专利名称：一种新型含碘树脂衍生物用在基于质谱的蛋白组学研究中的方法
技术领域：
本发明涉及一类结构新颖的固体衍生物在生化方面的应用尤其是在蛋白组学研究中的应用前景，特别是涉及一类新型含碘树脂衍生物在生化方面的应用尤其是在蛋白组学研究中的应用前景。
背景技术：
目前，基因组学的研究已进入一个相对稳定的阶段，同时，基因产物(包括RNA和蛋白质)的研究正吸引着越来越多的目光。其中特别是蛋白质的研究，正以蛋白组学研究的形式，受到了日益的重视。蛋白质，作为生物体内重要的活性物质，其研究的复杂性远远超过了基因以及RNA。而且蛋白质所表现出的多重信息修饰程度，量的变化，结构以及分布的变化都直接与生理功能的变化有关，所以关于蛋白质的研究是生命研究中最为直接有效的研究方面，也是最富有挑战性的研究领域之一(参见J.Bio.Chem.2001；4945497-45500)。
对于复杂的蛋白质体系，目前最为普遍和有效的研究过程使用的是二维凝胶电泳分离后，再进行质谱检测，完成定性、定量、差异比较的方法。这一方法是目前应用范围最广，发展最为完善的蛋白组学方面的研究方法(参见Anal.Chem.1994，244390-4399；Proteomics 2001 13-12)。但是作为分离手段的二维凝胶电泳，有着其固有的缺点。比如对于分离强酸性及强碱性蛋白，含量低的蛋白，及某些膜蛋白，结果都不能令人满意。而且这种方法的自动化程度难以提高，再加上其在进行蛋白比较分析方面的局限性(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，179390-9395；Trends in analytical chemistry 2003，22273-281)，都促使了新方法的发展和应用。
近年来，随着质谱技术的发展，特别是软电离技术(电喷雾电离ESI技术，基质辅助激光解吸电离MAIDI技术)的出现和发展，使得质谱成为蛋白组学研究中日益重要的分析研究手段，依赖质谱建立的蛋白组学的研究方法也引起了越来越多的重视和发展。其中，适合于质谱检测的同位素标记方法很令人关注。这种同位素标记方法包括体内和体外标记两种。体内标记是在培养液中引入同位素标记部分(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，966591-6596；J.Am.Chem.Soc.1999，1217949-7950)，其应用范围有限；而体外标记中，同位素标记部分是在分析过程中引入，因其应用所受到的限制较少，所以近年来受到重视。其中，稳定同位素亲和标记(ICAT)技术是发展较为完善的方法(参见Nat.Biotechnol.1999，10994-999)。ICAT方法中，蛋白的标记、分离都可以依赖ICAT试剂来实现，具体过程是此试剂在选择性标记巯基部分的同时，试剂中的生物素部分又可以用来进行标记肽的亲和分离，极大地简化了分析物的复杂程度，提高了分析的效率。这种技术目前已经有商品化产品出现，相应的软件也进行了开发和应用。但随着ICAT试剂的应用，出现了越来越多的问题，其中依赖于此试剂中的生物素部分的分离效率问题是一个很重要的方面。
目前还出现了包含有固体的同位素标记的试剂(参见Anal.Chem.2002，194969-4979；Nat.Biotechnol.2002，5512-515)，此类试剂的优势已经初步显示出来。
发明内容
本发明的要解决的问题是提供一类全新的含有固体的同位素标记的试剂在蛋白组学研究中的应用方法。
本发明方法涉及到一种新的试剂，是一种含碘树脂衍生物，其具有如下结构Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I其中，Solid为固相部分，是带有甲氨基作为反应基团的树脂，所述的带有甲氨基作为反应基团的树脂优选为甲胺基聚丙烯树脂(Aminomethyl polystyreneresin)；Link为连接部分，是可用于固相合成的连接部分，其中含有对酸的不稳定的C-N键；R’(H/D)为标记部分，是含8-12个氢/氘取代的链状或支链状的氨基酸(优选8-10个氢/氘取代的链状或支链状的氨基酸)，所述的氨基酸优选如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸等；碘乙酰为巯基的选择反应活性部分。
本发明涉及的含碘树脂衍生物，其中b)，c)部分提供氨基、羧基基团，以使固相，连接，标记及活性等部分相互连接。该含碘树脂衍生物的连接部分提供了能与标记部分相连接及在酸性条件发生裂解的C-N键。该含碘树脂衍生物中存在供电子基团有利于质谱分析。该含碘树脂衍生物标记部分包括8-12个氢/氘取代的链状或支链状的氨基酸，含有限定分析物残基的定位信息。
本发明涉及的含碘树脂衍生物，所述的连接部分优选的结构通式如下所示，其中含有对酸的不稳定的C-N键， 所述的取代苯基上的取代基是单取代或多取代的供电子基团。所述的供电子基团优选为C1～C3烷氧基，OH，Me2NCH2CH2O，Et2NCH2CH2O，NH2，C1～C4的烷基。
进一步优选具有如下结构通式
本发明涉及的含碘树脂衍生物，进一步优选具有如下结构通式 式中resin为如前所述的树脂。
本发明涉及的含碘树脂衍生物中各部分的连接，可以是通过芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基，在碱性条件下脱保护，再与羧基进行缩合反应，氨基再脱保护的循环完成的。
具体来说，本发明涉及的含碘树脂衍生物，可通过下述方法合成在非质子性溶剂中，带有苯甲氨基的固相支持物树脂与连接部分、缩合剂BOP/DCC/DIC、缩合催化剂HOBt的摩尔比优选为1∶1～5∶1～5∶1～5，进一步优选为1∶3∶3∶3，在0℃-50，优选为10℃-50℃，反应时间优选为0.5～5小时，进一步优选为1-3小时，抽滤，固体部分可以用非质子性溶剂，质子性溶剂分别洗涤，干燥，称重，计算得加载值(loading value)，为1克固体所含活性位点的摩尔数，单位是毫摩尔/克，应用至下面反应的投料计算。(其中BOP是苯并三唑-1-氧-三-(二甲胺基)膦六氟磷酸盐，DCC是二环己基碳二亚胺，DIC是二异丙基碳二亚胺，HOBt是羟基苯骈三氮唑)。
将上述固体在非质子性溶剂中与醋酐进行封头(capping)反应，乙酰化未反应的氨基，10-50℃反应0.5～3小时，进一步优选为1小时，抽滤，固体可以用用质子性溶剂，质子性溶剂分别洗涤，干燥，在碱性条件下，脱Fmoc保护，洗涤干燥后进入下一轮的缩合，洗涤，脱保护过程，最后将活性基团碘乙酰胺也接至固体上得目标试剂。
下面以下述试剂结构为例来说明本发明涉及的含碘树脂试剂的合成路线 合成路线
(2)在非质子溶剂中，0-50℃条件下，甲胺基聚丙烯树脂(AminomethylPolystyrene Resin)、Rink Amide连接臂(Rink Amide Linker，4-[(2，4-dimethoxyphenyl)(Fmoc-amino)methyl]phenoxyacetic acid)、缩合剂、缩合催化剂羟基苯骈三氮唑(HOBt)混合反应2-5小时，各组分的摩尔比为1∶3∶3∶3。抽滤，洗涤干燥得化合物1。称重计算加载(loading)值，为1克固体所含活性位点的摩尔数，单位是毫摩尔/克。
IR3433，1720，1686.
所得化合物再在非质子性溶剂中与醋酐在10-50℃反应1小时，乙酰化未反应的氨基。其中所用缩合剂可以是BOP，苯并三唑-1-氧-三-(二甲胺基)膦六氟磷酸盐(benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluoro-phosphate)，二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基碳二亚胺(DIC)等，非质子溶剂可以是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(CH2Cl2)，三氯甲烷(CHCl3)等；洗涤所用溶剂依次为N，N-二甲基甲酰氨(DMF)，二氯甲烷(CH2Cl2)，甲醇(CH3OH)；氨基的保护反应所用的条件是苯-醋酐(1∶1)。
(3)在碱性条件下，化合物1脱Fmoc保护，洗涤干燥得化合物2。其中所用的碱性条件是哌啶/DMF(20-40％)。洗涤所用溶剂同上。
IR3433，3428，1665.
(4)在非质子溶剂中和0-50℃条件下，化合物2、Fmoc-leu(10H/D)、缩合剂、缩合催化剂HOBt混合反应1-5小时，抽滤，洗涤干燥得化合物3。各组分的摩尔比，缩合剂，非质子溶剂，洗涤所用溶剂同上。
IR3430，3328，1676，1610.
Fmoc-leu(H/D)由leu(H/D)制备，操作参照文献进行(参见Int.J.
Pept.Protein Res.27(4)，398-400，1986)。
(5)在碱性条件下，化合物3脱Fmoc保护，洗涤干燥得化合物4。
IR3381，3375，1669，1610.
(6)在非质子溶剂中和0-50℃条件下，化合物4、碘乙酸、缩合剂、缩合催化剂HOBt混合反应1-5小时，各组分的摩尔比为1∶6∶3∶3。
洗涤干燥后得化合物5。其它条件同上。
IR3427，3301，1670，1610，538.
含碘量分析I(含碘量)5.60％.
计算可得此含碘固相试剂活性基团数为0.44mmol/g.
本发明涉及的含碘树脂试剂的合成方法中，每一步缩合反应都可以用以灵敏茚三酮反应检测残余氨基判断反应是否完全。若发现不完全，重复缩合步骤至反应完全。洗涤所用的溶剂优选为DMF，CH2Cl2，CH3OH等。脱Fmoc保护所用的碱性试剂优选为哌啶/DMF(20-40％)。所用的装置优选是带有聚丙烯材质的三通活塞的玻璃器，在振荡器上反应。
本发明提供了一种将上述试剂应用在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、蛋白质定性定量研究中的方法，其中用在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽的定性与相对定量的测定方法包括下列步骤a)目标分析物经还原；b)目标分析物与试剂反应；c)反应猝灭；d)洗涤之后，进行标记片段回收待分析部分；e)浓缩提纯后，将待分析部分溶于缓冲溶液，μLC-MS分析；所述的目标分析物是半胱氨酸，含半胱氨酸的肽，所述与目标分析物反应的试剂是前述的含碘树脂试剂。
其中用在含半胱氨酸的蛋白质定性与相对定量的测定方法，此方法包括下列步骤a)目标分析物经提纯、变性、还原；b)酶解；c)目标分析物与试剂反应；d)反应猝灭；e)洗涤之后，进行标记片段回收待分析部分；f)浓缩提纯后，将待分析部分溶于缓冲溶液，μLC-MS分析；所述的目标分析物是含半胱氨酸的标准蛋白质，蛋白质混合物或不同生理状态下的生物体蛋白提取物，所述与目标分析物反应的试剂是前述的含碘树脂试剂上述测定方法优选的反应条件如下所述的a)步骤是将目标分析物(一对)置于缓冲溶液中，变性之后，加入还原试剂打开二硫键；所述的b)、c)步骤是将溶液稀释之后加入胰蛋白酶酶解，在目标分析物溶液中分别加入一对含碘树脂试剂，反应两小时之后，加入β-巯基乙醇猝灭反应，所述的d)步骤是将反应所得的液体部分保留分析，固体部分抽滤洗涤后，进行标记片段回收；所述的e)步骤是回收的待分析部分浓缩后，加入无水乙醚，有沉淀产生，抽滤或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析。
所述的标记片段回收优选的条件是在酸性溶液中反应，0.5～5小时后(优选两小时后)将两反应体系的液体部分混合，在氮气流下浓缩后，加入无水乙醚，有沉淀产生，抽滤或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析。
所述的缓冲溶液中优选含有8M的尿素，0.2M的碳酸氢氨，0.02M的氯化钙，PH 8.2，优选将目标分析物置于此溶液中，37℃一小时完成初步变性过程。
所述的还原剂优选是三丁基膦(TBP)或二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的加入比例优选是二十倍的蛋白摩尔数，还原条件优选是37℃1小时。
所述的样品溶液优选在3毫克/毫升的浓度下完成变性和还原操作，然后在稀释至1毫克/毫升的浓度下，按重量比10∶1分两次加入胰蛋白酶(2毫克/毫升)在37℃酶解20小时。
所述的反应所用的装置优选是带有聚丙烯材质的三通活塞的玻璃器，在振荡器上反应。
所述的回收标记片段所用的酸性溶液优选是三氟乙酸、乙二硫醇、苯硫基甲烷、苯酚和水的混和溶液；或者三氟乙酸和DMF的混和溶液；或者三氟乙酸和CH2Cl2的混和溶液；或者三氟乙酸和乙腈的混和溶液。进一步优选的酸性溶液是三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶苯酚∶水＝80～95∶1～3∶1～10∶1～10∶2～17；或者三氟乙酸∶DMF＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶CH2Cl2＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶乙腈＝80～95∶5～20。尤其优选的酸性溶液是三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶苯酚∶水＝81.5∶2.5∶5∶5∶6。
洗涤所用的溶剂优选为DMF，CH2Cl2，CH3OH等。
μLC-MS分析所用的优选条件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱，60分钟内B相3-65％。
之后图谱解析，进行定性定量分析。
本发明在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、蛋白质定性与相对定量研究中有以下几个优点首先，在分离方面，本发明的应用不依赖二维凝胶电泳作为分离手段，而是利用共价键的形成、洗脱、最后回收待分析片段来完成分离提纯过程，操作简便分离效率高，并且兼容任何量的从体液、细胞或任何生长条件下的组织中收集的蛋白质，而且特别是此试剂的使用条件与蛋白酶解的溶液条件一致，有利于低丰度蛋白的分析；其次，此方法的标记部分(约170Da)的修饰部分较小，并且结构简单，在MS后续分析中不会使数据库的检索复杂化，并且此试剂轻与重的标记部分之间差10Da，有利于质谱图中一组峰的区分辨认以及避免与一些常规小分子丢失相混淆；最后，本发明中，回收待分析部分的反应条件温和回收率高，并且操作便捷，还可以进一步与质谱测定过程进行结合，达到更好的蛋白比较分析的结果。
图1是实施例1中含半胱氨酸的肽段的提取分析的实验步骤图2是实施例2中蛋白混合物的比较分析的实验步骤具体实施方法通过一下具体实施方法将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
1.试剂合成部分实施例1Rink Amide-AM树脂(Rink Amide-AM Resin)(1)的合成将200mg(0.22mmol，1.1mmol/g)甲胺基聚丙烯树脂，360mg(0.66mmol)Rink Amide连接臂，300mg(0.66mmol)BOP，100mg(0.66mmol)HOBt置于反应器中，加入5ml N，N-二甲基甲酰氨(DMF)，在室温下，将反应器置于震荡器中反应1小时。抽滤，固体用DMF，CH3OH，CH2Cl2分别洗涤三遍，干燥称重得296mg淡黄色固体，计算加载(loading)值为0.89mmol/g。在将此固体置于反应器中，加入5ml醋酐，5ml苯，室温下震荡反应1小时，抽滤后，固体用DMF，CH3OH，CH2Cl2分别洗涤三遍后，干燥，得微黄色固体，化合物1。
IR1750实施例2脱Fmoc保护的Rink Amide-AM树脂(RinkAmide-AMResin)(2)的合成将100mg化合物1置于反应器中，加入10ml 20％哌啶的DMF溶液，室温下震荡反应5分钟，抽滤，固体用DMF，CH3OH，CH2Cl2分别洗涤三遍后，再加入10ml 20％哌啶的DMF溶液，室温下震荡反应15分钟，抽滤，固体用DMF，CH3OH，CH2Cl2分别洗涤三遍，干燥，得微黄色固体，化合物2。
实施例3Fmoc保护的亮氨酸(10个氢或氘取代)取代的RinkAmide-AM树脂(N-(Fmoc-Leu(10H/D))Rink Amide-AM Resin)(3)的合成将86mg(0.077mmol)化合物2置于反应器中，加入102mg(0.231mmol)BOP，31mg(0.231mmol)HOBt，和81mg(0.231mmol)Fmoc-leu-(D10)置于反应器中，加入5ml DMF。室温反应1小时，抽滤，固体用DMF，CH3OH，CH2Cl2分别洗涤三遍，干燥，用灵敏茚三酮反应(Kaiser’s颜色反应)检测残余氨基，判断反应是否完全(参见Anal.Biochem.1970，34595-598)，若未完全，重复上述反应至反应完全，得微黄色固体，化合物3。
实施例4亮氨酸(10个氢或氘取代)取代的Rink Amide-AM树脂(N-Leu(10H/D)-RinkAmide-AM Resin)(4)的合成将86mg(0.077mmol)化合物3置于反应器中，脱Fmoc保护，操作同实施例2，洗涤干燥，得微黄色固体，化合物4。
实施例5含碘树脂衍生物的合成(5)将50mg(0.045mmol)化合物4，62mg(0.135mmol)BOP，22mg(0.135mmol)HOBt，和50mg(0.27mmol)碘乙酸置于反应器中，加入5ml N，N-二甲基甲酰氨(DMF)，在室温下，将反应器置于震荡器中反应1小时。抽滤，固体用DMF，CH3OH，CH2Cl2分别洗涤三遍，干燥，得淡黄色固体，化合物5。
2.试剂应用部分原理如下式
实施例1含半胱氨酸的肽段的提取分析实验步骤如图1所示操作步骤如下1.将肽混合物1含10mnol LT-9(LLGTGSFCT)，10nmol MN-8(MGNWLMGN)，20nmol GS-10(GTLFQKMNGS)，20nmol SF-9(SLRGKPHSF)，肽混合物2含20nmol LT-9(LLGTGSFCT)，20nmol MN-8(MGNWLMGN)，10nmol GS-10(GTLFQKMNGS)，10nmol SF-9(SLRGKPHSF)，分别溶于500μL of 0.03M的碳酸氢氨的水溶液(pH8.0-8.2)中，加入2μmol的三丁基膦(TBP)，震荡反应30分钟。
2.在含肽混合物1的反应液中加入5mg的10个氢取代的含碘树脂(10H)，在含肽混合物2的反应液中加入5mg的10个氘取代的含碘树脂(10D)，震荡反应1小时，在两反应液中分别加入2μl的β-巯基乙醇猝灭反应，抽滤，收集滤液，此滤液也进行μLC-MS分析，标记为洗脱液，固体用水，甲醇，二氯甲烷分别洗涤三遍，干燥。
3.将上述固体置于酸性溶液中，酸性溶液的成分为三氟乙酸-乙二硫醇-苯硫基甲烷-苯酚-水＝81.5∶2.5∶5∶5∶6，震荡反应2.5小时。抽滤，滤液在氮气流下浓缩至于，加入5ml乙醚，可以看到有白色固状物产生，再加入100μl 0.03M的碳酸氢氨的水溶液(PH8.0-8.2)，震荡后溶液分层，移去大部分乙醚层后，离心，取水层浓缩后，进行μLC-MS分析，标记为回收液。
4.μLC-MS分析所用的条件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱，60分钟内B相3-65％。
μLC-MS分析后，结果如下1.洗脱液中没有发现含半胱氨酸肽段LT-9(LLGTGSFCT)的信号，但有其它三个不含半胱氨酸的肽段MN-8(MGNWLMGN)，GS-10(GTLFQKMNGS)，SF-9(SLRGKPHSF)。这说明含碘树脂对含半胱氨酸的肽段具有选择性结合的作用。
2.回收液中只发现含半胱氨酸肽段LT-9(LLGTGSFCT)+标记部分(170/180Da)的信号。没有其它三个不含半胱氨酸肽段的信号。这说明没有与含碘树脂结合的肽段都可以通过洗涤除去。
3.回收液中，LT-9+标记部分(170/180Da)的信噪比明显优于混合肽的LT-9的信噪比。这说明此含碘树脂对含半胱氨酸肽段的提取和回收效率都是很高的。
4.回收液中含10H取代的含碘树脂标记的LT-9的信号强度是10D取代的含碘树脂标记的LT-9信号强度的1/2，这与两肽混合物中LT-9的含量呈正比。这说明此种方法可以用来进行不同样品的比较分析。
实施例2蛋白混合物的比较分析实验步骤如图2所示1.将蛋白混合物1溶菌酶(30nmol)，过氧化氢酶(50nmol)，细胞色素C(50nmol)，卵清蛋白(30nmol)和牛血清蛋白(50nmol)，蛋白混合物2溶菌酶(40nmol)，过氧化氢酶(30nmol)，细胞色素C(30nmol)，卵清蛋白(50nmol)和牛血清蛋白(20nmol)，分别溶于200μL缓冲液中，此缓冲液中含有8M尿素，0.2M碳酸氢氨，和0.02M氯化钙(CaCl2)，pH8.2。在含蛋白混合物1，2的溶液中分别加入5μmol三丁基膦(TBP)，置于37℃恒温箱中保温1小时。
2.将蛋白混合物用0.03M的碳酸氢氨的水溶液(pH8.0-8.2)稀释1倍后，再用纯水再稀释1倍。在含蛋白混合物1，2的溶液中加入2％胰蛋白酶溶液10μl，将两溶液置于37℃恒温箱中保温8小时后，再加入2％胰蛋白酶溶液10μl，37℃保温15小时，留出10μl进行μLC-MS分析，标记为酶解产物。
3.在蛋白混合物1的反应液中加入5mg的10个氢取代的含碘树脂(10H)，在蛋白混合物2的反应液中加入5mg的10个氘取代的含碘树脂(10D)，震荡反应2小时后，在两反应液中分别加入2μl的β-巯基乙醇猝灭反应，抽滤，收集滤液，此滤液也进行μLC-MS分析，标记为洗脱液，固体用水，甲醇，二氯甲烷分别洗涤三遍，干燥。
4.将上述固体置于酸性溶液中，酸性溶液的成分为三氟乙酸-乙二硫醇-苯硫基甲烷-苯酚-水＝81.5∶2.5∶5∶5∶6。震荡反应2.5小时。抽滤，滤液在氮气流下浓缩至干，加入5ml乙醚，可以看到有白色固状物产生，再加入100μl 0.03M的碳酸氢氨的水溶液(PH8.0-8.2)，震荡后溶液分层，移去大部分乙醚层后，离心，取水层浓缩后，进行μLC-MS分析，标记为回收液。
5.μLC-MS分析所用的条件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱，80分钟内B相3-85％。
μLC-MS分析后，结果如下1.通过对酶解产物的μLC-MS分析，获得了各蛋白的典型酶解片段的信号，但有相当大的一部分发生了信号重叠。肽段的归属是应用ExPASy Molecular Biology Server(http//cn.expasy.org/sprot/)上的Tagldent工具进行检索得到的，所用的数据库是41.10。
2.通过对滤液的μLC-MS分析，发现含半胱氨酸的肽段信号明显降低，有的甚至信号消失，其它肽段的信号强度基本未变。
3.通过对回收液的μLC-MS分析，只发现了含有半胱氨酸肽段的信号，其强度与酶解产物结果中相应片段的强度相当，但信噪比有明显改善。
4.在回收液的μLC-MS分析结果中，发现一系列质量数相差10Da的信号的组峰，通过检索，一组峰即对应着一个含半胱氨酸肽段(m/z为肽段分子量+标记部分分子量170/180Da)。每一组两峰的强度比与蛋白混合物1，2中相应蛋白的含量成正比，以此定量的误差小于5％。
权利要求
1.一种用在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽的定性与相对定量的测定方法，此方法包括下列步骤a)目标分析物经还原；b)目标分析物与试剂反应；c)反应猝灭；d)洗涤之后，进行标记片段回收待分析部分；e)浓缩提纯后，将待分析部分溶于缓冲溶液，μLC-MS分析；其特征是所述的目标分析物是半胱氨酸，含半胱氨酸的肽，所述与目标分析物反应的试剂是含碘树脂试剂，它具有如下结构Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I，其中，Solid为固相部分，该部分是带有甲氨基作为反应基团的树脂；Link为连接部分，该部分是可用于固相合成的连接部分；R’(H/D)为标记部分，该部分是含8-12个氢/氘取代的链状或支链状的氨基酸；活性基团部分是碘乙酰基。
2.一种用在含半胱氨酸的蛋白质定性与相对定量的测定方法，此方法包括下列步骤a)目标分析物经提纯、变性、还原；b)酶解；c)目标分析物与试剂反应；d)反应猝灭；e)洗涤之后，进行标记片段回收待分析部分；f)浓缩提纯后，将待分析部分溶于缓冲溶液，μLC-MS分析；其特征是所述的目标分析物是含半胱氨酸的标准蛋白质，蛋白质混合物或不同生理状态下的生物体蛋白提取物，所述与目标分析物反应的试剂是含碘树脂试剂，它具有如下结构Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I，其中，Solid为固相部分，该部分是带有甲氨基作为反应基团的树脂；Link为连接部分，该部分是可用于固相合成的连接部分；R’(H/D)为标记部分，该部分是含8-12个氢/氘取代的链状或支链状的氨基酸；活性基团部分是碘乙酰基。
3.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征是所述的d)步骤是用酸性溶液进行标记片段回收待分析部分。
4.如权利要求3所述的测定方法，其特征是所述的酸性溶液是三氟乙酸、乙二硫醇、苯硫基甲烷、苯酚和水的混和溶液；或者三氟乙酸和DMF的混和溶液；或者三氟乙酸和CH2Cl2的混和溶液；或者三氟乙酸和乙腈的混和溶液。
5.如权利要求3所述的测定方法，其特征是所述的酸性溶液是三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶苯酚∶水＝80～95∶1～3∶1～10∶1～10∶2～17；或者三氟乙酸∶DMF＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶CH2Cl2＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶乙腈＝80～95∶5～20。
6.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征是所述的含碘树脂衍生物，它具有如下结构Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I，其中，a)Solid为固相部分，该部分是带有甲氨基作为反应基团的树脂；b)Link为连接部分，该部分结构通式如下所示，其中含有对酸的不稳定的C-N键，酸不稳定C-N键 n＝1，2，4，5R为取代苯基，R4＝H或取代苯基所述的取代苯基上的取代基是单取代或多取代的供电子基团；c)R’(H/D)为标记部分，该部分是含8-12个氢/氘取代的链状或支链状的氨基酸；d)活性基团部分，该部分是碘乙酰基。
7.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征是所述的氨基酸是亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸等；所述的带有甲氨基作为反应基团的树脂为甲胺基聚丙烯树脂(Aminomethyl polystyrene resin)。
8.如权利要求1或2所述的含碘树脂衍生物，其特征是所述的连接部分Link为结构通式如下所示，其中含有对酸的不稳定的C-N键，酸不稳定C-N键 n＝1，2，4，5R1，R2，R3＝H或C1～C4的烷氧基 R5＝C1～C4的烷氧基，m＝1～3；所述的标记部分R’(H/D)是 式中X＝H或D
9.如权利要求2所述的测定方法，其特征是所述的a)步骤是将一对目标分析物置于缓冲溶液中，变性之后，加入还原试剂打开二硫键；所述的b)、c)步骤是将溶液稀释之后加入胰蛋白酶酶解，在目标分析物溶液中分别加入一对如权利要求2所述的含碘树脂试剂，反应0.5～5小时之后，加入β-巯基乙醇猝灭反应，所述的d)步骤是将反应所得的液体部分保留分析，固体部分抽滤洗涤后，进行标记片段回收；所述的标记片段回收是在酸性溶液中反应，0.5～5小时后将两反应体系的液体部分混合，在氮气流下浓缩后，加入无水乙醚，有沉淀产生，抽滤或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析；所述的e)步骤是回收的待分析部分浓缩后，加入无水乙醚，有沉淀产生，抽滤或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析，然后经图谱解析，进行定性定量分析。。
10.如权利要求9所述的测定方法，其特征是所述的缓冲溶液中含有8M的尿素，0.2M的碳酸氢氨，0.02M的氯化钙，PH8.2，将目标分析物置于此溶液中，37℃一小时完成初步变性过程。
11.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征是所述的还原剂是三丁基膦(TBP)或二硫苏糖醇(DTT)；还原剂的加入比例是二十倍的蛋白摩尔数，还原条件是37℃1小时。
12.如权利要求2所述的测定方法，其特征是所述的样品溶液在3毫克/毫升的浓度下完成变性和还原操作，然后在稀释至1毫克/毫升的浓度下，按重量比10∶1分两次加入胰蛋白酶(2毫克/毫升)在37℃酶解20小时。
13.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征是所述的反应所用的装置是带有聚丙烯材质的三通活塞的玻璃器，在振荡器上反应。
14.如权利要求1或2所述的测定方法，，其特征是洗涤所用的溶剂为DMF，CH2Cl2，CH3OH等。
15.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征是μLC-MS分析所用的条件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱，60分钟内B相3-65％。
全文摘要
本发明涉及一类含碘及同位素标记的树脂衍生物在基于质谱的蛋白组学研究中的应用。本发明所述的试剂的结构为Solid－Link－R
文档编号G01N33/68GK1563996SQ20041001766
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月14日 优先权日2004年4月14日
发明者郭寅龙, 张立 申请人:中国科学院上海有机化学研究所