专利名称：一种新的肝纤维化诊断设备及方法
技术领域：
本发明涉及一种新的肝纤维化诊断设备及方法，具体讲涉及用于肝纤维化诊断的反射荧光显微镜特殊荧光激发装置及相应的肝纤维化诊断方法。
背景技术：
肝纤维化是慢性肝病必然的病理过程。肝炎是一种在世界范围内，尤其在东亚、东南亚地区发病率很高的传染病，全球约有3亿人为肝炎患者。我国是肝炎病的高发区，每年大约有200万急性肝炎病例，其中甲型肝炎占半数(50％)，乙型肝炎占20-25％，丙型肝炎占5-10％，戊型肝炎约占10％。中国乙型肝炎病毒的总流行率为59.17％、感染率为57.6％、携带率为9.8％，农村高于城市，南方多于北方。
我国目前大约有现症的慢性乙型肝炎约3000万人。慢性肝炎的危害之一是通过血液将乙肝传染给他人，二是导致肝纤维化发生。轻度慢性肝炎约65％有纤维化，中、重度慢性肝炎则100％有纤维化。近年来，全球范围内，包括我国脂肪肝的发病呈不断上升趋势，据统计其发病率占人口总数的10％，肥胖者和糖尿病患者的50％，嗜酒者的57.5％，无论是酒精还是非酒精性脂肪肝，肝纤维化发生率均高达25％，且其中1.5％～8％的患者可发展为肝硬化。
近几十年来，尽管肝炎的总体死亡率有所下降，但肝炎本身尚缺乏有效的根治治疗措施。据中国疾病控制中心(CDC)2002年资料，慢性活动性肝炎82％在5年内发展成为肝硬化，死亡率高达45％。而失代偿肝硬化患者的5年生存率仅为15％。因此，尽早防治肝纤维化对延长我国人均寿命以及对肝病防治具有重要意义。肝纤维化是肝病病理过程一个可逆性病理过程，而肝硬化则不可逆。因此，早期诊断及防治肝纤维化是改善肝病患者预后的关键措施之一。
肝纤维化是肝病愈合过程中一种复杂动态的可逆性病理过程，以肝星状细胞的激活、分泌过量细胞外基质为特征。目前在世界范围内，肝纤维化诊断还主要基于病理诊断、血清学诊断、以及影像学检查。其中肝组织病理学诊断被认为是肝纤维化评价的“金标准”。该诊断方法主要是利用肝穿刺病理标本胶原染色后进行图像分析，以实现对肝纤维化程度的半定量评价。但染色过程、染色剂性质显然影响结果的客观判定。
自上个世纪临床及科研人员一直致力于肝纤维化诊断更客观诊断方法研究。1979年，Rohde等首先建立血清胶原代谢产物P IIIP的放免测定法，但该放免试剂盒的抗原取材于动物胎皮，价格十分昂贵)。Galambos等于1985年建立了胶原代谢产物PC III放免测定法。随后IV型胶原、层粘联蛋白、纤维连接蛋白等一系列列ECM代谢产物被用于肝纤维化诊断。酶类中应用最多的是脯氨酰羟化酶、脯氨酸肽酶、基质金属蛋白酶等。细胞因子中以两个与肝纤维化发生关系最为密切的细胞因子TGF-β及PDGF最为常用。这些血清学标志物检查一个共同的缺陷是其升高状态与肝纤维化程度不完全一致，诸如炎症时也升高。而在肝硬化状态下，胶原代谢减慢时这些指标可能呈正常水平，但该病理阶段却是肝纤维化最严重的病理阶段---肝硬化。
1960s年代超声检查即用于弥漫性肝病诊断，但迄今为止，包括核磁共振(MRI)、计算机X线断层摄影术(CT)等在内的检查方法，虽然属于无创伤性检查，能对包括肝纤维化在内弥漫性肝病的严重程度进行某种程度的判断，尤其仅仅限于对肝纤维化晚期或肝硬化的诊断。其准确性、敏感性也都不足以实现对肝纤维化程度的早期、客观判定。且价格昂贵，难以用于临床普查、诊断。
自1994年Chevallier等首次提出基于肝组织形态结构与数量相结合的半定量评分系统以来，这一纤维化评价方法几经完善已经逐步成为国际上所普遍接受的“金标准”。但该评价方法的先决条件需要首先对肝组织胶原成分进行不同染色。因此不可避免地导致诊断过程中有诸多人为因素的干扰。
中华肝脏病学会为了便于肝纤维化临床诊断及科研评价，于2002年5月在上海专门召开了开“肝纤维化组织学诊断标准及疗效评估”专题研讨会。会上就肝纤维化诊断一系列问题达成了初步共识。该共识要求肝纤维化诊断需常规进行一系列染色(苏木精-伊红、网状纤维和/或Masson三色染色)，显然增加了诊断的准确度及敏感性，但同时也增加了诊断时间、人力及物力成本。
早在1924年Policard即在大鼠肉瘤模型上观察到恶性肿瘤组织在紫外光激发下呈现红色内源性荧光，认为这是肿瘤受细菌感染产生的内源性卟啉所致。上世纪60年代，荧光显微镜已经开始用于肿瘤病理诊断。70年代末Profio等首次报道利用氪离子激光诱导的荧光支气管镜进行肺癌的早期诊断，预先注射血卟啉衍生物后，甚至可以检出浸润深度为0.1mm的肺癌。近年来荧光组织化学特别是免疫荧光技术有了迅速发展，广泛地用于细胞内化学成分的分布与定位。晚近，Gill等对人类宫颈组织胶原固有荧光强度与经期形成之间的关系进行了观察。结果显示，与绝经前期相比，绝经后宫颈胶原组织平均固有荧光强度显著增加。认为子宫胶原组织含量的增加是绝经的原因之一。荧光诊断法较一般光学方法具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点，而越来越广泛地被用于临床病理诊断。新加坡研究人员发现，当激发光谱在220nm-280nm之间，发射光谱在280-700nm之间，膀胱癌组织与正常膀胱组织之间固有荧光光谱差异最为显著。对膀胱癌诊断敏感性达100％。Tadrous等利用荧光寿命成像技术对对乳腺良、恶性肿瘤组织(固定，未染色标本)固有荧光光谱进行了观察。发现在415nm激发光谱状态下，肿瘤组织间质与良性病变间质荧光强度存在显著性差异。过高的激发波长(510-590nm)则有助于嗜伊红细胞颗粒的观察，而组织固有发射荧光呈深红(＞605nm)，显然不利于胶原组织固有荧光观察。同期，Andersen等对鳕鱼和大麻哈鱼肌肉、胶原固有荧光光谱特征进行了观察，发现I、IV型胶原组织固有荧光光谱峰分别位于390、430以及450nm处。Drezek等认为，380nm激发波长所导致的良、恶性宫颈组织之间固有荧光光谱强度的差异主要是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所致；而460nm激发波长所致的固有荧光光谱的差异主要是胶原组织产生。
发明内容
本发明的目的是克服核磁共振(MRI)、计算机X线断层摄影术(CT)等检查方法价格昂贵且准确性、敏感性低的缺陷，同时也克服了肝纤维化诊断常规进行的需要一系列染色而增加的诊断时间、人力及物力成本的缺点，将肝组织固有荧光光谱特征用于肝纤维化诊断，提供一种新的肝纤维化诊断设备及方法。采用新的肝纤维化诊断设备及方法即该显微镜诊断系统中特殊激发光波长(300nm-460nm)由特殊荧光激发块产生，照射经过简单处理的肝组织标本，则可产生胶原组织特征性固有荧光，籍此做出肝纤维化程度的诊断。
根据发明人目前的研究结果，300nm-460nm之间激发波长，其肝组织固有荧光光谱具有细胞外基质特异性，能良好地显示细胞外基质胶原成分的分布。在波长范围380nm-460nm的激发下，肝组织固有荧光谱主要由胶原组织产生。
本发明采用的技术方案是一种新的肝纤维化诊断设备，它包括反射荧光显微镜、荧光激发块；把所述特殊激发波长(300nm-460nm)的荧光激发块放在现有反射荧光显微镜的荧光组件室内荧光组件的位置上。它能产生特定波长的激发光，照射离体肝脏组织。在特定激发光波长照射下，肝脏胶原成分发出特征性固有荧光。而经过半定量图像分析处理后能精确地反映肝纤维化程度。不同激发光波长(不同滤光片)激发下，组织胶原分布特征存在差异。
本发明首次将肝组织固有荧光光谱特征用于肝纤维化诊断。本方法要点包括利用肝穿刺组织标本在未经任何化学特殊染色的情况下，直接给予胶原特异性激发光谱直接激发离体肝组织，利用荧光显微镜的特殊荧光激发块系统观察肝组织固有荧光特征，而做出肝纤维化程度的诊断。该新的诊断方法包括特殊荧光激发块，该激发块与现有荧光激发块相比，具有较低的激发光波长范围(300nm-460nm)及较窄的激发光波长范围，诸如20nm(每个激发块激发波长范围可在300nm-460nm之间的任何一段波长之间)。
特殊标本处理方法用于肝纤维化诊断的肝组织切片是未进行任何染色的肝组织切片。
肝纤维化诊断系统是针对肝组织切片(冰冻切片、石蜡包埋切片)，在未经过任何化学染色或荧光标记的情况下，在较低波长(300nm-460nm)滤光片，或其他相应光源(波长)的激发光激发后所产生的肝组织固有荧光。
进一步地，所述肝纤维化诊断系统包括任何借助于该波长范围(300nm-460nm)及肝组织标本的固有荧光特征，进行肝纤维化程度判定。
进一步地，所述肝纤维化诊断系统还包括任何针对离体肝组织标本处理后的标本(如肝组织混悬液及其成分)，基于其固有荧光光谱特征的肝纤维化诊断系统。
本发明的优点在于它是一种全新的肝纤维化诊断技术、设备及方法。该诊断系统的特征和优点是目前国内外肝纤维化诊断设备所没有提供的。基于特殊激发波长(300nm-460nm)的荧光激发块及简单的标本处理过程，可以迅速、客观、准确地做出肝纤维化程度的诊断。与现有肝纤维化诊断设备比较，对纤维化程度的诊断具有显著缩短了诊断时间、降低了诊断过程中人力、物力成本消耗的优点。与Van Gieson特染比较，除能显示纤维间隔胶原分布外，更能清晰地显示基底膜胶原成分含量的变化。更便于肝纤维化早期诊断。
图1为现有反射荧光显微镜示意图。1为主开关，2为样品夹，3为荧光组件室。
图2A、图2B为荧光组件室的剖面图。4为荧光激发块，31为模型板。
图3A是慢性肝炎患者(病理G3S2)HE染色肝组织标本(10×)。
图3B是同一标本在紫外光(330nm-380nm)激发下肝组织故有荧光分布特征(10×)。其篮绿色荧光分布与肝组织胶原分布一致。
图3C是肝硬化患者(纤维化分期G4S4)常规脱蜡水化后未经任何染色的组织切片在普通光镜下表现(10×)。
图3D是同一未染色标本在蓝光激发下，肝组织胶原成分故有荧光分布特征(10×)。绿色荧光分布与纤维间隔分布高度一致。
图4A是慢性肝炎患者(纤维化分期G3S3)Van Gieson胶原染色(20×)胶原分布特征。
图4B是同一标本在蓝光激发下，肝组织胶原成分故有荧光分布特征(20×)。与单纯VG胶原染色相比，故有荧光特征更清晰地显示肝内胶原成分分布状态。
具体实施例方式
下面结合
本发明的实施方式。
本发明是在现有的反射荧光显微镜(图1)上，使用六角改锥，松开垂直照明装置右侧的固定螺丝。把荧光组件室3拉出。在荧光组件位置中(图2A)安装有模型板31。用六角改锥放松固定螺丝，取下模型板。拿住要安装的荧光激发块4(图2B)，对齐后，按箭头方向推进燕尾接口座架中。然后拧紧荧光组件固定螺丝。把荧光组件室装回原来位置，推入后，拧紧垂直照明装置右侧的固定螺丝。
本诊断方法按照下述步骤操作1.将特殊荧光激发块装入荧光显微镜，替换现有荧光激发装置。以实现选择激发光波长的目的。在胶原组织特异性波长激发下，通过荧光显微镜直接观察肝组织胶原分布特征。
2.用于胶原成分观察的肝组织切片，为肝穿刺福尔马林固定标本，经过常规脱蜡、水化处理。无需进行任何化学染色，也可利用冰冻切片标本。
3.通过现有常规病理图像分析系统即可直接进行胶原半定量分析，而做出肝纤维化程度的诊断。
因目前国内外市场供应的反射荧光显微镜荧光激发块激发光谱多较宽(如330nm-385nm)。而基于现有公认的研究结果，不同胶原组织成分(I、III、IV型胶原)最佳激发波长在300nm-460nm之间，针对该波段较窄波段的荧光激发块显然对肝纤维化诊断具有特异性。目前荧光激发块的制造国内外均有成熟的工业生产技术，不存在任何技术上的难题。供应商可以提供较窄波段荧光激发块，如特殊激发波长(300nm-385nm、450nm-460nm、)的荧光激发块。根据目前发明人的研究结果，400nm-460nm波长荧光激发块对肝纤维化诊断更具有特异性。
临床实施例标本取自北京地坛医院近两年来住院患者，具有完整的肝穿刺及血清学采集标本留置者共计49例。其中男32例，女17例。年龄21-67岁，平均48.9岁。病程2-17年，平均4.7年。HBV感染44例、HCV感染4例、自身免疫性肝炎1例、1例为肝硬化合并肝癌患者(HBV感染)。病理分期S1(急性肝炎患者)11例，S2(慢性肝炎患者)16例，S3(慢性肝炎患者)12例，S4(肝硬化患者)10例。肝组织固有荧光光谱观察采用Olympus BX50荧光显微镜。激发光滤光器选择BP 330-385(荧光激发块分别选用U-MNU2及U-MWU2两种)、BP 450-480(荧光激发块U-MWB)。所有患者肝穿刺标本均为连续切片，切片厚度3-10μm。标本常规脱腊水化完成后直接进行固有荧光观察。肝组织胶原染色采用VG染色。图像分析软件采用CMIAS病理图像分析系统。计算单位目标阳性面积(VG染色与固有荧光)差异，及光密度差异。计量资料以X±SD表示，组间差异采用ANOVA分析。P＜0.05认为有统计学差异。分析软件采用SPSS 10.0版。
临床结果肝组织固有荧光分布特征如图3所示，在紫外光(330nm-385nm)激发下肝组织胶原成分呈现蓝绿色荧光。固有荧光分布与细胞外间质成分分布一致。在蓝光激发下，细胞外基质成分呈现绿色荧光。图像分析结果如表1所示。
肝组织特种染色及肝纤维化诊断如图4所示，与常规VG染色相比，在紫外激发下，肝组织固有荧光分布与VG染色结果高度一致，但更能清晰地显示基底膜胶原组织结构。图像分析显示，肝组织固有荧光与VG胶原染色对肝组织纤维化程度的判定无差异。均能良好地反应肝纤维化程度。二者之间具有良好的相关性。根据表1所述的资料，该波长范围的荧光激发块对肝纤维化的诊断特异性与常规Van Gieson染色结果相同。
表1肝组织纤维化程度图像分析结果
注组间比较P均大于0.05。
权利要求
1.一种新的肝纤维化诊断方法，其特征在于利用肝穿刺组织标本在未经任何化学特殊染色的情况下，直接给予胶原特异性激发光谱直接激发离体肝组织，利用荧光显微镜的特殊荧光激发块系统观察肝组织固有荧光特征，而做出肝纤维化程度的诊断；所述的特殊荧光激发块激发光波长分布在较低范围300nm-460nm之间内，所述的用于肝纤维化诊断的肝组织切片是未进行任何染色的肝组织切片；所述的肝纤维化诊断系统是针对肝组织切片包括冰冻切片、石蜡包埋切片，在未经过任何化学染色或荧光标记的情况下，在较低波长范围300nm-460nm之间的滤光片，或其他相应光源的激发光激发后所产生的肝组织固有荧光。
2.如权利要求1所述的一种新的肝纤维化诊断方法，其特征在于所述的肝纤维化诊断系统包括任何借助于该波长范围在300nm-460nm之间及肝组织标本的固有荧光特征，进行肝纤维化程度判定。
3.如权利要求1所述的一种新的肝纤维化诊断方法，其特征在于所述的肝纤维化系统还包括任何针对离体肝组织标本处理后的标本，基于其固有荧光光谱特征的肝纤维化诊断系统。
4.一种实施权利要求1的新的肝纤维化诊断方法的装置，它包括反射荧光显微镜，其特征在于把所述特殊激发波长范围在300nm-460nm之间的荧光激发块放在所述反射荧光显微镜的荧光组件室内荧光组件的位置上。
全文摘要
本发明公开了一种新的肝纤维化诊断方法，它利用肝穿刺组织标本在未经任何化学特殊染色的情况下，直接给予胶原特异性激发光谱直接激发离体肝组织，利用荧光显微镜系统观察肝组织固有荧光特征，而做出肝纤维化程度的诊断。它基于特殊激发波长范围在300nm－460nm之间的荧光激发块及简单的标本处理过程，可以迅速、客观、准确地做出肝纤维化程度的诊断。与现有肝纤维化诊断设备比较，对纤维化程度的诊断具有显著缩短了诊断时间、降低诊断过程中人力、物力成本消耗的优点。它涉及用于肝纤维化诊断的荧光显微镜特殊荧光激发装置及相应的标本处理方法领域。
文档编号G01N21/64GK1556395SQ20041000022
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日 优先权日2004年1月8日
发明者魏红山 申请人:北京地坛医院