专利名称:快速检测尿中的hiv抗体的装置及检测方法
技术领域:
本发明涉及免疫化学和生物化学分析方法,提供了一种用于快速检测尿液内源性抗体(特别是针对HIV病毒包膜蛋白的特异性抗体)的装置和方法。其它能引起尿液内源性抗体升高的病原体,包括目前已知的性传播疾病的病原体,也可以使用通过本发明检测。
背景技术:
目前已经有许多种侧向流检测方法应用于检测像血液或尿液等体液中的各种物质。这些检测方法包括抗原抗体反应,与酶、荧光物质或可视标记物交联的合成物,特殊设计的反应室。在大多数这类检测方法中,有一个特异针对特定抗原的受体(如抗体),以及一套检测抗原-抗体复合物出现和/或达到一定量的手段。这种检测设计多为一种定量检测,但是在很多情况下只需要得到阳性/阴性的结果。这种定性检测的例子包括血液分型,早孕检测和其它一些尿液检测。在定性检测中,优选出现可视的标记物,比如出现凝集或颜色改变。
阳性/阴性的检测必须非常敏感,因为在待测液体中目的配体的浓度往往很低。错误的阳性将会产生麻烦,特别是凝集实验和其它快速检测手段,如沾棒(dipstick)和颜色改变实验。针对这些问题,发展了夹心法和使用金属溶胶或其它有色颗粒的敏感检测手段,然而这些手段并没有解决快速检测方法中遇到的所有问题。现在仍需要既敏感又特异性的检测体液中低浓度靶物质的方法,如检测尿液中针对病原体的内源性抗体。
发明内容
本发明提供了一种用于快速检测尿液内源性抗体,特别是针对HIV病毒包膜蛋白的特异性抗体的装置和方法。发明者发现,在升高pH值的情况下,可以获得比现有方法更高的敏感性和选择性。相应的,在本发明的一个实施例中提供了一种侧向流方法来检测尿液中靶抗体的检测装置,该装置包括能特异性结合靶抗体的抗原和在接触尿液时能使溶液pH值至少达到8的包含缓冲液的样品区。实施例中的缓冲液可以含有碳酸盐,也可以含有碳酸盐和重碳酸盐。优选的装置中的缓冲液中的碳酸氢钾和碳酸钾的摩尔比为2∶1。
上述实施例的抗原可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白。HIV可以是HIV-1,也可以是HIV-2。在该实施例中,不只可以使用一种抗原,还可以是HIV-1和/或HIV-2的多抗原。在该实施例中,蛋白抗原还可以是重组的。优选的HIV蛋白是包膜蛋白,蛋白也可以是HIV-1的gp120或gp41或HIV-2的gp36的非天然肽,这些肽具有序列表SEQ ID No.1-5所述的氨基酸序列。优选的则包括含有序列表SEQ ID No.1-5所述的多肽中的一个和/多个的组合的多个HIV蛋白。在该实施例中,抗原可以被生物素标记物,并且通过抗生物素蛋白-或亲和素-生物素链接物连接到装置的基质上。
在上述实施例中,样品区可以含有鸟类血清,优选鸡血清。还可以包括有交联区,它含有和标记物交联的标记试剂。优选的标记试剂为蛋白G,更优选的为蛋白A。优选的标记物为胶体金。在上述实施例中还可以包括含有捕获试剂的对比区。优选的捕获试剂包括抗人IgG的抗体,更优选的抗人IgG抗体为羊抗人IgG抗体。
本发明的另外一个实施例为使用侧向流方法检测尿液中抗体的装置,该装置含有(a)交联区含有蛋白A/胶体金交联物;(b)对照区含有捕获试剂,其中捕获试剂与人尿液中抗体、蛋白A/胶体金交联物结合的能力大于蛋白A与人尿液中抗体、蛋白A/胶体金交联物的结合能力。如前述实施例一样,捕获试剂是抗人IgG的抗体,优选为羊抗人IgG抗体。本实施例还可以增加由pH至少为8的缓冲液和与目标抗体特异性结合的抗原组成的样品区。本实施例优选的缓冲液包括碳酸盐和/或重碳酸盐,优选它们的钾盐或铵盐。本实施例的缓冲液中可以包括摩尔比为2∶1的重碳酸钾和碳酸钾。
上述实施例的抗原可以是人免疫缺陷病毒蛋白。HIV可以是HIV-1,也可以是HIV-2,这取决于选择哪一个具体应用。也可以使用HIV-1和/或HIV-2的多抗原。在一些实施例中,抗原是包膜蛋白,另一些实施例中抗原是从SEQ ID NO1-5中挑选的。如前实施例所述,这些抗原可以是从自然中分离的或重组表达获得。上述实施例也可以包含鸟类血清的样品区,优选鸡血清。
该发明的上述两个实施例,以及这些实施例的所有可行方式,都以试剂盒的形式提供,并在包装中附带一项或多项补充条款,象这里描述的一样。
本发明的再一个实施例是从病人尿中检测抗体的方法,该方法包括将样品加到侧向流装置的样品区,其中样品区的缓冲液pH值至少为8。该方法还可以使用和前两个实施例相同的缓冲液和抗原。
本发明还有一个实施例也是从病人尿中检测抗体的方法,该方法包括将样品加到侧向流装置的样品区,该装置由结合区和对照区组成,结合区含有蛋白A/胶体金交联物;对照区包括捕获试剂,其中捕获试剂与人尿液中抗体、蛋白A/胶体金交联物结合的能力大于蛋白A与人尿液中抗体、蛋白A/胶体金交联物的结合能力。在抗体、抗原和缓冲液方面,该实施例与前面的实施例基本一致。
具体实施例方式
本发明提供的装置和方法适合于快速检测尿液内源性抗体,特别是直接针对HIV病毒包膜蛋白的抗体。其它引起尿液内源性抗体升高的病原体,如性传播疾病和感染性疾病的病源,也可以使用本发明进行检测,例如衣原体、疱疹病毒、淋病、梅毒、幽门杆菌、甲肝、乙肝、丙肝、EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、疟疾、流感、西尼罗河病毒、风疹、登革热、莱姆病、查格斯病,结核病、弓浆虫病、埃博拉病毒等。使用合适的缓冲液使尿样pH保持在8或更高,因为在低pH值时无法正常检测。尿样pH保持在8或更高时,本发明的灵敏度和特异性显著提高,所标记的可视信号比低pH时显著增强。本发明提供了一个比目前检测方法更准确的技术。
本发明提供的装置和方法是经济的,因为在免疫测定中尽量使用低成本的试剂,比如非特异性抗体结合蛋白如蛋白A、蛋白G或血凝素。在工作中发现一项令人惊奇的情况可以检测到在本发明的免疫复合物中存在一分子这类抗体结合蛋白。
本发明的化验装置包括一系列不同的区带,这些区带所包含的试剂不同,操作时分别在不同的区带进行反应。这些区带可以是一个连续基质的不同部分,或分别附着在分离的垫上,通过垫的吸附使液体流动。
为了更加容易理解本发明中的术语,以下提供了一些术语的定义I定义“分析区”是指液体流经区域,包括特异结合被检尿液中内源性目标抗体的固定抗原。抗原特异性结合目标抗体使目标抗体和与之相连的任何分子滞留在分析区。
“抗原”指进入哺乳动物或鸟类时刺激其产生抗体的物质。因此,抗体识别和特异性结合激发其产生的抗原。本发明的优选抗原包括人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白,特别是病毒包膜蛋白HIV-1的gp120和gp41,HIV-2的gp36。本发明中的抗体是在与病人不同的物种中使用目标抗体刺激产生的,因此病人尿液中的内源性目标抗体也是本发明中抗体所识别的抗原。比如,人尿液中的目标抗体是由非人物种产生的抗人抗体特异识别的抗原。
“抗体”指由免疫球蛋白基因或片断编码的、特异性结合和识别抗原的多肽。目前已知的免疫球蛋白基因包括κ,λ,α,γ,δ,ε和μ恒定区基因和无数的可变区基因。轻链又分为κ或λ,重链分为γ,μ,α,δ或ε,它们决定免疫球蛋白的种类分别为IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆。
抗体以两种形式存在完整的免疫球蛋白或经多种肽酶消化产生一定结构的片断。例如,胃蛋白酶消化抗体后,在二硫键下方绞链区切断抗体产生F(ab)’2(Fab的二聚体),Fab由轻链通过二硫键与VH-CH1连接。在温和的条件下可以打断绞链区的二硫键降解F(ab)’2二聚体使之变为Fab’单体。Fab’单体主要由Fab和部分绞链区组成(见Fundamental Immunology,Paul ed.,3rded.,1993))。通过消化完整抗体区别不同的抗体片断或抗原结合片断,本领域的技术人员可以使用化学方法或者DNA重组技术合成来重新合成这些片断。因此,抗体的定义,应包括对整个抗体修饰后产生的抗体片断,或者使用DNA重组技术重新合成的片断(如单链Fv)或由噬菌体展示文库产生的抗体(见McCafferty et al.,Nature,348552-554(1990)和Zapata et al.,Protein Eng.8(10)1057-1062 )。本发明中的抗体可以是多克隆或单克隆的。制备这些抗体的技术是本领域公知常识(参见Kohler and Milsten,Nature,256495-497(1975);Kozbor et al.,ImmunologyToday,472(1983);Cole et al.,pp.77-96 Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,Inc(1985);美国专利,4,946,778)。
“目标抗体”指被测尿液中的内源性抗体,通过本发明提供的装置可以检测到。目标抗体可能是如上所述的抗体片断,但更多是含有功能可变区和恒定区的整个免疫球蛋白。目标抗体的功能可变区特异性的结合相应的抗原,而功能恒定区则与抗目标抗体的抗体(如二抗)特异结合,或与蛋白A或G或其它与目标抗体特异结合族发生特异结合。
“吸水的”指在液体通过吸附物质时,吸附物质支持不同溶质迁移的能力。因此吸水的吸附物质能够根据溶质的物理/化学性质进行层析分离。
“捕获试剂”指能与目标抗体特异结合的任何分子。本发明的捕获试剂优选的以确定模式固定到介质上,通常与流经途径垂直。优选的捕获试剂是抗目标抗体的抗体、蛋白A和蛋白G。
“胶体金”指细小的金颗粒溶胶,以不确定的水悬液形式存在。
“蛋白A”指由金黄色葡萄球菌产生的高度稳定的表面受体,它能与大量物种的免疫球蛋白(特别是IgG)的Fc段结合(Boyle,M.D.P.and K.J.Reis.Bacterial Fc Receptors.Biotechnology 5697-703(1987))。一个蛋白A分子能同时结合至少两个IgG分子(Sjquist,J.,Meloun,B.and Hjelm,H.Protein A is isolated from Staphylococcus aureus after digestion withlysostaphin.Eur J Biochem 29572-578(1972))。
“蛋白G”指链球菌的菌体表面相关蛋白,与IgG的亲和力高,有三个高度同源的IgG结合域(参见Lian,et.al.1992.Journal of Mol.Biol.2281219-1234 and Derrick and Wigley.1994.Journal of Mol.Biol.243906-918)。
“标记物”指可以检测到的原子或分子族,它与分析物通过直接或间接方式特异结合。本发明的标记物可以通过物理或化学方法检测。优选的标记物应该为指示阳性结果时应肉眼可见。
“基质”指能够支持流动相的不溶性物质。基质材料可以是自然或人工合成的,能吸水或不能吸水,纤维状或颗粒状。本发明的基质可以是由相同材料组成的连续条带,或由沿条带分布一致的不同材料的混合物组成,或不一致分布的材料组成,如组成区的材料与条带上其它区有不同的物理、化学性质。同样,一系列离散的垫也是由相同或不同基质材料组成的,每个垫上加有检测试剂。然后将垫放在液体流动部位形成连续的流动途径。考虑到进行检测时本发明的材料保持不溶,有可能与试剂发生或不发生反应。
“下游”指液体加入后,从加样处通过基质直接流经途径。
“上游”指液体通过基质流向加样处的流经途径。
“流经途径”指尿液通过基质时的途径。流经途径优选的是单一途径,但也可以包括几条途径,其中的每条途径相对于其它途径而言都可以同时的、顺序的、或独立的支持液体流动。
II简介正如以上所总结的,本发明的装置是用来检测病人尿样中的内源性目标抗体。本发明装置首先识别的目标抗体是与HIV蛋白,优选HIV-1的gp120或gp41和HIV-2的gp36结合的抗体。
本发明的装置包含一系列的区带,每个区带由于使用不同的化学试剂而不同,反应和/或交互作用分别发生不同区内。每个装置至少包括三个区样品区,结合区和分析区。本发明的装置还可以包括对照区,用来指示操作是否正确和提供有效的实验结果。还可以选择在装置流经途径的最后区带部位保留废液区,过量的样品可以存留在那里。废液区的存在使在必要时加入过量体积样品成为可能。典型的废液区含有吸收材料,可以与组成任一区带或所有区带的基质材料相同。
下文对本发明装置的不同区带提供了详细的描述以及这些区带是如何沿流经途径排列得到有效的诊断结果。通过这些描述有助于理解该装置的操作方法。
III装置结构总的来说,本发明是尿样沿着每个区带组成的流经途径顺序流过的一种装置。因此尿样加到样品区后,将依次遇到每个区带内的试剂,因此每个区带内的样品会和试剂发生预先确定的反应。液体流经装置是通过具有多种功能的基质材料控制的,如下文描述。基质材料也可以选择性的置于壳中,这在下文进行讨论。讨论完基质材料和壳后,将按加入尿样后流经途径顺序对装置上的每个区带进行描述。
A.基质本发明使用的适合基质是能支持液体流动的不溶性材料。基质材料可以是自然或人工合成的纤维或颗粒,具备多孔、吸水或不吸水的特点。它也可以由相同的材料、或沿一条带连续分布的不同材料的混合物、或在不同条带区域形成不同物理或化学性质的不连续分布的混合物组成连续条带。同样,基质也是由两种或多种基质材料垫组成,这些垫在装置中导流液体,使之沿一定方向流动。当装置中需要很多区域(每个区域都含有不同的试剂)或准备使用统一方法时,由一系列垫组成的液体流经途径十分有用。考虑到组成基质的材料在检测时保持不溶状态,就可能与一种或多种试剂发生或不发生反应。
适合的基质材料一般为亲水性的;或能够补偿具有亲水性,包括无机粉末,如硅酸盐和氧化铝;玻璃纤维滤纸;天然多聚物,优选以纤维素为基础的如滤纸、层析纸等的类似物;合成或修饰过的天然聚合体,如硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联右旋糖苷、琼脂糖等;这些材料可以单独或混合使用。基质材料还可以包含功能基团或具有与发明中的抗原或试剂共价交联的功能。
在检测中基质材料引导尿液沿一定的途径流动,因此检测中使用的试剂主要以颗粒或溶液的形式直接吸附在基质材料上,如下所述。
1.缓冲液本发明的一个特点是缓冲液系统,它在操作过程中使尿液pH至少保持在8,优选在8-11之间,更优选的是8.2-11,再优选是8.2-10,再优选是8.5-9.5,最优选是9-9.5。能使尿液保持在适宜pH范围的缓冲液的生产技术众所周知,如2002年Sigma目录中描述的“生物缓冲液”。优选的缓冲液包括碳酸盐、重碳酸盐、硼酸盐,尤其是其钾盐和铵盐。本发明的其它有用的缓冲液包括醋酸盐,EPPS,Tricine,Gly-Gly,Bicine,HEPBS,TAPS,AMPD,TABS,MOPS,CHES,CAPSO,AMP,CAPS,CABS和其它一些。
本发明中使用的缓冲液优选在进行操作前应用于装置的基质。可以以任何方式加入缓冲液,只要能够在尿液与基质接触时使之形成具有理想pH的溶液。例如,可以以干粉的形式将缓冲液加入到基质上,或者优选的以溶液的形式,然后在基质上冻干。
2.封闭试剂尽管在本发明中可以使用吸水材料做基质,最好还是使用天然不吸水的材料。
使用封闭试剂后吸水材料可能变的不再吸水。这些试剂可以是去污剂,糖或蛋白,它们能降低产生吸水特征的相互作用力。典型的蛋白封闭试剂包括天然状态或甲基化状态或琥珀酰状态的牛血清白蛋白,动物全血如马血清或胎牛血清或其它血蛋白。优选的封闭试剂是鸟类血清,比如鹅或火鸡血清,最优选的是鸡血清。其他的蛋白封闭试剂包括酪蛋白和脱脂奶粉。根据所封闭基质的特点从不解离、酸性、碱性和两性等不同形式选择含有去污剂的封闭剂。吐温20在封闭膜时非常有用。典型的用作封闭剂的糖包括蔗糖和果糖。
封闭吸水性基质时,使用有效浓度的封闭液处理基质材料以除去基质表面的不想发生的反应。总之,该方法是使用封闭液进行封闭,如1-20mg/ml的蛋白溶液,室温下在几分钟到几小时内完成。通过空气干燥、冻干或其它干燥方法将包被物质持久吸附到基质上。
使用本身具有吸水性,但后来转变为不吸水的基质,在固定抗原和捕获试剂时非常有效。例如,封闭前将捕获试剂加到基质上,可以进行原位固定。可以在捕获试剂固定到基质后再进行封闭。
B.壳本发明的基质可以放在功能性和保护性的壳中。在一个优选的实施例中,壳的典型形式为至少具有一个端口,以便容纳尿样并引导液流同样品区接触。壳也可以设计为具有窗口的形式,允许选择不同端口从而可以选择液体流经途径,流经分析区和/或对照区。具有这种壳的实施例被称为“盒式装置”。
相应的,基质可以无支持物,或有耐久材料作为支持物,该耐久材料最好为防渗漏并能保持基质的物理完整性。具有此类结构特征的实施例被称为“沾棒(dipstick)”。
本装置的第三个实施例包括一个与盒式装置相似的保护性壳,但是样品区延伸并超越壳,形成一个灯芯结构,该结构可以浸入尿样中。该方面的其它变化形式都是以基本结构为模板,从而可以很容易的被本领域的人员所识别。
壳可以使用本领域公知的任何合适材料构建。液体中的壳部件与流经途径相接触,但不会阻止液体沿途径流动,所以其材料亲水性不能太强。相反,如果与液体流经途径接触的壳材料亲水性太强,则样品可能被壳吸收一部分或透过壳壁渗漏。
C.装置区本发明的装置至少有三个区,每个区内包含能与加到装置上的尿样中的内源性抗体作用的反应物。样品区容纳尿样,尿样加样于样品区可以通过流体装置,或先收集尿样再通过滴加、加样器或倾倒方式加样到样品区。尿样优选不稀释,并在收集后立即使用。如果必要,使用本发明装置检测的尿样自收集后可以在室温存放有限的时间(如多达一个星期),如果冷冻,可以存放更长的时间。样品区优选有足够的缓冲液,使尿样在装置检测期间pH值升高和/或保持在8左右。如上所述,缓冲液应该可以被尿样增溶,并且有足够的缓冲能力,使pH值在装置检测期间保持在8左右。
加样于样品区的尿样首先迁移进入交联区,在该区段尿样中的内源性抗体与下面描述的连接于标记物上的标记试剂作用,形成标记抗体交联物。
标记抗体交联物迁移进入分析区,在分析区,抗原与靶抗体特异性结合并固定于基质上。如果标记抗体交联物中的抗体为靶抗体,固定的抗原与靶抗体特异性结合,并固定标记抗体交联物于基质上。通过这种方式,标记物在分析区聚集,从而可以被检测到,并说明尿样中靶抗体的存在。如果标记抗体交联物没有包含靶抗体,则它们沿流道继续迁移,不在分析区聚集。
本发明的装置可以选择性的包括对照区,对照区内是固定于基质上的捕获试剂。捕获试剂在对照区内形成对照线,并且非特异性的与标记抗体交联物中的抗体结合。通过这种方式,使标记抗体交联物在对照区聚集,说明装置工作正常。当包括对照区时,对照区位于交联区和分析区的下游。
在上述区段的下游,装置还可选择性包括废弃区。废弃区可以是基质的简单延伸,但最好是由吸水性物质构成,从而可以使得加样于装置上的样品量达到最大。
为了更好的描述本发明,本部分上面提到的每个区段将在下面详细描述。
样品区样品区用于操作者加入尿样。样品区一般由靶抗体低滞留性的材料构成。相应的,用于样品区封闭的封闭试剂需能够阻止靶抗体在操作期间与基质材料相互作用。用于样品区封闭的试剂优选鸟类血清,更优选鸡血清。在优选的实施例中,样品区由玻璃纤维垫制成,先将其用溶液(含聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鸟类血清、硼酸盐和/或碳酸盐缓冲液(~0.5M)、Triton X-100或Tween-20去污剂)浸透。然后将垫压干去除多余的缓冲液,在30℃干燥过夜。该方法的先进性在于增加了样品区的吸水性和灯芯抽吸作用。在实施例中,样品区也可以起过滤器的作用,除去那些不需要的颗粒。
交联区交联区位于样品区的下游,并包含有与标记物直接或间接连接的标记试剂构成的标记部分。这里提到的连接标记物和标记试剂的方法是本领域的公知技术。
标记部分位于基质上的交联区,使其在液体样品(如尿样)向上流动时与液体样品接触。要完成该过程,交联区的基质需由聚酯纤维纺织物组成,并将其浸泡在含聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鸟类血清、硼酸盐和/或碳酸盐缓冲液(~0.5M)、Triton X-100或Tween-20去污剂的缓冲液中封闭。最后在50℃通风环境中干燥。标记部分被剪成条状,通过黏性末端或气溶胶末端固定于垫上。在处理为条状之前,标记部分最好先进行稳定化处理,如标记部分可以置于单一的或复合的糖溶液中(如20%(w/v)的蔗糖和5%(w/v)的海藻糖,或10%(w/v)的糊精)。
当尿样流经交联区时,标记部分溶解并同液流一起流经装置。合适的标记试剂和标记物将在下面进一步讨论。
a)标记试剂本发明的标记试剂优选能特异性结合尿样中的内源性抗体。合适的能与尿样中的所有内源性抗体结合的标记试剂包括细菌蛋白(如蛋白G和蛋白A)和能够识别特定抗体类型的抗体,例如羊抗人IgG可以用来结合来自病人尿样中的任何IgG抗体。
不管使用何种标记试剂,即使尿样中没有靶抗体,标记抗体交联物总是在交联区生成。如果没有靶抗体,那么形成的标记抗体交联物将包括尿样中的普通内源性抗体。尿样中含有足够的内源性抗体来形成可被检测到的标记抗体交联物。
b)标记物本发明中适用的标记物可以是可见的也可以是不可见的,但是如果它们在检测区域聚集,则必须是能够被检测到的。本发明中适用的标记物包括但不限于颗粒族和酶。可见的标记物可以是染料或足量情况下可见的着色多聚物,优选的标记物为颗粒物质,如着色乳胶珠、脂质体、金属、有机物、无机物、染料溶液、荧光颗粒、着色的或有色的细胞或组织、血红细胞等。金属溶胶颗粒、着色的或荧光标记的微粒可以用肉眼看到或使用合适的仪器读取(分光光度计、荧光读数仪等)。相应的,也可以使用放射性同位素。
本发明的优选标记物为直径大于20nm的胶体金颗粒,更优选的为20-100nm,最优选为20-40nm。本发明中使用的胶体金可以使用现在众所周知的技术制造,如G.Frens,Natrure,241,20-22(1973)。除了胶体金,颗粒也可以是由铂、金、银、硒、铜或其它呈现特征性颜色的合金或金属复合物制成。本发明中的合金、金属复合物和金属或金属复合物包裹的多聚核技术在美国专利4,313,734中有相关描述。现有技术中还有其他将分析物吸附于金颗粒上的方法。这些方法包括通过共价键和疏水键进行吸附,但并不局限于此。
分析区分析区位于流动途径中交联区的下游。分析区含有固定于基质上的特异性针对靶抗体的抗原,通过与靶抗体结合将标记抗体交联物固定于基质上。固定抗原可以是能特异结合靶抗体的任何抗原,但优选HIV蛋白,更优选的是HIV包膜蛋白,再优选的是来自HIV-1gp120或gp41,或者来自HIV-2 gp36的一个或多个肽段,最优选的是从SEQ ID NO1-5中选出的至少一个抗原。
本发明适合使用的抗原可以是现有方法的任意来源,包括天然的、化学合成的或重组的产物。例如,优选的SEQ ID1-5肽段可以使用固相肽合成技术来化学合成,或者可以连接编码合适肽段的核苷酸并将其导入表达载体,然后将重组载体导入合适的宿主,重组生产。将肽段分离纯化后,就可以使用已知的技术用生物素标记。
合适的抗原可以使用目前已知的技术固定于基质上,但是不能破坏抗原与靶抗体特异性结合的位点。优选的固定方法为使用生物素/链球菌抗生物素蛋白连接子,更优选的是抗原与生物素偶联,然后与事先偶联于基质上的链球菌抗生物素蛋白结合。在对吸水性基质进行封闭之前,先进行链球菌抗生物素蛋白与基质的偶联,该技术现在已经公知。较好的偶联效果可以通过调节溶液中链球菌抗生物素蛋白生物素结合位点和生物素比例至少为2∶1获得,其它的比例如0.5∶1、1∶1、3∶1、4∶1和5∶1,以及其它的一些比例,都在本发明的范围内。对于吸水性基质,最终的复合物可以简单的加于基质材料上,干燥后使用合适的封闭液封闭。本发明中可用来仿效的抗原性肽段的氨基酸顺序在下面的SEQ ID1-5中有描述。SEQ ID1、3、4和5中的链间连接半胱氨酸残基表明,这些残基的侧链容易发生氧化反应形成半胱氨酸。
基质上固定的抗原可以浓集特异性结合它们的标记抗体交联物。通过浓集标记抗体交联物,加强了标记物生成的信号、提高了敏感性,同时也最大可能的降低了产生错误结果的机率。
典型的标记物信号可以在尿样加于样品区后15-60分钟内观察到,优选的是在15-45分钟,最优选的是在15-30分钟。如上所述,有色标记物产生的信号,可以不经进一步处理直接在装置上检测到。荧光标记物则需要荧光光度计进行检测。金属溶胶标记物产生的信号可以通过本领域公知的方法使用银盐溶液加强。同样的,如果使用酶作为标记物,则需要与相应底物作用来产生可以被检测到的产物。这些加强手段都是从常规的使用有色粒子和溶胶标记物一步式检测方法发展来的,在这些加强方法中,基质需同显像液(如银盐溶液或底物液)作用,从而产生可以检测的信号。
对照区本发明的装置中可以选择性的包括对照区。当其存在时,对照区位于流经途径交联区的下游,优选分析区的下游。
对照区含有能与尿样中内源性抗体特异性结合的捕获试剂,捕获试剂优选的固定于对照区内形成对照线,它们能结合并浓集尿样中的所有标记抗体交联物。捕获试剂可以是与某一类型抗体有亲和力的蛋白,如蛋白G或蛋白A,但是在本发明中,只有当这类抗体结合分子没有被用作标记试剂时,它们才能被用作捕获试剂。优选的捕获试剂在本发明操作期间,应该拥有比蛋白A更大的与内源性尿抗体的亲和力,如上所述它们包括来自不同尿样来源物种的抗IgG抗体。
本发明中适用的捕获试剂可以通过已知的技术固定于基质上,其中包括上述用于固定抗原的技术。优选的固定方法为使用生物素/链球菌抗生物素蛋白连接子,更优选的是如上面所说的捕获试剂与生物素偶联,然后与事先偶联于基质上的链球菌抗生物素蛋白结合。对于吸水性基质,基质材料在固定捕获试剂后需要封闭,如使用含有0.01M磷酸钾、0.25%BSA和0.025%Tween-20的溶液进行封闭,然后膜在50℃过夜干燥。
在正确使用的条件下,捕获试剂将连续结合所有的标记抗体交联物,直至不再有未结合的标记抗体交联物或捕获试剂已经饱和。因为一般来说来自健康哺乳动物的尿样中都含有内源性IgG,并且与标记物结合的标记试剂在分子数量上超过固定的抗原,所以总是有标记抗体交联物与捕获试剂结合,并在对照区显示信号。所以,如果不能在对照区检测到信号,则说明装置操作存在错误或不当。
IV.试剂盒本发明提供了包括一个或多个上述装置的试剂盒。每个试剂盒可以选择性的包括说明包装装置如何使用的说明,装有用于检测装置是否有效的阳性和阴性对照溶液的瓶子,用于决定本发明的检测何时结束的定时器,尿液收集容器(如一个小试管),一个或多个移液管和/或一次性生物危险品容器。
说明书中引用的出版物和专利申请都在这里用作参考文献,每件个人出版物和专利申请分别被特别引用作参考文献。
前述发明通过解释和举例进行了详细说明,以使其更加清楚和易于理解,本领域的技术人员没有背离本发明的权利要求的精神和范围的某些改变和修改仍然在本发明的教导范围内。
正如以上进行的充分描述,本发明在应用中具有很大的变化范围。相应的,出于更好的说明本发明的目的,提供了下面的例子,但是并不是将本发明局限于此。那些应用于本发明的技术有许多非关键性的参数,要获得相似的结果,可以对这些参数进行修改或变化。
实施例1评价免疫分析装置对冷冻和新鲜样品的选择性和灵敏性本实施例表明根据本发明制造的免疫分析装置对不同来源的AIDS样品有非常高的灵敏性和特异性。
本发明的免疫分析装置包含以下组份使用含有聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鸟类血清、碳酸盐缓冲液(0.5M)和Triton-X 100的溶液封闭和装载的玻璃纤维样品区垫。挤压样品垫除去过量液体,30℃过夜干燥。
分析区的垫包括采用链球菌抗生物素蛋白/生物素交联剂交联到聚酯无纺膜上的HIV抗原。简言之,准备100mg/ml的抗生物素蛋白溶液,浓度为10mg/ml的HIV-1多肽、HIV-2多肽溶液。抗生物素蛋白溶液和HIV溶液按照2.1个抗生物素蛋白结合位点对应于1个生物素分子的比例混匀。室温(25℃)反应5分钟,用去离子水/5%异丙醇溶液将其稀释到终体积。使用线性加液器将稀释好的溶液加到膜上,50℃干燥4个小时后,50℃在封闭液(含0.25%BSA和0.025%吐温20的0.01M磷酸钾溶液)中封闭过夜。
交联区的垫是使用气雾剂吸头将标记物加到聚酯无纺膜上制成。加入前将垫的标记物结合部分在20%(w/v)的蔗糖溶液和5%(w/v)的糊精溶液稳定。然后将垫浸入含有聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鸟类血清和碳酸盐的缓冲液,通风条件下50℃干燥50分钟。
对照区的对照线是通过稀释溶液中羊抗体的F(ab)片段制备的,该片段特异针对人抗体Fc段。使用气雾吸头将稀释溶液喷洒在聚酯无纺膜上,50℃干燥4小时。50℃在封闭液(含0.25%BSA和0.025%吐温20的0.01M磷酸钾溶液)中封闭过夜。
经过上述处理的膜在液体流经途径中顺序排列,样品区位于交联区上游,交联区位于分析区上游,分析区位于对照区上游。
在样品区加入4滴(50-100μl)尿液,室温放置20分钟后,从装置读取结果。如果在对照区出现阳性信号(如出现有颜色的条带),说明检测操作正确。如果对照区位置未出现阳性信号,说明该装置出现错误,应弃去,并使用新的装置进行免疫检测。
假设装置操作正确,分析区对应抗原的位置出现阳性信号,说明尿液中存在直接针对抗原的抗体。在目前的分析中,这一结果表明尿液捐献者感染了HIV。如果在分析区未出现阳性信号,说明尿液中没有直接针对抗原的抗体,即尿液捐献者没有感染HIV。
表1所示为10个不同来源的尿液使用上述方法分析的结果。
实施例2快速免疫色谱(RIC)一步法检测结果本实施例说明盒式检测方法适合检测尿液中的HIV抗体。尽管尿液中的抗体水平低于血液或血清,本方法对经EIA和Western Blot确证的尿液进行了成功检测。快速免疫色谱法(RIC)用来检测血液/血清中的HIV抗体,对降低HIV传播率起到重要的作用。以下描述的研究使用HIV-1 RIC分析法检测尿液中HIV-1抗体的潜在能力。
方法对快速检测的评估通过检测11份冷冻保存的存档尿样进行,通过使用Calypte HIV-1尿液EIA方法检测,使用Cambridge BiotechHIV-1尿液Westem Blot方法确认,11份尿样中有6份为抗HIV-1抗体阳性,4份为抗HIV-1抗体阴性。尿样在加样于RIC检测装置之前先在室温下简单混匀。150ml尿样加样于装置用于分析,并随后确定在装置的样品线和对照线出现的信号的强度。计算样品与对照的比率作为相对强度的指标。如果比率大于1.0,则判读为HIV阳性。快速检测装置上出现的对照线也证实了其性能,同时表明样品是有效的。分别在10、20和30分钟时使用上述的盒式分析装置读取结果。
结果RIC检测结果显示已知的6份HIV-1阳性样品都给出了HIV-1抗体反应性结果,4份阴性样品全部无反应性结果,与EIA方法和WesternBlot结果比较得到100%的敏感性和特异性。总的来说,本检测的准确率为100%。
表2尿液HIV-1快速检测结果—冷冻样品
结论在一步法RIC检测方式对冷冻样品的盲试检测中,所有样品的检测结果与预计结果一致,说明该检测方法适用于检测尿液中抗HIV-1抗体。
这种检测方式的优势在于易于使用,需要极少的特殊培训、设备和采样装置,即是非冷冻保存也有较好的稳定性,这使得其易于在AIDS流行的边远地区使用。尿液样品中没有感染性HIV使得暴露于HIV之下的危险显著降低。另外,尿液样品也易于大量提供来进行HIV感染检测和其它疾病和状态的的检测。
序列表<110>北京克利普特生物医药科技有限公司<120>快速检测尿中的HIV抗体的装置及检测方法<130>MP040001<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素标记单赖氨酸连接子HIV-1(gp41肽段)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa=生物素标记Lys<220>
<221>DISULFID<222>(20)...(26)<400>1Xaa Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp20 25 30Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile35<210>2<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素标记HIV-1 gp120肽段<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa=生物素标记Lys
<400>2Xaa Thr Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val1 5 10 15Val Gln Arg Glu Lys Arg20<210>3<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素标记单赖氨酸连接子HIV-2(gp36肽段)<220>
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<221>MOD_RES<222>(35)<223>Xaa=serinamide<220>
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<223>人工序列描述生物素标记双赖氨酸连接子HIV-1(gp41肽段)<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)<223>Xaa=生物素标记Lys<220>
<221>DISULFID<222>(21)...(27)<400>4Xaa Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu1 5 10 15Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro20 25 30Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile35 40<210>5<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素标记双赖氨酸连接子HIV-2(gp36肽段)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa=生物素标记Lys<220>
<221>MOD_RES<222>(37)<223>Xaa=serinamide<220>
<221>DISULFID<222>(21)...(27)<400>5Xaa Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu1 5 10 15Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro20 25 30Trp Val Asn Asp Xaa3权利要求
1.一种用于检测尿液中的靶抗体的侧向流装置,该装置含有能特异性结合靶抗体的抗原和预置有与尿液接触时使溶液pH值至少为8的缓冲液的样品区。
2.如权利要求1所述的侧向流装置,其中所述的缓冲液含有碳酸盐。
3.如权利要求2所述的侧向流装置,其中所述的缓冲液还含有重碳酸盐。
4.如权利要求3所述的侧向流装置,其中所述的缓冲液中含有的碳酸氢钾与碳酸钾的摩尔比为2∶1。
5.如权利要求1所述的侧向流装置,其中所述的抗原为HIV蛋白。
6.如权利要求5所述的侧向流装置,其中所述的HIV为HIV-1。
7.如权利要求5所述的侧向流装置,其中所述的HIV为HIV-2。
8.如权利要求5所述的侧向流装置,其中所述的蛋白为重组蛋白。
9.如权利要求5所述的侧向流装置,其中所述的HIV蛋白为包膜蛋白。
10.如权利要求9所述的侧向流装置,其中所述的蛋白为从SEQ IDNO1-5的蛋白中选择的。
11.如权利要求1所述的侧向流装置,其中所述的样品区还含有鸟类血清。
12.如权利要求11所述的侧向流装置,其中所述的鸟类血清为鸡血清。
13.如权利要求1所述的侧向流装置,它还含有与标记物交联的标记试剂构成的交联区。
14.如权利要求13所述的侧向流装置,其中所述的标记试剂为蛋白A。
15.如权利要求13所述的侧向流装置,其中所述的标记物为胶体金。
16.如权利要求1所述的侧向流装置,它还具有含有捕获试剂的对照区。
17.如权利要求16所述的侧向流装置,其中所述的捕获试剂为抗人IgG抗体。
18.如权利要求17所述的侧向流装置,其中所述的抗人IgG抗体为羊抗人IgG 2抗体。
19.一种检测尿液中抗体的侧向流装置,该装置含有a.含有蛋白A/胶体金的交联区;b.含有捕获试剂的对照线,其中所述的捕获试剂与蛋白A/胶体金交联物结合的尿源性抗体具有亲和力,并且该亲和力大于蛋白A/胶体金交联物中蛋白A与尿源性抗体的亲和力。
20.如权利要求19所述的侧向流装置,其中所述的捕获试剂为抗人IgG抗体。
21.如权利要求20所述的侧向流装置,其中所述的抗人IgG抗体为羊抗人IgG 2抗体。
22.如权利要求19所述的侧向流装置,它还包括一个含有pH值至少为8的缓冲液的样品区和能特异性结合靶抗体的抗原。
23.如权利要求22所述的侧向流装置,其中所述的缓冲液含有碳酸盐。
24.如权利要求23所述的侧向流装置,其中所述的缓冲液还含有重碳酸盐。
25.如权利要求24所述的侧向流装置,其中所述的缓冲液含有的碳酸氢钾与碳酸钾的摩尔比为2∶1。
26.如权利要求22所述的侧向流装置,其中所述的抗原为HIV蛋白。
27.如权利要求26所述的侧向流装置,其中所述的HIV为HIV-1。
28.如权利要求26所述的侧向流装置,其中所述的HIV为HIV-2。
29.如权利要求26所述的侧向流装置,其中所述的蛋白为重组蛋白。
30.如权利要求26所述的侧向流装置,其中所述的HIV蛋白为包膜蛋白。
31.如权利要求30所述的侧向流装置,其中所述的蛋白是从SEQ IDNO1-5的蛋白中选择的。
32.如权利要求22所述的侧向流装置,其中所述的样品区还含有鸟类血清。
33.如权利要求32所述的侧向流装置,其中所述的鸟类血清为鸡血清。
34.一种含有权利要求1或权利要求19所述的侧向流装置的试剂盒。
35.一种检测病人尿样中抗体的方法,该方法含有用侧向流装置的样品区与尿样接触的步骤,其中所述的样品区含有pH值至少为8的缓冲液。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述的缓冲液含有碳酸盐。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述的缓冲液还含有重碳酸盐。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述的缓冲液中含有的碳酸氢钾与碳酸钾的摩尔比为2∶1。
39.一种检测病人尿样中抗体的方法,该方法含有用侧向流装置的样品区与尿样接触的步骤,该装置中含有蛋白A/胶体金交联物的交联区和含有捕获试剂的对照区,其中所述的捕获试剂与蛋白A/胶体金交联物结合的尿源性抗体具有亲和力,并且该亲和力大于蛋白A/胶体金交联物中蛋白A与尿源性抗体的亲和力。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述的捕获试剂为抗人IgG抗体。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述的抗人IgG抗体为羊抗人IgG抗体。
42.如权利要求39所述的方法,其中所述的样品区含有pH至少为8的缓冲液。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述的缓冲液含有碳酸盐。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述的缓冲液还含有重碳酸盐。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述的缓冲液中含有的碳酸氢钾与碳酸钾的摩尔比为2∶1。
46.如权利要求39或权利要求35所述的方法,其中所述的病人为可疑HIV感染者,并且所述的侧向流装置含有HIV抗原。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述的HIV为HIV-1。
48.如权利要求46所述的方法,其中所述的HIV为HIV-2。
49.如权利要求46所述的方法,其中所述的蛋白为重组蛋白。
50.如权利要求46所述的方法,其中所述的HIV蛋白为包膜蛋白。
51.如权利要求50所述的方法,其中所述的蛋白为从SEQ ID NO1-5的蛋白中选择的。
全文摘要
本发明提供了快速检测尿液中的内源性抗体,特别是针对HIV包膜蛋白的抗体的装置和方法。其它的能引起尿液中内源性抗体升高、因而也可以使用本发明进行检测的病原体包括已知的性传播疾病的病原体。
文档编号G01N33/53GK1558237SQ20041000424
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月12日 优先权日2004年2月12日
发明者罗那多·明克, 托比·告特弗瑞德, 约翰·安尼斯, 保罗·斯告特, 告特弗瑞德, 安尼斯, 斯告特, 罗那多 明克 申请人:北京克利普特生物医药科技有限公司