯化金(胶体金)溶液移至冷水中，快速搅拌中冷却30分钟。用分光光度计分别测定溶液在波长540nm的吸光值。OD540必须在0.9-1.2之间。
用100mM的碳酸钾溶液将上步所获的胶体金溶液的pH调至6.5。取250ul胶体金溶液，加入1mg/ml的尿素酶抗原1ul，混匀后加入27.5ul 10％NaCl并观察颜色反应。遇有颜色变紫，则加大尿素酶抗原用量至不再出现颜色反应为止。
按照试验所得尿素酶标记量，计算出所标记液体的尿素酶总需求量。在快速搅拌的条件下加入尿素酶溶液。在室温下搅拌30分钟后加入2％的牛血清白蛋白，并继续在室温下搅拌15分钟。而后，将溶液置于4℃下离心1小时，离心力为10000g。小心弃去上清，尽量避免搅动沉淀物。加入42ml 100mM Na2HPO4，pH7.4，其中含2％牛血清白蛋白。重新悬浮沉淀物后，在4℃离心20分钟，离心力10000g。弃去上清，保留沉淀物。用42ml含2％牛血清白蛋白的10mM的Na2HPO4重新悬浮沉淀物。用0.22μm的硝酸纤维膜过滤除菌后存放于4℃，备用。
(四)、试剂垫的制备试剂垫(玻璃纤维膜)是检测板条上存留胶体金标记尿素酶试剂的部位，将制备好的胶体金溶液均匀喷涂在试剂垫上，晾干后切成30×1.4cm的窄条备用。
(五)、检测板条的制作取具有粘性表面的8×30cm塑料薄板，将检测膜贴于距薄板顶端3cm处。然后在检测膜上端贴一3×30cm的厚滤纸条构成吸收垫，在检测膜下端贴试剂垫。试剂垫下端贴无胶体金标记尿素酶的玻璃纤维，各条之间重叠1mm，制作好的长板用切割机切成8×0.4cm的窄条，即为检测板条。
(六)、诊断试剂盒的组装将切割好的板条放入专用的塑料盒中，再将塑料盒放入铝箔袋内。加入1g的袋装干燥剂和一次性滴管后，以热压封口并打印生产日期。完整的试剂盒包括试纸条、工程塑料扣盒、干燥剂、一次性滴管、使用说明书。
(七)、阳性对照血清选用抗幽门螺杆菌尿素酶阳性血清，置-20℃以下保存。
(八)阴性对照血清
选用抗幽门螺杆菌尿素酶ELISA法检测为阴性的5份以上正常人血清混合，置-20℃以下保存。
(九)血清标本检测加100ul待检血清于诊断试剂盒的样品孔内。过20分钟后观察结果1、当检测尿素酶阳性血清时，检测膜上出现红色条带。
2、当检测尿素酶阴性血清时，检测膜上不出现红色条带。
本发明优点其尿素酶抗原来源于国内人群感染的菌株，具有中国人群特异性。
采用双抗原夹心法，灵敏度高，特异性强。可同时检查血清中抗Hp尿素酶IgG、IgM、IgA抗体。Hp感染的早期往往只有IgM的产生，因此，单纯检查IgG，必然会造成感染早期病人的漏检；由于可同时检查IgA，因此，对样本的选择范围较宽，如可用于唾液标本。
采用胶体金技术，结果直观(肉眼观察)、快速(10-20分钟出结果)。
采用胶体金技术，操作简便，无需专用仪器和设备，1人份即可独立检测，也可多人份操作。
采用胶体金技术，操作简便，可用于床旁检验，复检极为方便。血清学检查，为无创伤性检查，患者无痛苦，尤其适合于儿童检查。
权利要求
1.一种用于Hp菌患者血清抗体快速诊断的试剂盒产品，其特征在于该试剂盒以幽门螺杆菌尿素酶为抗原，基于膜免疫层析的原理，采用胶体金双抗原夹心法来制备。
2.根据权利要求1的试剂盒产品，该试剂盒包括粘贴于检测板条上的检测膜，试剂垫和吸收垫，其特征在于检测膜上包被有Hp菌尿素酶抗原、试剂垫包被了胶体金标记的Hp菌尿素酶抗原。
3.权利要求1或2的试剂盒产品的制备方法，包括Hp菌尿素酶抗原的制备；喷膜，将抗原喷涂到硝酸纤维素膜上；标记，用胶体金标记抗原；组装，在检测板条上组装检测膜、试剂垫、吸收垫；切条，用切割机切成小条；成品，将小条放入扣盒中，并密封。
4.根据权利要求3的制备方法，其中Hp菌尿素酶抗原的制备包括细菌培养；细菌破碎、离心和提取上清。提纯；纯化尿素酶成分抗原性Western-blot分析，选择抗原性良好的尿素酶成分用于试剂盒用抗原。
全文摘要
本发明涉及用于Hp菌患者血清抗体快速诊断的试剂盒产品，该试剂盒以幽门螺杆菌尿素酶为抗原，基于膜免疫层析的原理，采用胶体金双抗原夹心法来制备。
文档编号G01N33/569GK1554949SQ20031012241
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者马运国 申请人:深圳市康美实业发展有限公司